实用文档之湖南大学生物信息学实验报告.docx
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实用文档之湖南大学生物信息学实验报告
实用文档之"实验七PCR引物设计及评价"
1基本信息:
姓名:
程瑶学号:
201378020205
班级:
医学1301实验日期:
2016-05-24
2实验目的和要求:
1)掌握引物设计的基本要求,并熟悉使用Primerpremier5.0软件进行引物搜索;
2)掌握使用软件oligo6.0对设计的引物进行评价分析。
3实验仪器、设备与材料:
计算机(联网)
4实验原理:
1)引物设计原则:
A:
引物应在序列的保守区域设计并具有特异性;
B:
引物的长度一般为15-30bp;
C:
引物不应形成二级结构;
D:
引物序列的GC含量一般为40-60%;
E:
引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右最佳;
F:
引物序列自身或者引物之间不能在出现3个以上的连续碱基;
G:
引物3’端不可修饰;
H:
引物3'端G值较低(绝对值不超过9),而5’端和中间G值相对较高。
2)引物设计软件Primerpremier5.0及Oligo6.0:
Primerpremier5.0:
“Premier”的主要功能分四大块,其中有三种功能比较常用,即引物设计、限制性内切酶位点分析和DNA基元(motif)查找。
“Premier”可以针对模板DNA的来源以相应的遗传密码规则转换DNA和氨基酸序列,软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择。
Oligo6.0:
Oligo6.0的界面是三个图,Tm图、ΔG图和Frq图。
“Oligo”的功能比“Premier”还要单一,就是引物设计。
但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。
所以引物设计的最佳搭配是“Premier”进行引物搜索“Oligo”对引物分析评价。
5实验内容:
1)使用Primerpremier5.0软件进行人瘦素(leptin)mRNA引物的设计;
2)使用oligo6.0对引物进行评价分析;
3)使用blast工具帮助设计引物和评估引物特异性;
6实验步骤:
略~~~
7作业:
提交使用Primerpremier5.0及Oligo7.37软件进行人肉素(leptin)mRNA引物的设计结果:
1)使用引物设计软件Primerpremier5.0进行人瘦素(leptin)mRNA引物搜索结果截图。
(包括Sense链和Anti-sense链截图):
A:
先把leptin的序列输入到Primer中:
然后进入primer:
然后点击search,可修改部分数据去得到你想要设计的引物:
得到search的结果,分三种:
sense、anti-sense、pair:
↑Sense
↑Anti-sense
↑Pair
因为pair是综合sense和anti-sense的结果,所以我在pair中选择引物:
根据引物设计的原则,如sense链和anti-sense链的Tm值相差不能过大,GC含量要在40%-60%之间,hairpin、dimer和falsepriming要尽量少的found等,我选择第二条引物,即2672-2968:
其sense链为:
其anti-sense链为:
2)oligo6.0分析此对引物的结果。
(包括Duplexformation、Hairpinformation、FalsePrimingSites截图):
A:
首先呢~要把leptin的序列输入到Oligo中去,并把之前从Primerpremier5.0中所得到的引物在Oligo中表示出来:
即这段:
然后进行分析,我在analyse中进行了4种分析,分别是Duplexformation、Hairpinformation、Composition&Tm、FalsePrimingSites:
A:
Duplexformation
B:
Hairpinformation
C:
Composition&Tm
D:
FalsePrimingSites
从上面4种分析可见:
①在5’和3’的引物中,有4个碱基位点可以互补,可以配对形成双链。
但无形成环状的配对位点;
②无发夹结构;
③Oligo所分析出的Tm值与primer引物设计出的Tm值有差异;
④正义链有三个假启动位点,反义链有5个假启动位点。
总结可知,该引物无发夹结构,但是会有双链形成的和数个假启动位点的可能,所以并不是多么完美的引物。
但相比较其他几条引物来说,这条是最好的~
3)综合Primerpremier5.0与oligo6的引物设计结果为:
A:
sense:
5’-GTAGAGTTTGAAGGAGGTGA-3’(20bp)
antisense:
5’-CAGCCTGATTAGGTGGTT-3’(18bp)
8思考题:
1)怎么设计引物把上面提到的leptin的全长拉出来?
A:
老师,说实话,我还是没完全理解你说的拉出全长,我就按我的理解来了……
首先,进入primer:
可见一开始时引物为1-25,sense链和anti-sense链都是25个碱基;
因为sense链已经是从1开始了,所以我只需要调节anti-sense链即可;
先点击primer处的A,然后调节下方滑动到最后区域,用鼠标将anti-sense链的5’端移到3444的位置,这样就把leptin的全长拉出来了:
其实一开始,我不想来这么简单粗暴的方法……
所以我想在search中修改数据来得到全长的引物,如下图:
然后结果是酱紫滴~~~
没办法,我只能作罢,选择第一种那样简单粗暴的方法……
2)请比较芯片设计与引物设计的异同。
A:
因为基因芯片探针和PCR引物都是通过配对来形成双链的,而且基因芯片的探针也是通过PCR来扩增的,所以PCR引物的设计原则基本上也是基因芯片的探针的设计原则,如下:
①产物的特异性;
②产物的长度一般为15-30bp,产物中G、C序列的GC含量一般为40-60%,并且不能在出现3个以上的连续碱基;
③避开产物的二级结构区,不能形成双链和发夹结构;
④产物的3'端不能修饰,而5'端可以修饰;
但是PCR引物只有一条双链,即只有sense链和anti-sense链两条引物;而基因芯片的探针有成千上万种,所以基因芯片的探针设计还需要考虑到下列因素:
①探针序列的互补序列在所有基因序列中必须是唯一的;
②探针序列的任一长度为15的子序列在整个基因组中必须是唯一的;
③探针序列不能自杂交,即探针序列中的互补片段的长度不能超过探针长度的30%。