同济大学研究生考试高分牛人 总结版.docx
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同济大学研究生考试高分牛人总结版
技术
一凝胶电泳技术
将某种带电分子放到特定凝胶介并加以电场作用，它就会以一定的速度向相应的电极运动。
在一定的条件下，运动的迁移速度和分子携带的电荷量成正比，与分子量成反比，并且与空间构象有关。
凝胶浓度越高，孔隙越小，其分辨率也就越强。
主要有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种。
后者的分辨率高。
核酸的电泳：
核酸分子因为带有磷酸基团而带有负电，向正极移动。
电泳迁移率取决于核酸片段大学和分子构型。
共价闭合环状快于开环快于线性
加入EB试剂染色，后用紫外光照射辨别
蛋白质的电泳：
1SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺中加入SDS和巯基乙醇。
巯基乙醇断裂二琉键，SDS是一种阴离子去污剂，能使蛋白质变性并与覆盖于表面，使蛋白质带有负电，从而消除了构象和电荷差异，使蛋白质可以在PAGE的分子筛效应下按分子量大小进行分离。
因电泳迁移率只与分子量的对数成线性关系，可用于蛋白质的分子量。
LGM＝A－BX迁移率
2等点聚焦电泳（IEF）
在介质中加入两性电解质载体，在电场中形成PH从正极到负极递增的PH值梯度。
电泳时蛋白质会移动到与其PI相等的PH区域，静电荷为零，而停留。
故将蛋白质按不同等电点分开。
3双向电泳
在互相垂直的两个方向上设置两种电泳
第一向为蛋白质等电聚焦，电泳后按等电点分离
第二向为SDS-PAGE，按分子量分离。
二 分子杂交及印记技术
分子杂交：
利用DNA变性和复性原理，DNA在加热变性后成单链，此时加入有互补序列的DNA或者RNA探针，缓慢冷却复性后，就会形成杂化双链，称分子杂交。
探针：
带有标记的特定序列的核酸片段。
可用于检测样品中是否存在特定的DNA序列。
标记：
放射性同位素，生物素，荧光染料。
印记技术：
1DNA印记（southernblotting）
DNA样品经过限制性内切酶处理后进行电泳，然后对电泳后含有DNA区带的凝胶用变性剂处理后DNA使成为单链分子，然后转移到膜上，将带有单链分子的膜放在有DNA探针的杂交液中进行杂交。
然后通过探针上的标记检验杂交情况。
2RNA印记（northernblotting）
RNA片段小无需酶切。
3蛋白质印记（westernblotting）
是ELISA与印记技术的综合应用
用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。
转移先封闭膜上未反应的位点，以抑制抗体的非特异吸附。
然后以膜上待测蛋白作为抗原，与对应的非标记抗体（一抗）结合。
洗去未结合的一抗，然后加入酶偶联或者放射性同位素的二抗，通过化学显色反应或者放射自显影，以检测蛋白抗原。
二抗一般为：
1放射性同位素标记2酶偶联的抗体3生物素偶联抗体
其中23常用。
酶有辣根过氧化物酶，可以催化特定的底物分解产生化学显色反应。
三 聚合酶链式反应：
PCR
PCR：
是根据DNA变性与复性，使目的DNA在一定的体外扩增系统中，循环经历变性，复性，延伸反应的基本过程，从而大量扩增。
PCR体系：
1模板：
一般为DNA，若为RNA，需要先逆转录成CDNA。
2四种dNTP：
过高会错配，过低影响效率
3TaqDNA聚合酶：
从嗜热细菌中分离，耐热，需Mg,有末端转移酶活性，加上dATP，可用A-T法克隆到载体上。
4引物
一般为一对引物，5'和3'端引物
引物设计的一般原则：
（1引物长度：
16－36bp，太短会影响特异性，太长会增加成本和引物的TM值，TM值太高会影响特异性
（2G+C含量：
40－60％
（3碱基分布：
不能有若干G＋C连续排列，特别是3'，易错配
（4不含互补序列：
自身不能含互补序列而形成发夹结构
（5引物与非目的扩增序列的同源性要低：
否则会错配
（63'为G或者C，不要为A
（75'可以修饰：
增加酶切位点，标记物，突变位点，启动子序列等
5缓冲液
Mg,聚合酶辅因子；DTT,保护酶；Tris-HCl，缓冲液，稳定PH。
反应过程
变性：
95度，30－60秒，变单链
退火（复性）：
冷却，引物与单链模板结合。
退火温度可以根据引物长度和G+C含量来确定，引物长度过高，TM增加；TM＝4（G+C）＋2（A+T）；一般比TM低5－8度。
在不影响特应性情况下，尽量选择较高的复性温度。
延伸：
升温72度，引物引导合成延伸
存在平台效应。
若产量不够，可以取第一次扩增的产物做模板，在进行第二次PCR，不能盲目增加循环次数。
PCR扩展类型：
1原位PCR：
组织细胞经过固定处理，直接用于PCR，利用探针与杂交产物进行杂交，后检测探针。
故拥有定位作用。
而且相比较于原位杂交，DNA被扩增浓度大大增高，提高了检测的灵敏度
2 逆转录PCR：
由RNA先逆转录成DNA，再进行扩增。
酶需逆转录酶，也有人直接用Taq酶进行扩增。
如果用真核MRNA为模板，可以用寡聚T作引物，合成CDNA，后进行一般PCR的步骤。
3巢式PCR：
用于一对引物扩增微量DNA，产量不高，可改用两对引物扩增两次。
外部引物扩增外部较长片段，内部引物扩增长片段内部的片段，是需要特意扩增的区域。
外部引物比内部引物TM高，而浓度低。
第一次扩增用较高的退火温度，外部引物可以融合，扩增出长片段；第二次扩增时外部引物基本耗尽，选择较低退火温度，内部引物于长片段结合，扩增目的片段。
这种方法增加了扩增的特异性和产量。
4实时PCR：
PCR过程中引入了TaqMan萤光探针，可于模板DNA内部序列配对结合，含有5'和3'两个不同波长的荧光基团，这两个荧光基团在探针分子上相互接近而发生猝灭。
PCR过程中，退火时，探针结合到模板上，延伸时，被Taq切掉，从而释放激活荧光基团，产生荧光反应，根据荧光的强弱可以反映出扩增产物动态的增加情况。
四：
核酸测序技术
末端合成终止法
将模板分为四个反应管：
分别加入引物，DNA聚合酶，放射性标记的底物dNTP，进行延伸。
将四种ddNTP分别参入到合成中不同阶段的DNA链中，就会导致在不同的位置终止。
然后分别用PAGE电泳分离，然后放射自显影就可读出片段序列。
化学降解测序法
将一端带有标记的待测片段分别用四种不同的化学试剂修饰不同的碱基，并在该位置打断DNA链（每条模板被一种试剂修饰，并且只在修饰的许多的位点中随机一点被打断一次），产生一系列以不同末端结束的DNA片段，然后PAGE，放射自显影读出片段序列。
自动测序法
基础是sanger法（末端合成终止法）。
直接用四种不同的荧光染料标记四种ddNTP,反应产物经过电泳分离，激光激发4中不同波长荧光，从而确定DNA序列。
五：
DNA和RNA的分离提取
DNA的提取：
真核DNA与组蛋白结合成核蛋白（DNP）
1细胞破碎后用浓盐（1MNACL）提取，然后稀释至生理盐（0.14），DNP纤维状沉淀。
用玻璃棒搅拌使其缠绕。
2苯酚或者异戊醇（蛋白变性剂）使蛋白变性，离心除去
也可用CSCL密度梯度离心：
上蛋白质，中DNA，下RNA
RNA的提取
1总RNA的提取：
Trizon试剂（异硫氰酸胍－苯酚）
2MRNA提取：
用寡聚dT柱吸附，用盐洗脱。
六：
文库的构建
（一）基因组文库的构建
1染色体DNA的片段化：
保证断裂的随机性
（1机械切割：
超声，震荡等
（2识别4bp的限制内切酶部分消化：
Sau3A
2载体DNA的制备：
一般用入噬菌体，或者柯斯质粒。
3体外连接与包装：
T4DNA连接酶连接，然后与蛋白体外包装成噬菌体
4重组子转染宿主大肠杆菌
5文库的鉴定和扩增。
（二）CDNA文库的构建
1 CDNA的合成：
用提取的MRNA
（1第一条链：
引物为寡聚DT，为逆转录酶
（2第二条链：
用RNAH部分降解MRNA，剩下的小片段作为引物，为KLENOW酶
一般加入甲基化的dCTP，保证甲基化修饰。
完成后可加入接头或衔接物
2载体的制备：
一般用质粒就可
3 CDNA与载体连接：
变平端再连接，加同聚物连接，加接头或衔接物
4 转化宿主大肠杆菌
5文库的鉴定和扩增
七：
文库的筛选技术
基础就是核酸杂交法
1原位杂交：
菌落原位影印到膜上（硝酸纤维素膜），碱处理使DNA变性成单链，然后除去蛋白质，形成菌落DNA印记。
然后用特异序列探针杂交，筛选阳性克隆
2免疫筛选：
也需要转膜，只是检测的是CDNA文库的表达蛋白（抗原）而不是特异序列
3差别杂交：
主要用于筛选特异表达的基因。
同种细胞分为两组，一组用一定刺激使特殊基因表达，然后提取MRNA，制作CDNA文库。
然后分别用两组细胞产生的MRNA作为探针，与文库杂交，然后检验，对比。
未刺激的细胞产物中不存在的杂交位点就是特异表达的基因
4扣除杂交：
条件同上，直接用刺激细胞的CDNA与未刺激细胞的MRNA杂交，杂交夜流过特异的吸附柱，使得双链（杂交的非特异表达基因的MRNA）被吸附，而洗脱液中存在特异表达的CDNA，然后再用洗脱液与自身MRNA杂交，特异MRNA能杂交成双链，洗脱过留在柱上被分离。
八：
基因克隆技术
克隆：
可以指由同一个祖细胞分裂而来的具有相同遗传背景的子细胞。
分子生物学上指把外源重组DNA通过载体导入到宿主细胞，经过筛选后，将含有特定重组体的宿主细胞选出加以扩增，形成单个细胞的无性繁殖系的过程。
1 RACE：
CDNA末端快速扩增技术。
用于从已知CDNA序列的基础上克隆5'端或3'端缺失序列的技术。
2 CDNA差示分析技术
3 Gateway大规模克隆技术
4 基因的位图克隆
九：
蛋白质的分离和鉴定
分离：
双向电泳 高效液相色谱 鉴定：
质谱分析技术
十：
基因表达研究技术
1SAGE 2RNA选择性剪接技术 3原位杂交技术4基因定点突变技术
十一：
基因敲除技术
基因敲除：
又称基因打靶技术，使利用外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和改造，具有专一性强，重组后的染色体可以稳定遗传等优点。
分为
完全基因敲除：
通过同源重组完全消除细胞或者动物个体中靶基因的活性
条件基因敲除：
通过重组定位系统实现特定时间和空间的基因的敲除
高等动物基因敲除（在小鼠上模型上比较成熟）：
1构建重组外源基因载体2电穿孔法或者显微注射法导入胚胎干细胞系3外源基因和干细胞基因组中相应部分的同源重组4重组基因表达及重组干细胞的筛选5重组干细胞注射入胚泡，并将胚泡移入代孕母体子宫中6获得基因敲除动物。
其技术基础是干细胞的分离及培养。
植物基因的敲除：
利用根瘤农杆菌T－DNA（TI质粒DNA）介导。
十二：
DNA蛋白质相互作用技术
基础：
分子杂交
（一）：
足迹试验
足迹实验（foot-printingassay），是一种用来检测被特定转录因子蛋白质特异性结合的DNA序列的位置及其核苷酸序列结构的专门实验方法。
原理：
当DNA分子中的某一区段同特异的转录因子结合之后便可以得到保护而免受DNaseI的切割作用，而不会产生出相应的切割分子，结果在凝胶电泳放射性自显影图片上便出现了一个空白区，俗称为“足迹”。
过程：
1将待检测的双链DNA分子在体外用32P作5‘末端标记，并用适当的限制性内切酶切出其中的一个末端，得到一条单链末端标记的双链DNA
2在体外同蛋白质提取物混合，反应后，形成DNA-蛋白质复合体
3在反应混合物中加入少量的DNaseI,并控制用量使之达到平均每条DNA链，只发生一次磷酸二酯键的断裂。
4除去蛋白质，电泳后放射自显影检测。
若不存在互作部位，则电泳条带应该是一整条连续不间断的片段梯度；而如果存在互作部位，则互作区域由于受到结蛋白保护，则免受酶解，不会产生相应长度的片段，则显示为空白区。
对比即可分析出互作区于DNA的位置。
（二）：
酵母单杂交
在酵母体系中研究真核DNA－蛋白互作。
并通过筛选DNA文库直接获得互作蛋白得基因，也是分析转录调控因子和顺式作用元件互作得手段
原理：
构建DNA，将特定的顺式作用元件构建到最基本的启动子上游，报告基因连在下游，然后将待测转录因子的CDNA与已知的酵母转录因子的激活结构域（AD）融合构建表达载体并导入酵母细胞，如果该基因产物如果能通过待测蛋白部分与顺式作用元件结合而互作，那么其AD部分也会因为靠近启动子而激活报告基因转录。
则证明了互作，还知道了待测蛋白的CDNA序列。
（三）：
凝胶阻滞试验（电泳迁移率变动测定）
蛋白质与DNA结合后会大大增加核酸的分子质量，在电泳时，没有结合蛋白质的核酸迁移率大大高于复合物。
用放射性同位素或者生物素标记的待测核苷酸探针，与蛋白质提取物进行温育，充分反应，然后进行PAGE，最后检测条带位置。
结合有蛋白质的核酸受到阻滞，条带位置往往出现在凝胶底部。
（四）：
DNA结合蛋白的滤膜分析法
DNA不能被硝酸纤维素滤膜结合，但蛋白可结合。
用探针结合待测蛋白，通过滤膜，放射自显影，可找到相应蛋白质。
（五）：
核酸适体技术
通过建立随机寡核苷酸文库，与特异蛋白质作用并不断筛选，最终筛选出高亲和力的核酸的过程。
先建立随机寡核苷酸文库，与特异蛋白温育，然后去掉未结合的核酸序列，并使特异结合的核酸解离，进行PCR扩增，然后再将扩增产物与特异蛋白结合，进行再次筛选，多次筛选后，可以得到与特异蛋白高亲和力的寡核苷酸片段。
（六）：
噬菌体展示技术
将基因表达产物与亲和选择相结合的技术。
基本原理是将编码诱饵蛋白的DNA片段插入噬菌体编码外壳蛋白的基因内，表达融合蛋白。
噬菌体装配后，外壳蛋白上带有诱饵蛋白，可直接用于捕获靶蛋白库的目标蛋白
十三：
蛋白质互作技术
（一）酶连免疫吸附ELISA
以待测蛋白作为抗原固定在基质上，封闭基质上其他位点（防止一抗的非特异吸附）。
然后加入一抗处理，使之结合，不结合的一抗洗去。
用第二抗体（二抗连有催化发生显色化学反应的酶）与一抗结合，后加入酶的底物，生成有色产物，检验含量，可间接获得抗原与一抗的互作。
（二）酵母双杂交系统
通过蛋白质与蛋白质的互作，分离能与已知靶蛋白质相互作用的蛋白质和其编码基因。
原理：
真核生物的转录因子大多数是由两个结构域组成，一个是与DNA结合作用的DNA结合域BD，一个是具有转录激活作用的DNA激活域AD。
先将编码已知蛋白（诱饵）的与编码BD的基因连接并转入表达载体上，导入受体细胞表达，融合蛋白的BD部分就会与DNA序列相应的转录激活位点结合；同时，将待筛选的文库DNA中编码待测蛋白（猎物）不同片段分别与编码AD的序列连接并转入表达载体，导入受体细胞表达，融合蛋白中如果有能与诱饵互作的猎物蛋白，两者相互结合导致AD与BD靠近，激活下游报告基因转录。
从而筛选出目的蛋白和其编码基因
（三）FarWestern
Ｐ32标记的体外表达蛋白作为探针，直接检测与该蛋白发生互作的蛋白
（四）等离子表面共振
将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于金属膜上。
当待测蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同诱饵蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率升高，导致共振角度的改变。
（六）GST融合蛋白沉淀技术
利用GST对谷胱甘肽相偶联的载体的亲和力分离蛋白。
用GST与诱饵蛋白表达融合蛋白，从而将诱饵固定于载体，然后与待测蛋白互作，并洗去未结合的蛋白，进而分离到互作蛋白。
（七）免疫共沉淀技术
将抗体连接到固体基质上，利用与抗原的亲和力结合，然后离心沉淀或者微膜过滤将蛋白复合物沉淀到试管底物或者微膜上。
（八）FRET荧光共振能量转移法（体内）
靶蛋白与诱饵蛋白分别与不同的荧光蛋白结合，如果相互作用而靠近，则发生FRET，检测显示不同的颜色。
十四 RNA干扰
外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。
宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23bp），即siRNA。
作用机理：
1siRNA解链成正义链和反义链，由反义链指导合成RNA诱导的沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。
RISC介导目的mRNA的切割，位点即是与siRNA中反义链互补结合的区域。
从而实现干扰靶基因表达的功能。
2siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA依赖的RNA聚合酶作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。
RNAi发生于所有真核生物细胞内。
需要说明的是，由于dsRNA抑制基因表达具有潜在高效性，任何导致正常机体dsRNA形成的情况都会引起不需要的相应基因沉寂。
所以正常机体内各种基因有效表达有一套严密防止dsRNA形成的机制。
非哺乳动物细胞利用较长的dsRNA直接诱导产生RNAI而无需合成siRNA，而哺乳动物较长的dsRNA会引发大量非特异基因沉默
RNAi的应用：
1高通量研究基因功能2研究信号转导3基因治疗4开发新药5基因表达调控
存在问题：
1dsRNA合成，导入困难2长dsRNA可导致哺乳动物非特异性的全面基因抑制3dsRNA浓度要求严格4持续时间短
十五：
基因芯片技术
基因芯片，又称DNA微阵列技术，基本原理是将大量已知或未知序列的DNA片段按一定顺序固定于微小的芯片上，然后与标记的样品进行杂交。
通过检测杂交信号的变化而进行分析研究的技术。
具有高通量，高灵敏度，同时检测大量基因的表达调控等优点。
分类：
1简易基因芯片2大规模基因芯片3微珠芯片
十六：
蛋白质芯片技术
同基因芯片类似，将大量蛋白按一定顺序固定于微小的芯片上，然后用标记的探针蛋白于芯片杂交。
检测杂交信号，进行分析研究。
十七：
DNA重组技术：
是指将目的基因进行改造，然后通过一定的载体转入宿主细胞，并对重组体宿主细胞进行筛选，克隆，后续培养，从而获得所需要的遗传性状或者表达产物的技术。
具体流程
（一）目的基因的获取：
1基因组文库 2逆转录CDNA 3PRC特异扩增 4化学合成
（二）目的基因与载体的连接：
用限制性内切酶分别对外源目的基因和载体质粒进行酶切。
用连接酶进行连接。
（三）重组载体转化受体细胞：
用物理或化学方法处理宿主细胞，使其成为感受态细胞，然后与重组DNA分子混合，进行转化。
然后进行培养
（四）转化子的筛选鉴定：
可根据转化子的特征直接选择：
1抗药标记2营养标记3蓝白斑筛选
分离出质粒进行检测：
1酶切电泳 2DNA序列分析
DNA探针杂交：
1菌落进行原位杂交 2sourthernblotting
免疫化学检验筛选：
对产物蛋白的直接筛选
（五）对获得外源基因的细胞进行扩大培养，获得有新遗传性状的重组体或者表达产物。
十八：
DNA分子标记
DNA分子标记也称DNA多态性标记，是DNA水平上遗传多样性的反映
1RFLP标记：
限制性片段长度多态性标记。
第一代
DNA上某一位点的改变有可能使该位点出现新的限制性内切酶切位点或者使其原酶切位点消失，造成酶切片段长度差异，称为限制片段长度多态性。
用sourthern杂交来检验。
2RAPD标记：
随机扩增多态性DNA标记。
用随机短引物进行DNA的PCR扩增，所扩增的区域是未知的，用于研究未知基因组
3SSR标记：
简单重复序列标记。
第二代
又称微卫星DNA多态性标记，即由二核苷酸，三核苷酸，四核甘酸串联重复的拷贝数不等而形成的多态性标记。
4STS标记：
序列标定位置标记
染色体上位置已知，核苷酸序列已知，且在基因组中只有一份拷贝的DNA短片段，200－400bp。
5SNP标记：
单核苷酸多态性标记。
第三代
由DNA序列同一位置上单个核苷酸变异产生的差别，包括单核苷酸的插入，缺失，置换。
与RFLP等不同的是，它不以DNA片段的长度变化作为检测手段，而直接以序列变异作为标记。
人类基因组中平均每1200bp就存在一个SNP。
优势：
1数量大，分布广2可靠性强3易于检测分析
十九：
外源基因导入细胞的方法
1转化2转染3显微注射4基因枪5电转化6脂质体导入
二十：
蛋白质工程
指在对蛋白质的结构和功能进行研究的基础上，人工改造和合成具有特定结构和功能的蛋白质的过程。
流程：
1从生物中分离纯化需要改造的蛋白2进行测序3核磁共振和X射线晶体衍射等手段分析空间结构4研究了解其空间结构的形成过程5改造蛋白质的编码基因，引入突变使蛋白的一级结构改变，表达后得到新的功能蛋白
6分离纯化产物蛋白
二十一：
发酵工程
1菌种选育：
一般为改造过的高产，生长快，易培养等优点的菌种
2菌种的大规模培养发酵（菌种扩增）：
需实时监控培养的条件变化。
3诱导菌种表达产物（产物生成）：
菌种数目增加到一定数量后诱导菌种表达产物
4菌种及产物的收获：
利用浓缩，吸附，离心，萃取，干燥，结晶等手段对微生物细胞收获，并从中分离纯化代谢物
二十二：
细胞工程
（一）动物细胞培养：
幼体组织剪碎，胰蛋白酶酶解，分离成单个细胞；分散的细胞转入含有碳源氮源和无机营养的培养液中进行原代培养（10代左右）和继代培养。
（二）植物细胞培养：
植物细胞具有全能性。
将幼株的组织分离出单个细胞，经过特殊培养生成愈伤组织，并进一步诱导生成完整的植株。
（三）细胞融合：
将不同种类的细胞经过处理后在病毒或者化学物的作用下促进其融合。
（四）细胞重组：
把不同种类的细胞器重新组合装配，包括核移植。
（五）单克隆抗体的制备
单克隆是指所以产生抗体的细胞都是同一个细胞的克隆，因此产生的抗体也完全相同。
1将特定的抗原注射到小鼠体内，并分离产生特异抗体的B淋巴细胞
2分离培养小鼠的骨髓瘤细胞
3两者进行融合并培养
4筛选出生成特异抗体的克隆。
这种重组细胞即有瘤细胞增殖迅速的特点，又可以产生特异的抗体
5体外体内培养，收获单克隆抗体。
二十三：
分子诊断及应用
分子诊断是指利用分子生物学技术和分子遗传学技术直接在DNA分子水平上检查疾病技术。
应用：
1利用PCR技术检查HIV（传染性疾病）
利用HIV的DNA特征序列先人工合成小片段引物，以受测者DNA样品为模板，进行PCR扩增。
如果获得与HIV的DN
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