防腐挑战实验.docx

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防腐挑战实验

防腐挑战实验

第一部分防腐挑战实验调研结果

1实验样品

样本要求新鲜，没有被微生物污染，一般每个样本为300g。

2微生物挑战性实验

2.1实验菌株

不同国家、组织、企业对挑战实验选择的测试菌种有一定差异（如表1），国内参照美国化妆品、香精和洗涤剂协会（CTFA）推荐的菌种（因其较具代表性，如表2所示），所以更为恰当。

（注意菌株来源问题：

同属一个种的细菌来源不同，菌株不同，MIC值不同）

表1某些国家、组织、企业用于化妆品微生物挑战试验的测试菌株

菌株

美国

（药典）

美国

（ISP公司）

英国

（药典）

德国

（Henkel公司）

德国

（S&M公司）

白假丝酵母

√

√

√

√

√

黑曲霉

√

√

√

√

√

红色青霉

√

绿色木霉

√

绳状青霉

√

大肠埃希氏菌

√

√

√

√

镉绿假单胞菌

√

√

√

√

金黄色葡萄球菌

√

√

√

√

√

粪肠球菌

√

产气肠杆菌

√

表皮葡萄球菌

√

日勾维肠杆菌

√

洋葱假单胞菌

√

√

肺炎克雷伯氏菌

√

恶臭假单胞菌

√

荧光假单胞菌

√

表2CTFA化妆品微生物挑战试验的菌株选择

种类

菌株

数量

革兰氏阳性菌

金黄色葡萄球菌

至少选一种

表皮葡萄球菌

发酵革兰氏阴性杆菌

肺炎克雷伯氏菌

至少选两种

阴沟肠杆菌

大肠埃希氏菌

变形菌属

日勾维肠杆菌

非发酵革兰氏阴性杆菌

铜绿假单胞菌

至少选一种

洋葱假单胞菌

荧光假单胞菌

恶臭假单胞菌

黄杆菌属

不动杆菌属

菌总数确定细菌数。

（3）霉菌菌悬液的配制

将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10倍稀释，每次的稀释用血球计数板计数，必须5个中格的霉菌总数在190～210，落在此范围内的菌悬液为我们所需的1×108cfu/ml的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数。

2.4接种

2.4.1接种方式

（1）单菌接种：

每种测试菌株单独做一个挑战试验。

这种方法的优点是容易了解每种微生物对防腐体系的敏感性，在筛选产品的防腐体系时有较好的参考价值，但工作量大、费时、费工，和产品的实际污染菌情况也有差距（因来自自然界的微生物常常不是单一的种类）。

（2）混合菌接种：

西欧、德国等的许多国家和企业多采用这种方式，除了因工作量相对较小外，这种接种方法更能代表污染的状况。

2.4.2接种次数和时间

（1）一次接种：

只是在试验开始时接种一次，整个试验周期28天。

（一次加菌的28天微生物挑战实验）

（2）多次接种：

在试验开始接种一次后（重复加菌的微生物挑战实验）

a法：

第21天再接种一次，试验周期为28天。

（有实验表明，第21天接菌和不接菌时，第28天时的微生物含量并无显著的差别，评定结果也相同）

b法：

每隔两周接种一下，连续三次（即第1、3、5周接菌，每两周接菌前分离一次），试验周期为49天；

c法：

每周接种一次，连续5次，试验周期为35天。

（S&M公司的资料介绍，采用此种方法评价认可的防腐体系，可保证产品30个月内的防腐安全）

2.4.3操作方法

称取待测样品30g，对应加入0.3ml浓度为1×107～1×108cfu/ml的细菌悬液及霉菌悬液，用干净的无菌勺子搅拌均匀后盖上保鲜膜，细菌在32.5±2.5℃的培养箱中培养，霉菌在22.5±2.5℃的培养箱中培养。

a.水溶性样品

10g加入90ml无菌生理盐水，稀释后取1ml样品液，加入9ml灭菌生理盐水中，做依次稀释，分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等稀释度；取三个合适稀释度的样液，分别吸取1ml样液加入已灭菌的平皿中，做菌落计数，并做两个平行。

b.油溶性样品

取10g样品，加入10ml无菌吐温-80和10ml无菌白矿油，再加70ml无菌生理盐水，用无菌玻棒充分混匀；

吸取1ml已稀释的样品液，加入9ml灭菌生理盐水中，做依次稀释，分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等稀释度；取三个合适稀释度的样液，分别吸取1ml加入已灭菌的平皿中，做菌落计数，并做两个平行。

2.5培养

细菌放在32.5±2.5℃的培养箱中培养；

霉菌在22.5±2.5℃的培养箱中培养；

混合菌在28℃的培养箱中培养。

2.6菌落计数

分别在0、7、14、21、28天分离计算样品中活的细菌、霉菌；每次计算完细菌总数、霉菌总数后将平皿放回培养箱，以待下次观察用，观察中切勿打开平皿，以免燃菌而使下次无法观察。

菌落计数的标准方法：

①先选取平均菌落数在30～300之间的平皿作为细菌菌落总数测定范围，选取平均菌落数在5～50之间的平皿作为霉菌菌落总数测定范围；

②有两个稀释度在30～300之间，求比值。

若比值≤2，报告平均数；若比值>2，以其中较小的稀释度计算细菌总数；

③所有稀释度都大于300，以稀释度最高的平均菌落数计算；

④所有稀释度都小于30，以稀释度最低的平均菌落数计算；

⑤所有稀释度均在30～300之外，其中一个大于300，而相邻的加一稀释度小于30，则以最接近30或300的平均菌落数计算；

⑥若平皿中有连成片状或花点样菌落蔓延生长时，不宜计算；

⑦若片状菌落不到平皿中的一半，而另一半中菌落均匀，则可将此平皿菌落计数后×2，以报告全皿菌落数。

2.7评价标准

2.7.1CTFA推荐的一次加菌防腐挑战性试验及评价标准

CTFA的方法初始的霉菌和细菌的接种量分别为10000cfu/g（ml）和1000000cfu/g（ml）（CFU为菌落单位），要求在第7天时霉菌降低90%，细菌降低99.9%，并且在28天内菌数持续下降。

2.7.2美国评价标准

在CTFA评价方法的基础上提出的标准，如表3所示。

表3美国所用一次加菌的微生物防腐挑战实验评价标准

评价标准

一次加菌的28天微生物挑战实验

防腐效果优良

若单菌接种的三个平行试验中任何一种微生物数量的平均值，在第七天时下降到100cfu/g（ml）以下，第28天全部为0。

防腐效果勉强通过

若单菌接种的三个平行试验中任何一种微生物数量的平均值，在第七天时下降到1000cfu/g（ml）以下。

防腐效果无效

若单菌接种的任何一种微生物，任何一个平行样达不到上述标准，也达不到CTFA的要求。

2.7.3国内评价标准

国内参照CTFA加菌防腐挑战性评价标准。

表4国内所用微生物防腐挑战实验评价标准

评价标准

一次加菌的28天微生物挑战实验

重复加菌的微生物挑战实验

防腐效果优良（W）

第28天化妆品中存货的细菌数量<10CFU/ml，说明该样品防腐体系对细菌有较强的抑杀效果。

在三次加菌后，在每次加菌的第14天样品中存货的细菌数<100CFU/ml

防腐效果尚可（M）

第28天化妆品中存货的细菌数量<100CFU/ml，说明该样品防腐体系对细菌有一定的抑杀效果。

在三次加菌后，在每次加菌的第14天样品中存货的细菌数<1000CFU/ml

防腐效果差（P）

第28天化妆品中存货的细菌数量>100CFU/ml，说明该样品防腐体系对细菌有较差的抑杀效果。

在三次加菌后，在每次加菌的第14天样品中存货的细菌数>1000CFU/ml

第二部分实验室可采取的方案

1实验样品

2微生物挑战性实验

2.1实验菌株

金黄葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、白假丝酵母、枯草芽孢杆菌

2.2培养基

牛肉膏蛋白胨培养基

2.3试验用菌液的配置

实验前，将各菌株接种于合适的培养基中，于37℃（细菌）和28℃（霉菌）培养箱中培养。

细菌培养2天，霉菌培养5天后，挑选典型的菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌（10^8CFU/ml）和霉菌悬液（10^6CFU/ml），置于4℃冰箱储藏备用。

2.4一次加菌的28天微生物挑战实验

量取样品30ml分别加0.3ml混合菌悬液，使得细菌浓度为10^6~10^7CFU/ml，霉菌浓度为10^4~10^5CFU/ml，充分混匀。

将样品在28摄氏度下保存，在接菌0、7、14、21、28d取样品分析含菌量（培养计数法）。

2.6评价标准

评价标准

一次加菌的28天微生物挑战实验

防腐效果优良（W）

第28天化妆品中存货的细菌数量<10CFU/ml，说明该样品防腐体系对细菌有较强的抑杀效果。

防腐效果尚可（M）

第28天化妆品中存货的细菌数量<100CFU/ml，说明该样品防腐体系对细菌有一定的抑杀效果。

防腐效果差（P）

第28天化妆品中存货的细菌数量>100CFU/ml，说明该样品防腐体系对细菌有较差的抑杀效果。

附：

实验中所需的仪器和药品

设备名称

需求数量

要求

用途

1

冰箱

1

易清洁消毒

存放菌种、标准悬液

2

电子秤

1

易清洁消毒

样品重量测试

3

浊度仪

1

易清洁消毒

检测细菌菌悬液之浓度

4

无菌操作台

1

易清洁消毒

微生物实验用，要求等级10000级

5

生化培养箱

3

易清洁消毒

细菌、霉菌培养各1台；保存琼脂为液体状态及紧急烘干器皿，需用1台

6

显微镜

1

易清洁消毒

霉菌总数观测用

7

移液枪

2

100~1000uL

移取菌液用；备用

8

恒温水浴锅

1

易清洁消毒

用于油性样品之充分溶解，规格待定

9

自动灭菌锅

1

自动

物品灭菌用

10

牛角勺

100

称取样品用；备用

11

酒精灯

2

无菌操作台配套用；备用

12

200ml烧杯

10

盛装样品用；备用

13

500ml烧杯

10

盛装样品用；备用

14

150ml

三角烧瓶

10

盛装样品用；备用

15

10ml试管

100

配备塞子

盛装无菌生理盐水；备用

16

移液枪枪尖

100

移液枪配套用；备用

17

培养皿

200（套）

细菌、霉菌总数测定用；备用

18

血细胞计数板

2

霉菌计数用；备用

19

革兰氏染色

配套盒

1

革兰氏染色用

20

普通营养琼脂

10

瓶装

自配培养基用；备用

21

虎红琼脂

10

瓶装

自配培养基用；备用

22

氯化钠

2

分析纯

自配生理盐水用；备用

23

硫酸

1

分析纯

用于配置标准悬液

24

氯化钡

1

分析纯

用于配置标准悬液

25

保鲜膜

2

保存样品用；备用