病毒及其疫苗的生产制备核心技术.docx

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病毒及其疫苗的生产制备核心技术

第25章病毒及其疫苗生产制备技术

第一节病毒生产制备

病毒需在活敏感细胞中才干增殖，在细胞培养技术不成熟之前，人们为研究病毒，往往采用鸡胚接种或动物接种办法来分离、鉴定病毒或制备一定量病毒液，但这种办法因个体和种属差别，不但许多病毒难以找到适当敏感动物，并且虽然在敏感动物中繁殖，往往个体差别大而影响成果鉴定，随着细胞培养技术发展，一方面在病毒学研究方面获得了广泛应用，为病毒繁殖、鉴定提供了来自不同动物（涉及人）、不同组织细胞来源，通过敏感性筛选，当前绝大多数病毒均可有相应敏感细胞，为病毒分离、鉴定和增殖创造了条件。

同步也为病毒大量生产提供了细胞来源，随着细胞大量生产技术发展，因而对病毒来说只要有敏感细胞，就可以进行大规模生产。

一、病毒生产目和用途

1、为了制备大量病毒抗原，以制备病毒亚单位疫苗或表面抗原疫苗，或用病毒抗原制备免疫血清（抗体）。

2、为了制备病毒减毒活疫苗或灭活死疫苗，以用于防止接种。

3、为了生产基因改造后或重组有其他多肽因子病毒，以用于基因治疗或杀肿瘤治疗及基因疫苗防止接种。

4、为了制备干扰素病毒诱生剂（NDV、仙台病毒等），用于干扰素生产。

5、生物战用病毒生物战剂。

常选用毒力强、抵抗力强、对不同国家人群最敏感病毒，又能通过气溶胶或昆虫和污染水土进行传播病毒。

这是战争狂们正在开展研究，应警惕。

二、病毒生产制备办法

1、动物接种，如狂犬病毒、脑炎虫媒病毒采用鼠、兔脑内接种后收取脑组织制成悬液。

2、鸡胚、鸭胚接种：

如流感病毒、副流感病毒（NDV-F）、仙台病毒等，当前尚无敏感细胞，常采用9～10日胚龄尿囊腔接种，37℃孵育72小时收获尿液，用鸡红血球测定血凝效价。

Q热用7日龄鸭胚进行卵黄囊接种收获卵黄囊，马脑炎病毒常采用10日龄鸡胚体接种，收获全胚体液等。

3、细胞培养法（详见第二篇第18章）

不同病毒选用相应敏感细胞，采用转瓶培养、多层培养、微载体培养或悬浮搅拌培养等办法,先大量增殖细胞，然后接种一定量病毒,继续培养恰当时间时，冻融细胞后，离心收获上清。

以上病毒大量生产后可制作病毒疫苗（死疫苗或减毒活疫苗），也可用来作干扰素诱生剂或提取病毒表面抗原成分，但反对用作生物战剂，危害人类健康和生命。

第二节病毒疫苗生产制备

病毒疫苗生产制备与病毒生产制备基本相似，目迈进行人工积极免疫，用于病毒病防止疫苗有灭活疫苗（KilledVaccine）,又称死疫苗，减毒活疫苗（LiveVaccine）,亚单位疫苗，多肽疫苗、基因缺失减毒活疫苗，基因工程亚单位疫苗，重组牛痘多价疫苗。

一、病毒疫苗种类

（一）灭活疫苗：

当前惯用有流行性乙型脑炎疫苗，狂犬病疫苗（二倍体细胞与地鼠肾细胞可用于生产狂犬病病毒固定毒灭活疫苗），流感灭活疫苗。

惯用甲醛为灭活剂，以灭活病毒核酸而不影响其抗原性。

（二）减毒活疫苗，普通采用自然法或人工法，通过动物传代或细胞传代筛选对人毒力低变异株病毒。

惯用有脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗、流感温度敏感突变株疫苗、流行性腮腺炎疫苗、风疹疫苗、黄热病疫苗以及某些联合疫苗（如麻疹、腮腺炎、风疹联合疫苗）。

（三）亚单位疫苗：

用化学试剂裂解病毒，提取包膜或衣壳上亚单位，除去其核酸，以此制成疫苗称亚单位疫苗。

如流感病毒包膜提取后制成血凝素和神经氨酸酶亚单位疫苗。

（四）多肽疫苗：

采用乙肝携带者血提取HBsAg乙型肝炎疫苗或采用基因工程法制备HBsAg基因表达产物制备疫苗。

（五）基因缺失减毒活疫苗：

在病毒基因组中，使其有毒力有关基因发生缺失而制成减毒活疫苗称基因缺失减毒活疫苗，如狂犬病毒胸苷激酶（TK）缺失株（第一代）和gp3区缺失株（第二代），单纯疱疹病毒α22基因缺失株，当前有待进一步研究。

（六）基因工程亚单位疫苗：

将病毒表面抗原基因，通过基因重组，在酵母或CHO细胞中进行表达亚单位多肽抗原成分而制成疫苗，称基因工程亚单位疫苗，如乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg基因在酵母和CHO细胞中表达而提取获得纯品HBsAg多肽。

即将上市。

（七）重组牛痘多价活疫苗。

以牛痘苗为载体来表达数十种外源性病毒抗原基因，如：

HAV、HBV、麻疹病毒、I型和II型HSV、EBV，狂犬病毒等抗原基因，经基因重组后而制成牛痘苗病毒，经一次划痕接种可使机体同步能获得对各种病毒免疫力，大大减少了接种次数。

此外腺病毒和脊髓灰质炎病毒活疫苗也可作为载体与轮状病毒抗原基因重组后活疫苗，经口服后可同步获得两种病毒免疫力，有待于进一步研究、开发。

上述病毒疫苗有是采用细胞培养技术和细胞工程来进行生产制备，现将采用细胞工程制备病毒疫苗种类和敏感细胞以及生产方式规于下表。

二、细胞培养法制备惯用疫苗（如表25-1）。

表25-1采用细胞培养法生产惯用病毒疫苗

疫苗

制备疫苗

细胞

培养办法

名称

活/死（疫苗株）

脊髓灰

灭活（Salk株）

猴肾细胞（原代/2-3代）

转瓶培养

质炎疫苗

活（Sabin株）

Vero细胞

微载体培养

腮腺炎

活（ME株）

幼地鼠、狗肾

转瓶培养

疫苗

豚鼠肾细胞

罗氏瓶培养

麻疹活疫苗

Edomonste、

L16、沪191、

Moraten、

Schwar2株

原代鸡胚纤维母

细胞，人二倍体

人羊膜、狗肾、羊肾

豚鼠肾细胞

罗氏瓶培养

转瓶培养

单纯疮疹

死（72株）

兔肾、豚鼠肾

罗氏瓶培养

病毒疫苗

豚鼠胚成纤维细胞

转瓶培养

巨细胞病毒疫苗

活（Towne株）

WI-38人胚肺细胞

转瓶培养

狂犬病毒疫苗

死（AV01/AV02株）

（CUS株）

人二倍体细胞

微载体培养

流行性乙型

脑炎疫苗

灭活（5-3株）

人二倍体细胞

多层滋养增殖器

森林脑炎

病毒疫苗

灭活

鸡胚纤维母细胞

幼地鼠肾细胞

转瓶培养

三、用细胞培养制备病毒疫苗长处：

病毒疫苗制备开始多用动物脏器、禽类胚胎（第一代疫苗）。

然而因来源困难，很不经济，制作麻烦，数量受限，更危险是这些组织中间也许具有潜在致癌病毒和慢性病毒，后改用原代细胞来制作疫苗（第二代疫苗），如麻疹疫苗、乙脑疫苗等，随着细胞培养发展，特别是自70年代后国内二倍体细胞株相继建立，为疫苗生产创造了极为有利基本，这比用原代细胞制备疫苗更优越。

如：

（1）在细胞传代期间可进行比较全面检查，特别是对潜在病毒和致癌性检查，保证安全。

（2）可使逐渐适应于无血清（或无蛋白）培基中生产繁殖，以排除过敏因素。

（3）可挑选对病毒敏感细胞克隆。

以利病毒在细胞中大量增殖，有助于疫苗产量提高。

（4）易于大量生产和进行持续自动化工业生产，以满足量需求。

国外已建立二倍体细胞WI-38、MRC-5、IMR-90等，国内已建立KMB-17、2BS、SL-7等均已用于疫苗生产，如麻疹活疫苗、乙型脑炎疫苗、脊髓灰质炎疫苗、腮腺炎疫苗等，从当前发展来看，用二倍体细胞制备疫苗将有取代其她原代细胞和传代细胞趋势，但当前仍有某些病毒疫苗制备还需用原代细胞，近年来有人主张用肿瘤细胞制备人用灭活疫苗。

四、提高疫苗效力常采用办法：

（1）细胞药物解决：

用某些药物解决细胞后可以刺激病毒繁殖（如下表），其办法为：

在细胞形成单层后，用某些化学药物来解决，然后洗去，再接种病毒，就可使病毒提前成熟，产量高，现列表如下：

解决细胞药物

刺激病毒

5-碘-2-脱氧尿核甙

风疹、腺病毒、巨细胞病SV-40

维生素A或Tween-80

脊髓灰质炎病毒、滤泡性口腔炎病毒

胆固醇或卵磷质

脊髓灰质炎病毒

DEAE-dextran

脊髓灰质炎病毒、风疹痘类病毒，付流感病毒

胰酶

痘类病毒、呼吸道肠道病毒，流感病毒、鼻病毒

二甲亚砜

脊髓灰质炎病毒、流感、疱疹病毒

放线菌素D

麻疹、脊髓灰质炎病毒、付流感病毒

（2）在维持液中补充某些物质也有助于某些病毒复制、列表如下：

增加药物

刺激病毒

Tween-80或油酸钠

乙型脑炎

谷氨酰胺

麻疹、脊髓灰质炎病毒、仙台病毒

精氨酸

痘类病毒、疱疹病毒

脯氨酸、赖氨酸

乙型脑炎

（3）毒种选取：

通过空斑挑选产量高大空斑毒株，精制毒种可提高病毒产量。

（4）病毒液浓缩：

经浓缩后，病毒浓度增高，从而效价也随之上升。

五、影响疫苗质量因素：

（1）毒种：

毒种优劣不但影响疫苗产量，并且也影响疫苗质量，毒种不纯会产生互相干扰，减毒活疫苗毒种若毒力回升易导致事故，因而毒种选取应挑选那些致病性低，免疫效价高而持久，抗原谱广，易增殖，便于生产，可在传代细胞上传代毒种。

（2）培养病毒细胞：

细胞若有潜在致癌性病毒或慢病毒，以及有支原体污染均不能用作疫苗生产。

对此因素应严格检查。

此外若细胞自身发生转化后，不适当于制备活疫苗，只能制备某些灭活疫苗或亚单位疫苗。

（3）培养液：

培养细胞营养液中多少具有一定量血清蛋白，在疫苗使用中常会浮现某种限度过敏反映，为此，应尽量使细胞适应于无血清蛋白培养基中，以消除过敏源。

（4）甲醛灭活剂使用：

甲醛能使病毒灭活，但仍保持其抗原性，因而普遍用来制备灭活病毒疫苗，但要控制含量。

病毒被灭活限度与灭活温度和甲醛浓度等因素有密切关系。

普通用热灭活办法，采用在37℃灭活一定期间。

经热灭活疫苗，不但其免疫原性、免疫效力和稳定性不受影响，并且灭活病毒温度提高后来，灭活时间相对可以缩短，灭活剂用量也可以减少。

甲醛能刺激局部而引起疼痛和红肿，并有释放组织胺作用。

因而制备疫苗时减少甲醛浓度是必要。

如果疫苗内游离甲醛含量减少到一定限度后，可考虑不需再用亚硫酸氢钠来中和甲醛。

这对减少注射后疼痛及便于推广防止接种有重要意义。

六、生产病毒和制备病毒疫苗惯用办法

（一）制备工艺流程

（1）脊髓灰质炎病毒活疫苗制备工艺

猴肾细胞培养

←接种病毒（测0%正常细胞对照）

收获病毒，合并，加MgCl2→

无菌实验→

←猴病毒检查（获肾细胞）（SV40）

B病毒检查（兔肾细胞）→

←病毒效价滴定

←合并，过滤加MgCl2

←无菌实验

分亚批→

←柯萨奇病毒检查（乳鼠）

病毒滴定→

←型特异性检查

B病毒复检（家兔）→

←T特性实验

分装病毒滴定→

←猴体残存致麻痹力实验

（安全实验）病理切片

结核杆菌检查→

分装→

←无菌实验

病毒滴定→

→

保存于-20℃待检定合格后

加工糖丸

脊髓灰质炎活疫菌工艺流程

2、流行性乙型脑炎病毒死疫苗制备工艺

地鼠肾

剪碎，胰酶消化

地鼠肾细胞悬液

37℃,3天细胞培养液，pH7.0～pH7.2

单层细胞

洗涤细胞，去除牛血清

10-4～10-5浓度病毒感染细胞

32～34℃培养2～3天

收获病毒液（收二次）

按1:

加入甲醛

22℃，8天

灭活病毒液

合并，安全及效力实验

原液

加入亚硫酸氨钠

半成品

分装

成品

检定（涉及理化性质，无菌实验、安全实验，

防腐剂、试剂及残存牛血清含量等）

合格成品

（二）生产办法：

病毒和病毒疫苗生产办法基本相似，其规模取决于细胞生产规模，因而上述简介细胞大量生产办法和工艺均可用来生产病毒和病毒疫苗，可依照需要及适当生产条件来选用培养装置，如转瓶培养，因设备简朴，便于生产单位采用。

而多层培养，微载体培养，当前国外已用于生产，国内仍在研究中。

悬浮搅拌培养简易装置已应用于疫苗生产，全自动悬浮发酵罐，在干扰素生产中有应用，但在疫苗生产中正在试用，下面着重简介微载体培养法生产病毒技术。

1、微载体悬浮培养细胞病毒生产工艺

作者选VSV病毒来接种经微载体培养敏感细胞，病毒效价测定用A549细胞（也可用Wish或Hep-2细胞或鸡胚纤维母细胞测TCID50），病毒效价为6LogTCID50/mL，用鸡胚细胞空斑法测定普通为107Pfu/mL。

①VSV在方瓶贴壁细胞中增殖（100mL方瓶，10mL培养基）待BHK21、BHK13、CHO-K1细胞长满单层，弃上清加入10-2VSV病毒悬液0.2ml，37℃吸附1小时，加病毒维持液培养20小时，于-30℃冻存，待测效价。

②VSV在微载体悬液培养细胞中增殖。

微载体培养BHK21或BHK13、或CHO-K1细胞，

3～4天后细胞密度已达1×106细胞/mL

静置30分钟

尽量吸去原培养基

37℃

将10-2VSV病毒按50mL培养体积加入1mL病毒液于微载体细胞中

37℃50r/min搅拌5分钟

静置吸附1小时（每20分钟搅拌2分钟）

加入病毒维持液至原体积

37℃继续搅拌培养20小时

于-30℃冻融后

r/min低温离心10分钟

收集上清，即为VSV增殖病毒液，分装冻存，待测效价

成果，在微载体悬浮培养三株细胞所繁殖VSV病毒不但产量大，并且病毒效价平均高1LogTCID50，尤以CHO-K1效价最高，平均可达7.75logTCID50比原先毒种效价还要高1.75LogTCID50，又起到了提高病毒效价作用。

此办法也可应用于生产病毒疫苗，只要疫苗株病毒敏感细胞能在微载体上大量生产。

若疫苗株是减毒活疫苗株，此法生产病毒可直接制备活疫苗。

若疫苗株为非减毒活疫苗株，此法生产病毒可用甲醛灭活法制备死疫苗。

2、转瓶培养法

此法是当前各大生物制品研究所惯用于生产疫毒疫苗办法，如生产脊髓灰质炎病毒疫苗，麻疹疫苗等。

将细胞制备成悬液后，在温室内（37℃）使支架以8～12转/小时缓慢转动，以使细胞贴壁，当加入病毒后，待细胞浮现+++以上细胞病理性变化（CPE）时，标志病毒已大量繁殖，此时收获病毒，按生物制品程序加工成疫苗。

3、罗式瓶培养

将许多大罗氏瓶，在净化室内，把制备好细胞悬液人工加入瓶内，100mL/瓶，在温室内货架上一排排放置，进行静置贴壁培养，待细胞呈单层后，倒去旧液，加含病毒疫苗株和维持液，继续静置培养，每天观测细胞和记录温室温度，待细胞有明显CPE产生时，收获病毒液，然后按疫苗生产加工工艺制成疫苗。

以上2、3两种办法是国内各大生物制品所常规办法，由于制品工艺规定，当前依然采用，但正在不断改进和采用新工艺、新办法和高技术来生产疫苗。