一个水稻内颖退化突变体的形态特征及基因的精确定位百度概要.docx

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一个水稻内颖退化突变体的形态特征及基因的精确定位XX概要

HEREDITAS（Beijing2012年8月,34（8:

1064―1072

ISSN0253-9772

研究报告

收稿日期:

2012−05−11;修回日期:

2012−05−20

基金项目:

福建省自然科学基金项目（编号:

2011J01110,福建省农业科学院青年人才创新基金项目（编号:

2010QJ-A4,福建省农业科学院科

技创新团队建设重点科研项目（编号:

CXTD2011-12资助

作者简介:

杨德卫,硕士,助理研究员,研究方向:

水稻遗传育种。

E-mail:

dewei-y@

通讯作者:

叶新福,博士,研究员,研究方向:

水稻遗传育种。

E-mail:

yexinfu@

网络出版时间:

2012-7-1610:

34:

50

URL:

DOI:

10.3724/SP.J.1005.2012.01064

一个水稻内颖退化突变体的形态特征及基因的精确定位

杨德卫,卢礼斌,程朝平,曾美娟,郑向华,叶宁,刘成德,叶新福

福建省农业科学院水稻研究所,福州350018

摘要:

水稻产量和品质受花器官发育的直接影响,因此对水稻颖花发育机理的研究将有助于水稻产量提高和

品质的改良。

文章利用

60

Coγ射线辐照亲本8PW33（籼稻背景获得一个性状能稳定遗传的内颖退化突变体（编

号:

MU102,并对其农艺性状和花器官进行了观察和分析。

结果显示,相对于野生型,该突变体的株高、每穗总粒数及剑叶宽均显著增加,而结实率则显著降低,差异均达显著水平。

解剖镜下观察表明,该突变体内颖退化,外颖弯曲呈现镰刀状,其余器官与野生型表型基本一致。

扫描电镜观察显示,突变体与野生型叶片维管束的结构组成以及外颖表皮细胞组成、排列均正常,没有明显差异;与野生型相比,突变体内颖表皮细胞排列较为紧密,推测可能是内颖收缩退化导致的。

遗传分析显示该突变性状是由隐性单基因控制,并命名为pd2。

利用实验室现有的SSR分子标记将PD2基因定位于水稻第9号染色体上,通过进一步扩大群体和开发新的Indel标记,将PD2基因定位在2个Indel标记之间,两者间的物理距离大约是82kb。

在该物理区间内有一个已经克隆的内颖发育基因REP1,经过测序和比对分析,推测REP1与PD2为等位基因。

关键词:

水稻;内颖退化;突变体;形态特征;精细定位

Morphologicalcharacteristicsandgenemappingofapaleadegrada-tion（pd2mutantinrice

YANGDe-Wei,LULi-Bin,CHENChao-Ping,ZENGMei-Juan,ZHENGXiang-Hua,YENing,LIUCheng-De,YEXin-Fu

InstituteofRice,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou350018,China

Abstract:

Theyieldandqualityofricearedirectlyimpactedbyfloralorgandevelopmentinrice.Understandingofthefloraldevelopmentmechanismwillbeusefulingeneticimprovementofyieldandquality.Inthisstudy,aricemutantpaleadegradation2（pd2inanindicacultivar‘8PW33’wasobtainedafter60Coγ-raytreatment.Analysisofthemutantshowedthat,comparedtothewildtype,plantheight,totalgrainnumberperpanicle,andswordleafwidthweresignificantlyin-

第8期杨德卫等:

一个水稻内颖退化突变体的形态特征及基因的精确定位1065

creased,buttheseedsettingrateweresignificantlydecreased.Thefloretsofthemutantexhibiteddegradedpaleaandsickle-shapedtortuouslemma.Detailexaminationusingscanningelectronmicroscopyrevealedthatwhenepidermisofthevaneandlemmawerenormal,epidermisofthepaleawerearrangedtightly,whichmightresultfromdegradedpalea.Ge-neticanalysissupportedthatthismutationphenotypewascontrolledbyasinglerecessivegene.PolymorphicanalysisofsimplesequencerepeatmarkersdemonstratedthatPD2geneislocatedonchromosome9.Withalargermappingpopula-tionandmoreindelmarkers,wefurthermappedPD2genebetween2indelmarkerswithaphysicalregionofabout82kb.Withinthisregion,thereisaclonedgeneREP1knowntocontrolricepaleadevelopment.BycomparingtheDNAse-quencesofREP1frompd2and8PW33,incombinationwiththeresultsofphenotypicanalysis,weconcludedthatPD2isanalleleofREP1.

Keywords:

rice;paleadegradation;mutant;morphologicalcharacteristics;finemapping

水稻（OryzasativaL.是重要的粮食作物之一。

水稻的开花时间、花序和花器官的形态特征及结构对其产量和品质构成重要的影响。

多少年来,水稻颖花发育的过程和机理,一直是人们很想揭开的奥秘,同时也是植物学领域研究的热点、焦点之一。

因为水稻花器官发育的过程为研究其基因的表达调控与器官形态特征之间的关系,提供了一个极其独特的思路。

因此,阐明水稻颖花发育的遗传机制不仅可以推动分子进化的研究,更为重要的是在此基础上可以更为有效地开展相关性状的分子研究,进而来提高水稻产量及品质。

在过去的20年里,随着分子生物学、遗传学等研究技术和方法的快速发展,通过对拟南芥（Arabi-dopsisthalianaL.、金鱼草（AntirrhinummajusL.等双子叶模式植物的广泛而深入研究,人们对于高等植物花发育调控分子机理的认识有了长足进展,总结形成了植物花发育调控的ABC模型。

随着一些新基因被鉴定以及研究的不断深入,ABC模型得到不断的发展和完善,使得ABC模型发展为ABCD模型[6]、四因子模型[7]和ABCDE模型[8]等。

虽然水稻花器官在结构上有别于拟南芥、金鱼草等双子叶植物的花器官,然而随着对植物花器官研究的深入,尤其是对水稻的研究,发现适合于双子叶植物的ABC模型也同样适用于水稻等单子叶植物。

然而,由于目前对水稻颖花发育缺失突变体的研究多限于形态学和遗传学方面,大部分研究是利用拟南芥、金鱼草等模式植物来研究水稻颖花的发育,直接克隆水稻颖花发育的相关基因还很少,无法确定相关基因在水稻中的确切功能,还无法绘制水稻开花主控线路图。

在水稻中很多工作还无法像拟南芥等模式植物那样高效地开展,这是当前制约水稻颖花发育相关研究的主要因素[11]。

因此,只有分离和鉴定更多的颖花发育相关的突变体,详细分析各个基因的功能以及它们之间的相互关系,才能系统地了解整个颖花发育的调控网络。

本研究通过60Coγ射线辐照亲本8PW33（籼稻背景获得了一个性状能稳定遗传的内颖退化突变体,编号为MU102,通过对其相关农艺性状进行了详细的观察和分析,并利用解剖镜和扫描电镜对该突变体颖花发育的过程进行了观察,进而了解其突变表型和形态发生过程,同时对该突变基因进行精细定位,为研究水稻颖花发育的机理及进一步通过分子手段来提高水稻产量和品质奠定了基础。

1材料和方法

1.1实验材料

供试材料为野生型8PW33,是明恢86/新科2号//东南恢307的F2后代分离中,通过多代选择而得到稳定的亲本材料。

内颖退化突变体MU102,是8PW33经过60Co-γ射线（剂量为350Gy辐照后获得的,对该突变体进行连续2年的田间观察,性状均能稳定遗传。

根据突变表型,初步命名为内颖退化（paleadegradation2,pd2突变体。

1.2性状调查

2011年在福建省福州市种植野生型和突变体,5月14日播种,6月10日移栽。

单株栽插,株行距为17cm×20cm,每个材料种植6行,每行6株,均种

1066HEREDITAS

（Beijing2012第34卷

植在福建省农业科学院水稻研究所网室。

栽培管理与一般大田相同,生长期间均正常生长。

待水稻籽粒灌浆成熟后,各取6株突变体和野生型植株分别调查株高、分蘖数、剑叶长、剑叶宽、每穗总粒数和结实率等相关性状。

分别选取20个突变体单株和野生型单株,每株随机选取10个颖花观察,对其花器官的发育特征进行了调查与分析。

1.3解剖结构与育性观察

分别对突变体与野生型在孕穗期、抽穗期、开花期、灌浆期和成熟期进行解剖观察。

取突变体和野生型在不同发育时期的颖花及果实,在解剖镜（LEIcAM26下观察其各个不同发育时期的特征并进行拍照记录,每个材料选取8个单株,每株随机选取10个颖花观察。

同时,在其开花期取突变体和野生型不同部位的颖花,在解剖镜下观察其花器官内部形态特征并拍照记录,每个材料选取8个单株,每株随机选取10个颖花观察。

在水稻开花期,分别取突变体和野生型颖花的花药,先置于载玻片上,并用镊子夹碎后,加入1~2滴浓度为1%的I2-KI进行染色,在显微镜下观察花粉粒形态、大小和染色深浅并进行拍照记录,并根据记录结果并判断其育性。

1.4组织细胞学观察

取突变体和野生型各5朵刚刚抽穗的颖花,用解剖针轻轻剥下外颖及内颖,同时取突变体和野生型的剑叶,用小剪刀分别横剪长约1cm的5个小叶片,在4℃固定液（2.5%的戊二醛中固定过夜,磷酸缓冲液（0.1mol/L,pH1.0漂洗,1%饿酸固定,梯度脱水后,再分别用乙醇和醋酸异戊酯（体积比1∶1混合液和纯醋酸异戊酯处理样品,经临界点干燥镀膜后在环境扫描电镜（荷兰Philips公司的XL30ESEM-TMP型下观察并拍照。

1.5内颖退化突变体遗传分析及基因定位群体的构建

将内颖退化突变体pd2分别与野生型8PW33、籼稻品种9311进行杂交,并观察F1表型。

F1通过自交获得F2,在成熟期,分别统计F2分离群体中正常表型个体和突变体表型个数,并用统计学方法计算各自的分离比例。

2010年7月在福建省农科院水稻研究所实验网室用内颖退化突变体pd2（籼稻与台粳16（粳稻杂交配制组合。

2010年12月在海南省三亚市福建省藤桥育种基地种植F0代的种子,成熟期观察F1代的表型,并收获所有F1代种子。

于2011年7月将该F2分离群体种植于福建省农业科学院水稻研究所实验农场,从大约6500株F2代分离群体中,共鉴定出1508个突变体表型的单株,成熟期分单株取少量叶片,用以提取每个单株基因组的DNA,并将这些单株作为该突变基因的定位群体。

1.6水稻DNA的提取及电泳检测

水稻基因组DNA的提取、PCR扩增及扩增产物的电泳检测均参照杨德卫等方法。

1.7多态性标记的筛选及Indel标记的开发

1.7.1SSR标记的选择

通过筛选均匀分布于水稻12条染色体上SSR标记（遗传相距约10~30cM,共筛选326对SSR引物,所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,用于分析其在两个亲本之间的多态性。

1.7.2Indel标记的开发和分子标记间的物理距离确定PD2基因精细定位Indel标记的开发以及两个分子标记间物理距离的确定均参照杨德卫等方法。

1.8内颖退化突变体PD2基因初步定位

运用BSA（Bulkedsegregantanalysis法,从6500个F2分离群体中,随机挑选25个突变体表型的单株,各自取其叶片并等量混成DNA混池,以F1代及双亲本的DNA作为对照,利用在双亲中筛选的多态性进行分子标记检测,获得偏扩增带型后,从分离群体中再随机选取138个突变体,进一步确定连锁标记与突变体基因间的重组值及遗传距离,进而对PD2基因进行初步定位。

1.9内颖退化突变体PD2基因的精确定位

根据对PD2基因初步定位结果,通过扩大定位群体,并利用已经公布的水稻数据库引物及水稻基因组序列,在目标基因附近区域筛选并合成新的SSR引物,同时在目标区域筛选不到多态性SSR引物时,开发并合成新的Indel标记,从而完成PD2基因的精细定位（表1。

第8期

杨德卫等:

一个水稻内颖退化突变体的形态特征及基因的精确定位1067

表1本研究精细定位PD2基因所开发的SSR和Indel分子标记序列

序列

标记名称

标记类型

正向（5′→3′

反向（5′→3′

BAC克隆

RM5657SSRTATGTGCATTTGTAAGGTGAGCTTTAGATTATTGAGCGAGOJ1261_A08RM24240SSRATGCAACCTCCTCCATCATAAGGTGCTGCTCCTACCTCACTCACCB1040D06RM24260SSRACTAAAGGTCCCTAGATGATAAAGATGTTGGCTATGTCP0435D08RM24275SSRTATAGCAAGAGCCATAGCCTACCAACCCAGATGAACP0650H04RM24282SSRTTGTGGTTATTTGGCTGTCCGAACTGTTAAACGATGTG

OSJNBb0014M19

RM24301SSRGAGCTGGATGTCCTCGAACG

GACCACCTCTCCAAGCTCACCOSJNBa0084L05

Indel-9-1IndelTATGTGCATTTGTAAGGTGAGCTTTAGATTATTGAGCGAGOJ1261_A08Indel-9-2IndelTCTTGCATTGACACCTCTTGAGCAGTCCCAACAACTGGAAGAGAGGP0465E03Indel-9-3IndelTGACGTGTCTAGGTCCATAATGCTTTCCTGTTCCGTTTGTCAGGOJ1585_D02Indel-9-4IndelGAACAGAGGAGGAGATCGAGAGGCTTCTTGGGAGATGCAGAAATGGOJ1294_G06

Indel-9-5IndelCGATGTGTCGTCGTCGTCAGCTCCTCGTGCAGAAGAAGOJ1294_G06Indel-9-6IndelACCCAACTACGATCAGCTCGCTCCAGGAACACGCTCTTTCP0643D11Indel-9-7IndelTCCACTTCATCTTCTCAACCCGGAGTAGATCAGTAGGATCGP0643D11RM24323SSRGTATATATCCGTGCGAATCACTCTCCAACACAGCTCACGCCAGTTCCP0707C02RM24334SSRGAACGGTTTGAGGAAGAAGAAGACGATCCATCCACGACACACCATCC

P0668D04

2结果与分析

2.1突变体pd2与其野生型8PW33相关农艺性状

比较

相对于野生型8PW33,pd2突变体的株高为119.6cm,差异达到极显著水平;每穗总粒数,野生型平均是152.3,而pd2突变体平均是255.3,差异达到极显著水平;结实率,野生型平均为92.6%,基本正常,而pd2突变体平均为48.4%,仅为野生型的一半,差异达到极显著水平;剑叶宽,与野生型相比显著增加,差异达到显著水平;每株分蘖数和剑叶长等性状,突变体与野生型表现基本一致（表2。

显然,pd2突变体在株高、每穗总粒数和剑叶宽等性状野生型相比有显著差异。

表2突变体pd2与野生型8PW33部分农艺性状的比较

主要性状8PW33

pd2

差异

株高（cm99.3119.6−20.3**每株分蘖数（个6.87.3−0.5剑叶长（cm55.058.4−3.4剑叶宽（cm2.002.80−0.8*每穗总粒数（个152.3255.3−102.0**结实率（%

92.648.444.2**

注:

**为极显著差异（P<0.01,*为显著差异（P<0.05。

2.2突变体pd2表型分析

从外观形态上看,突变体pd2与野生型相比,株型相似,外颖表现弯曲,像镰刀状（图1A,内颖退化收缩,内、外颖一般不闭合（图1E。

用解剖镜观察突变体和野生型20朵不同单株的颖花,结果显示:

突变体颖花由1对护颖、1枚外颖和1枚内颖、2枚浆片、6枚雄蕊和1枚雌蕊组成。

因此,pd2突变体除了内颖表现退化外,其余器官及构件与野生型基本相同。

为了进一步了解pd2突变体内外颖发育过程,我们利用解剖镜对突变体和野生型在不同生长时期进行观察,包括孕穗期、抽穗期、开花期、灌浆期和成熟期等。

结果显示pd2突变体在孕穗期和抽穗期,内颖表现收缩,而未退化,外颖弯曲,内外颖表现闭合（图1B,C。

从开花期开始,一直到成熟期,内颖开始逐渐退化,内外颖表现开裂不闭合（图1:

D,E,F。

而有趣的是,pd2突变体在开花期,有3~5枚雄蕊暴露在退化的内颖外面,而野生型的6枚雄蕊均被正常的内外颖包裹着（图1D。

I2-KI染色、显微镜下观察发现,pd2突变体的花粉类型与野生型相似（图1G,为染败类型,花粉可育率大于90%以上。

pd2突变体用正常可育花粉辅助授粉后,均能正常结实,进一步表明pd2突变体

1068HEREDITAS（Beijing2012第34卷

的雄蕊和雌蕊均正常可育。

2.3突变体pd2组织细胞学分析

为了从细胞学水平比较pd2突变体与野生型之间的差异,

我们对其内颖、外颖和叶片横切面进行了扫描电镜观察。

观察发现,pd2突变体与野生型叶片中维管束的组成和结构没有明显差异（图2:

A,B。

pd2突变体与野生型外颖表皮细胞形态基本一致,细胞排列成行,有明显的突出结构（图2:

C,D;pd2突变体内颖表皮细胞形态与野生型基本一致,细胞

排列成行,但细胞排列较密,可能是内颖收缩导致的结果（图2:

E,F。

2.4突变体pd2的遗传分析

将pd2突变体分别与野生型8PW33、籼稻品种9311杂交,种植F1代,其颖壳均表现正常。

将F1自交种子全部种下,田间调查F2代分离比,经卡平方检验χ2c<χ20.05=3.84,即正常型与突变型的分离符合孟德尔遗传3:

1比例（表3。

这一结果表明该突变性状是由1对隐性单基因控制的。

图1突变体与野生型表型及穗部发育过程比较

A:

整个单株比较;B:

孕穗期颖花比较;C:

抽穗期颖花比较;D:

开花期颖花比较;E:

灌浆期颖壳比较;F:

成熟期颖壳比较;G:

花粉育性比较,其中wt表示野生型,pd2表示突变体。

图2突变体与野生型扫描电镜观察比较

野生型（A与突变体（B叶片横切面扫描电镜观察比较;野生型（C与突变体（D外颖表面扫描电镜观察比较;野生型（E与突变体（F内颖表面边缘部分的扫描电镜观察比较,其中红色线条表示表皮细胞排列的疏密程度。

第8期杨德卫等:

一个水稻内颖退化突变体的形态特征及基因的精确定位1069表3内颖退化突变体pd2的遗传分析杂交组合pd2/8PW33pd2/9311F1表型正常型正常型F2群体正常型株数156135退化内颖数4655总株数202190χ2（3:

10.330*0.688*P值0.5~0.750.25~0.5注：

*表示在0.05显著水平上,正常株和突变株的分离比例符合3:

1。

2.5内颖退化突变体PD2基因的初步定位利用326对均匀分布于水稻12条染色体上的RM6051检测到的所有交换单株与RM6854检测的交换单株完全不同。

进而说明PD2基因位点被定位在SSR标记RM6051和RM6854之间,遗传距离为3.6cM