传染病的细菌鉴定实验报告.docx

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传染病的细菌鉴定实验报告

`实验三、细菌的分离鉴定

虞加丽

一、实验目的：

1.通过从禽类病变器官中分离纯化菌株，掌握培养基的制备与灭菌技术、微生物的筛选、分离纯化方法和无菌操作技术。

2.复习以前学过的各种染色方法，掌握生化试验和药敏试验的原理与方法。

3.掌握微生物的鉴定技术、菌种保藏技术。

二、实验原理：

1.微生物的分离与纯化：

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

此次实验采取平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理主要包括两个方面：

a.选择适合于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰大部分不需要的微生物。

b.微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。

获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板法或平板划线法等技术来完成。

微生物的观察可以用显微镜观察其细胞形态，也可以用肉眼观察其菌落形态。

前者是微生物的显微镜观察技术，后者是微生物的肉眼观察技术。

2.平板划线法：

平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。

有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。

其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。

3.革兰氏染色：

G+、G-细菌的细胞壁成分和结构不同。

G+的细胞壁主要有肽聚糖形成的网状结构组成，在染色过程中，当用95%乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，细胞壁通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞壁内而不易脱色，因此呈蓝紫色。

G-的细胞壁中肽聚糖含量低，脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物容易被乙醇抽提出来而脱色，然后又被染上了复染剂的颜色，因此呈现红色。

4.微生物的生理生化反应原理：

在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢。

代谢过程主要是酶促反应过程。

许多细菌产生胞外酶，这些酶从细胞中释放出来，以催化细胞外的化学反应。

各种细菌由于具有不同的酶系统，致使它们能利用不同的底物，或虽然可以利用相同的底物，却产生不同的代谢产物，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别细菌。

5.药敏试验原理：

将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。

纸片中所含有的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。

在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。

抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。

并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关关系，即抑菌圈愈大，MIC愈小。

6.试管凝集试验原理：

在试管内颗粒性抗原直接与抗体结合，在电解质的作用下，出现肉眼可见的凝集现象。

三、实验材料与方法：

1.病鸡剖解：

解剖盘，解剖剪，标记笔

2.病料采集

3.无菌接种：

LB血琼脂平板，酒精灯，火柴，接种环，酒精棉球或刀片

血平板划线：

单菌落技术，强调无菌，标记平板，导致培养过夜。

4.美兰染色：

美蓝染液，显微镜，擦镜纸，废液缸，洗瓶，载玻片，接种环，酒精灯，生理盐水，组织抹片（肝）、美兰染色、镜检

5.动物实验：

小白鼠，生理盐水，Ep管，空白培养皿，一次性注射器

病料破碎后加生理盐水制成悬液（1:

5），接种0.2ml/只,死亡后剖解并观察病变并记录。

6.病死鸭剖解

7.鉴别培养基：

LB普通琼脂平板，麦康凯培养基，接种环，酒精灯

病料接种过夜培养物

8.革兰氏染色

9.试管凝集试验：

阳性血清，生理盐水，分装生理盐水的小试管

10.生化试验：

生化反应管：

葡萄糖，半乳糖，果糖，麦芽糖，甘露醇，鼠李糖，蔗糖，吲哚

11.药敏试验

药敏片，氨苄青霉素，卡那霉素，诺氟沙星，磺胺异恶唑，强力霉素，头孢曲松

四、实验结果：

1.病鸡剖检

外观症状：

脱毛，歪脖，鸡冠泛白，角弓反张，无下痢

器官病变：

心包有积液，啤酒样，肝脏上有白色针尖灶，脾脏肿大呈黑紫色，肾脏肿大，食管有大量黄色粘液，肺脏上有明显的黄白色坏死灶，器官上有出血点，肠道出血。

2.美兰染色镜检

镜检，呈红色，为革兰氏阴性菌

3.病鼠剖解

全身性出血，肝肾肿大。

4.病鸭剖解

有纤维素性渗出物附着在心脏上，肝脏肿大出血，心包有白色积液，脱肛，花斑肾。

5.试管凝集试验：

未产生凝集现象

6.生化试验

果糖、鼠李糖颜色未变化，葡萄糖、蔗糖呈黄色，半乳糖、麦芽糖呈浅黄绿色，甘露醇由上到下呈浅绿色至蓝紫色。

吲哚试纸无变化，呈阴性反应

。

7.药敏试验结果

抑菌圈半径：

卡那霉素：

1.7cm;强力霉素：

0.93cm；头孢曲松：

1.0cm；氨苄西林：

0.3cm;磺胺异恶唑：

0.3cm；诺氟沙星：

1.6cm

五、分析与讨论

1.微生物学工作必须在一个清洁卫生的环境中进行，实验室的整洁与否直接影响实验效果。

在卫生状况差而零乱的实验室中不可能取得好的实验效果；实验室脏、乱，不但增加了污染的机会，同时也影响人的安全和情绪，所以，清洁、明亮的实验环境是顺利开展工作的保障之一；保持实验室清洁是学生进入实验应尽的责任。

2.分离培养前应考虑所分离的细菌的特性，选择适合其生长需要的培养基（需氧还是厌氧、营养的要求高还是不高、培养温度等）等。

例如：

链球菌在普通琼脂不长，要加血清或血液。

大肠杆菌和葡萄球菌要求较低，普通的培养基即可生长。

3.防止污染。

分离培养的整个过程要严格无菌操作。

培养基和一切用具必须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰；操作完毕后，禁止再让培养基接触外界空气。

4.防止接种器械过热，很容易杀死分离培养的细菌，如接种环在烧灼灭菌后，不能立即钓取细菌材料，应在酒精灯旁凉凉；另外还应注意防止已钓取菌料的接种环，不慎通过火焰而将细菌杀死。

5.初代分离时发现有多种细菌，观察找到目的菌落，再拿一肉汤培养基纯化培养。

然后在接种实验动物，作成凝集抗原，做血清学鉴定，。

还可以反过来做抹片染色观察。