土壤酶活性测定的实验步骤.docx
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土壤酶活性测定的实验步骤
土壤酶的测定
1.三角瓶用稀HNO
3(3-5%)或用洗衣粉浸泡24h,后刷洗,然后再用蒸馏水润洗,晾干。
2.土样研磨精细后分袋装好。
土量需2g+2.5g+5g+5g=14.5g,重复一次,14.5×2=29g。
一、过氧化氢酶(容量法)(关松荫P323)
1.试剂配制:
(1)0.3%过氧化氢溶液:
①(1:
10030%的H
2O
2和水)
②(0.5molH
2O
2+49.5ml蒸馏水)
③(1ml30%H
2O
2+99ml蒸馏水)
(2)3N硫酸:
(10ml硫酸+50ml水)
(3)0.1N高锰酸钾溶液:
(1.58gKMnO
4+100ml蒸馏水)
2.操作步骤:
2g风干土置100三角烧瓶→注入40ml蒸馏水和5ml0.3%过氧化氢(现配)→在往复式振荡机上振荡20min→加入5ml3N硫酸(以稳定未分解的H
2O
2)→用慢速型滤纸过滤,→吸取25ml滤液,用0.1N高锰酸钾的滴定至淡粉红色
3.结果计算
过氧化氢酶的活性(M),以20min后1g土壤的0.1NKMnO
4的毫升数表示:
M=(A-B)×T
式中:
A:
空白消耗的0.1NKMnO
4毫升数
B:
滤液消耗的0.1NKMnO
4毫升数
T:
KMnO
4滴定度的校正值
备注:
以容量法测H2O2的酶活:
Kappen
(1913)首先介绍硫酸存在下用高锰酸钾滴定剩余的过氧化氢测定酶活。
此法根据H
2O
2与土壤相互作用时,未分解的H
2O
2的数量用容量法(常用高锰酸钾滴定未分解的H
2O
2)测定H
2O
2的酶活
2KMnO
4+5H
2O
2+3H
2SO
4→2MnSO
4+K
2SO
4+8H
2O+5O2土壤H
2O
2酶促过氧化氢的分解有利于防止它对生物体的毒害作用
二、蔗糖酶(P278)滴定法
1.试剂配制:
(1)20%蔗糖:
(20g蔗糖+80ml水或12.5g蔗糖+50ml水)
(2)甲苯(分析纯)
(3)PH5.5醋酸盐-磷酸盐缓冲液
0.5ml磷酸氢二钠·12H
2磷酸二氢钾()
磷酸氢二钠·12H
2:
23.88gNa
2HPO
4,,加H
2O溶解,定容至100ml。
磷酸二氢钾():
9.072gKH
2PO
4,加H
2O溶解,定容至1000ml。
(4)33%KI溶液(4.925g+10ml水)现配,冰箱遮光
(5)H
2SO
4(1:
3)(体积比):
15ml98%H
2SO
4+45ml蒸馏水
(6)淀粉指示剂
取0.5g淀粉溶于少许水中,加10ml煮沸的2.5%NaCl液煮沸1min。
(2.5%NaCl:
2.5gNaCl加97.5ml蒸馏水。
)
(7)0.1NNaS
2O
3滴定液
取25克-----溶解于刚煮沸而冷却的蒸馏水中,加入少量的碳酸钠,稀释至1升。
(8)菲林溶液
取3.464克CuSO
4·5H
2O溶于蒸馏水,并稀释至50ml(a),取17.3g酒石酸钾钠和5gNaOH溶于蒸馏水,并稀释至50ml(b),使用前将(a)(b)按1:
1混合。
2.操作步骤
取2.5g土置于100ml三角瓶→用0.375ml甲苯处理15min。
加2.5ml20%蔗糖和
2.5mlPH5.5醋酸铅-磷酸盐缓冲液摇匀后放在37度恒温箱中培养24h。
培养结束后,加12.5ml蒸馏水。
摇荡后过滤,取5ml的滤液移入100ml三角瓶中,加2.5ml的菲林溶液,在沸水浴上放置10min,冷却至室温后,再加0.75ml33%KI溶液和1mlH
2SO
4(1:
3)。
加入淀粉指示剂2滴,然后用0.1NNaS
2O
3滴定。
颜色:
棕色→棕蓝色→乳白色(滴定结束)
注意:
减量滴定,一般取5ml即可,滴定需NaS
2O
3溶液(大量)
空白对照:
30.15ml(取5ml时)
3.结果计算:
蔗糖酶活性(M),用对照与试验的0.1NNaS
2O
3滴定量毫升数之差表示。
试验应设以水20毫升代替基质。
M=(A-B)×T×
式中:
A:
对照所消耗的0.1NNaS
2O
3毫升数
B:
滤液所消耗的0.1NNaS
2O
3毫升数
T:
NaS
2O
3滴定度的校正值
×:
换算成1g土消耗的0.1NNaS
2O
3量
三、脲酶
1.试剂配制
(1)PH=6.7柠檬酸盐缓冲液
取3.68g柠檬酸溶液于6ml蒸馏水中,另取2.95g氢氧化钾溶于水,再将两种溶液合并,用1N氢氧化钠将PH调至6.7,并将水稀释至20ml。
(2)苯酚钠溶液
称62.5g苯酚溶于少量乙醇中,加2ml甲醇和18.5ml丙酮,然后用乙醇稀释至100ml(A液),存于冰箱中。
称27gNaOH溶于100ml水中(B液),存于冰箱中。
使用前,取A,B两液各20ml混合,并用蒸馏水稀释至100ml备用。
(3)次氯酸钠溶液
用水稀释制剂,至活性氯的浓度为0.9%,溶液稳定。
(17.3mlNaClO定容至100ml)。
(4)10%尿素液
10g尿素+90ml水
50g尿素+450ml水
(5)甲苯
(6)氮的标准溶液(不要配)
精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml,则得1ml含0.1mg氮的标准液。
绘制氮的标准曲线时,可将此液稀释10倍供用。
2.操作步骤
取5g风干土,至于50ml三角瓶中,加1ml甲苯。
15min加10ml10%尿素液和20mlPH6.7柠檬酸缓冲液。
摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。
过滤后取3ml滤液注入50ml锥形瓶中,然后加蒸馏水20ml,再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液,边加边摇匀。
20min后显色,定容50ml:
1h内在分光光度计上于波长578nm处比色。
然后按绘制标准曲线(显色方法)进行比色测定。
3.结果计算:
脲酶活性(M)以24h后1g土壤中NH
3-N的毫克数表示
M=x×
标准曲线:
y=0.0268x+0.001804
即:
M=(0.001804-y)×
式中:
x:
从标准曲线查得的NH
3-N毫克数
y:
578nm处吸光度
×:
换算成1g土的系数
四、磷酸酶
1.试剂配制
(1)PH=9.8氯化铵-氢氧化钠缓冲液
取20gNaOH溶于100mlNH
4OH中
(2)8%铁氰化钾液
称8g铁氰化钾,溶于蒸馏水中稀释至100ml(仅在同一周内存放)
(3)2%4-氨基安替比林液
取1g4-氨基安替比林溶于水中,稀释至50ml(仅在同一周内存放)
(4)0.5%磷酸苯二钠溶液
取1g溶于200ml水中
(5)酚的标准溶液(不要配)
酚原溶液的配制及酚工作液的稀释浓度同磷酸苯二钠法
酚原液:
取1g重蒸酚溶于水中,稀释至1L存于棕色瓶中
酚工作液:
取10ml酚原液稀释至1L(0.01mg/ml酚)
(6)甲苯
标准曲线绘制
吸取1,3,5,7,9,11,13ml酚工作液,分置50ml的容量瓶中,分别加20ml蒸馏水,再加0.25ml缓冲液,0.5ml4-氨基安替比林液,0.5ml铁氰化钾液,每次充分摇动。
最后定容至50ml,15min内在分光光度计上于波长510nm处比色。
根据光密度值于溶液浓度绘制标准曲线。
50-(20+2+0.5+0.5+0.25)=26.75ml蒸馏水
2.操作步骤
取5g风干土,至于50ml三角瓶中,加5滴甲苯。
20ml0.5%磷酸苯二钠,充分振荡后在37℃恒温箱中培养2h。
取培养后滤液5ml,分置50ml的锥形瓶中,加20ml蒸馏水,再加0.25ml缓冲液,0.5ml4-氨基安替比林液,0.5ml铁氰化钾液,每次充分摇动。
最后定容至50ml,15min内在分光光度计上于波长510nm处比色。
3.计算
磷酸酶的活性(M),以2h后100g土壤中P
2O
5的毫克数表示
M=x×80×0.32×2.29
标准曲线:
y=0.002161x-0.000839
即:
M=(y+0.000839)×80×0.32×
式中:
x:
从标准曲线查得5ml滤液中酚的完整数
y:
510nm处吸光度
80:
换算为100g土壤的余数
0.32:
在磷酸苯二钠中,1个重量单位的酚相当于0.32g重量单位的磷
2.29:
将P换算为P
2O
5的系数