耐盐产酯酵母的筛选鉴定及其特性广东轻工职业技术学院.docx

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耐盐产酯酵母的筛选鉴定及其特性广东轻工职业技术学院

耐盐产酯酵母的筛选、鉴定及其特性

黄桂凤，童辉绍，苏诗琪，施俊博，唐敬军，叶志林，蒋敏华，马小雯，

（广东轻工职业技术学院，广州，510300）

摘要：

为了提升高盐发酵酱类产品的风味，从自然发酵的辣椒酱中筛选高产酯的菌种。

通过发酵筛选和产物分析，获得1株乙酸乙酯高产菌种DZ-3。

经过形态特征、生理生化特征和18SrDNA分子生物学分析，菌种DZ-3被鉴定为皮状丝孢酵母。

通过氮源和发酵条件的优选试验，确定菌种DZ-3最佳氮源是酵母膏，最佳的摇瓶发酵条件为：

温度28°C、初始pH6.0和转速200rpm，乙酸乙酯的最高产量达3.84g/L。

以含有0~180g/L氯化钠的培养基中进行耐盐性试验，菌种DZ-3表现出较强的耐盐性。

关键词：

产酯酵母；耐盐；筛选；鉴定；特性

Screening,IdentificationandCharacterizationofaSalt-tolerantandEster-producingYeast

HUANGGui-feng,YEZhi-lin,MAXiao-wen,SUShi-qi,JIANGMin-hua,TANGJing-jun,SHIJun-bo,

TONGHui-shao,CHENWei-xin,LIJing,DENGMao-cheng

（GuangdongIndustryTechnicalCollege,Guangzhou510300）

Abstract:

Inordertoupgradetheflavorofhigh-saltfermentationpasteproducts,highester-producingandsalt-tolerantstrainswerescreenedfromnaturalfermentationchilisauce.ThestrainDZ-3withthehighestester-producingcapabilitywasobtainedbyfermentationscreeningandproductanalysis.DZ-3wasidentifiedasTrichosporoncutaneumbyusingthemorphologicalcharacteristics,physiologicalandbiochemicalcharacteristicsand18SrDNAsequencesanalysis.

Bymeansofoptimizationtests,theoptimalnitrogenresourceforstrainDZ-3wasyeastextractandthebestfermentationconditionsforethylacetate-producingweredeterminedastemperatureof28°C,initialpHof6.0androtationspeedof200rpm.Thehighestyieldofethylacetatereached3.84g/Lwiththeoptimalcondition.Seriesofsalttolerancetestswereperformedinamediumcontaining0~180g/LsodiumchlorideandstrainDZ-3showedgoodsaltresistance.

Keywords:

ester-producingyeast;salttolerant;screen;identification;characterization

引言

酯类是酒类、酱类的重要香气物质，这些产品中常见的酯类有甲酸丁酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯等[1-2]。

产酯微生物通常有酵母菌、霉菌和细菌，酵母菌在产酯的研究及应用中较为普遍[3-5]。

但是，由于我国酱类发酵的盐度较高，风味品质不仅要求微生物具有较高的产酯能力，还对微生物的耐盐性有很高的要求。

随着高端发酵型酱类的市场需求日益扩大，耐盐产酯微生物的研究及应用逐渐成为发酵型酱类领域的热点。

为了提高发酵型酱类的风味品质，本实验主要探索耐盐产酯微生物的筛选及其基本特性。

1材料与方法

1.1材料与主要试剂

筛选材料：

自然发酵的辣椒酱；无水乙醇、乙酸、乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯：

色谱纯，市售；其它试剂：

市售。

1.2富集培养与平板分离

富集培养基：

葡萄糖50g/L，乙醇10%（v/v），酵母膏10g/L，NaCl100g/L，KH2PO42.0g/L；先将乙醇以外的组分溶于纯净水，调节pH至4.5，121°C灭菌20min，冷却至室温，然后加入无水乙醇，混匀。

平板培养基：

葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，琼脂20g/L，pH4.5。

斜面培养基的组成同平板培养基，pH7.0。

称取10g自然发酵辣椒酱，接入200mL的富集培养基，置于28°C、200rpm的条件下振荡培养24h。

在无菌操作条件下，梯度稀释培养液，涂布于平板培养基上，28°C培养36h。

从平板上挑取单菌落，接入斜面培养基，28°C培养24h，放入4°C冰箱保藏，备用。

1.3产酯酵母的筛选

摇瓶发酵的基础培养基：

葡萄糖50g/L，酵母膏4.0g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，pH7.0。

用接种环挑取上述分离菌株的斜面菌种，接入发酵培养基，100mL发酵培养基的接种量为1环，置于28°C、200rpm的条件下振荡培养24h。

然后，检测各菌株发酵液中的总酯，根据检测结果筛选出酯类高产菌株。

1.4总酯的测定

在8000rpm的条件下对发酵液进行离心20min，收集清液，加入等体积的纯净水，于100°C进行蒸馏，直至馏出液为总体积的50%。

然后，采用回流皂化法测定馏出液中的总酯（以乙酸乙酯计）[6]。

1.5产物的GCMS分析

利用气相色谱质谱联用仪GCMS-QP2010Plus（日本岛津公司）对馏出液中的组分进行分析。

GC条件：

进样口温度250°C，色谱柱Rtx-WAX（30m×0.25mm×0.25µm），柱温35°C，保持2min，程序升温10°C/min，至250°C保持5min，载气He，流速1.0mL/min，柱前压68kPa，分流比10:

1，进样量1μL。

MS条件：

EI离子源，电子能量70eV，扫描范围10-400，离子源温度230°C，检测器电压1.20kV，GC/MS接口温度250°C。

以乙醇、乙酸、乙酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯等作为标准品。

1.6菌种鉴定

参照《酵母菌的特征与鉴定手册》中的鉴定方法[7]，对筛选所得的高产菌株进行显微镜检查和生理生化试验，并利用扫描电镜进行菌体形态观察和摄像。

参照文献的方法[8]，采用通用引物（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′和5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3′）对18SrDNA进行PCR扩增，PCR产物经纯化后，送至深圳华大基因科技服务公司进行序列测序，将拼接后的序列输入NCBI（http:

//blast.ncbi.nlm.nih.gov）中进行同源性检索，从而对高产菌株进行18SrDNA鉴定。

1.7氮源对产酯的影响

分别以酵母膏、尿素、NH4Cl、NH4NO3、（NH4）2SO4等作为摇瓶培养基的唯一氮源，在发酵培养基中接入高产菌株的斜面菌种，在28°C、200rpm的条件下发酵24h，检测酯类的产量，根据测定结果优选氮源。

1.8发酵条件对产酯的影响

以1.7中优选所得的氮源为唯一氮源，配制培养基，接入高产菌株的斜面菌种，分别在不同的温度、初始pH和摇瓶转速下进行发酵，检测酯类的产量。

1.9盐度对产酯的影响

在1.7和1.8的实验基础上，将不同用量的氯化钠添加至培养基中，经摇瓶发酵，检测酯类的产量。

2结果与讨论

2.1产酯菌株的筛选

从平板中挑取了82个单菌落，经摇瓶发酵筛选，获得产酯菌株7株，总酯的产量如图1所示。

7株菌总酯产量的范围为0.65~3.87g/L，其中，菌株DZ-3的产量最高。

王旭亮等从清香型酒醅中筛选获得一株异常毕赤酵母Ac-19，该菌发酵4d的总酯产量约为1.572g/L[9]。

宋韡等利用从汾酒大曲中分离获得的异常汉逊酵母NZ-19-1，在优化条件下发酵7d，产酯量达到2.9g/L[10]。

与文献报道的产酯率相比，菌株DZ-3具有较高的产酯能力，故被选为进一步研究的菌株。

图17株菌株的总酯产量

Fig.1Totalesteryieldproducedform7strains

2.2酯类的GC-MS分析

采用气相色谱质谱联用仪对菌株DZ-3发酵液的馏出液进行分析，各组分的GC-MS图谱如图2所示。

图2中主要存在3个峰，第一个峰（2.769min）对应的组分是乙酸乙酯，第二个峰（3.462min）对应的组分是乙醇，第三个峰（6.975min）对应的组分是水。

经GCMS分析，菌株DZ-3所产的酯类物质以乙酸乙酯为主，其产量为3.84g/L，与总酯测定的结果十分接近。

图2菌株DZ-3酯类产物的GC-MS

Fig.2GC-MSspectrumofesterproductderivedfromstrainDZ-3

2.3菌种DZ-3的鉴定

菌种DZ-3在平板培养基上的菌落呈白色、圆形、中央凸起、边缘整齐。

通过载片培养物制作和显微镜观察，并采用扫描电镜观察与摄像，扫描电镜（×5000）下的菌体形态如图3所示，发现菌体呈椭圆形，有假菌丝和子囊孢子的形成。

部分生理生化试验项目的结果如表1所示，菌种DZ-3可利用葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖进行发酵，可利用硝酸盐作为唯一氮源，可分解利用尿素，不能产生胞外类淀粉多糖。

通过对菌种DZ-3的18SrDNA进行PCR扩增，获得1762bp的序列，在NCBI中利用BLAST程序与数据库的序列进行比对，发现菌种DZ-3与TrichosporoncutaneumSJH05（登录号:

EF114682.1）的亲缘关系最为接近，它们的同源性达99%。

利用软件MEGA5.2以Neighbor-joining法对菌种DZ-3构建系统发育树，如图4所示。

根据菌种DZ-3的形态特征、部分生理生化特征以及18SrDNA分子生物学特征，可确定它为皮状丝胞酵母（Trichosporoncutaneum）。

图3菌种DZ-3在扫描电镜（×5000）下的形态

Fig.3SEMphotographsofcellmorphologyofstrainDZ-3（×5000）

表1生理生化试验情况

Table1PhysiologicalandbiochemicalcharacteristicsofstrainDZ-3

试验项目

结果

葡萄糖发酵

果糖发酵

麦芽糖发酵

蔗糖发酵

硝酸盐利用

产类淀粉物质

脲酶试验

+

+

+

+

+

-

+

注：

“+”表示阳性，“-”表示阴性。

图4菌种DZ-3的系统发育树

Fig.4Thesequencephylogenetic