水处理微生物学实验.docx

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水处理微生物学实验

2012．10．27水10—1、2班水处理微生物学实验

实验时间安排星期六（2012、10、27）

水1班上午8：

30---12：

00、水2班下午2：

30---6：

00.

每班又分为7小组，由班长把名单发到我的邮箱里hezhennana@）

四个实验一起做，动手能力强的可能3个小时就够了，动手弱的要5个多小时或更长，所以选着小组时搭配起来比较好，5人的合作很重要，做完一个实验就要交上实验报告，提前复习填好内容，实验后把图或数字填上才能进行下个实验。

）

实验一、普通光学显微镜的使用

标本图片、

结果：

（1）绘图说明你所观察到的菌片的形态特征。

讲解：

显微镜的使用。

低倍镜的使用、高倍镜的使用。

实验二、酵母菌的形态观察

自制观察标本图片、

结果：

（1）酵母菌死活细胞的检查

讲解：

压滴法制片

问题：

在酵母菌死、活细胞的观察中，使用美蓝染液有何作用？

酵母菌和细菌细胞在形态、结构上有何区别？

实验三、微生物细胞个数的直接计数法

讲解：

酵母菌悬液制作方法，

血球计数板的使用与清洗，显微镜计数方法、

实验报告：

（取液5个中方格共有80小方格）。

计数室

各中方格中微生物数目

微生物个数/ml

二室平均值

1

2

3

4

5

第一室

第二室

实验四、综合实验（无菌材料的灭菌前的准备与包扎、灭菌锅的消毒、样品的稀释液的制备、细菌的革兰氏染色）

标本：

大肠杆菌

涂片→干燥→固定→染色（初染→媒染→脱色→复染）→镜检

问题：

哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？

其中最关键的环节是什么？

水处理微生物学实验-能源与环境学院

实验一:

普通光学显微镜的使用方法

实验目的：

1熟悉光学显微镜基本结构和用途；

2掌握低倍镜、高倍镜使用方法;

3掌握使用显微镜观察微生物的形态；

实验内容：

1.光学显微镜的构造

（1）、机械系统部分。

（2）、光学系统部分。

（3）、照明系统部分。

2.光学显微镜的使用

取镜放镜对光放片调焦（粗调焦和细调焦）。

3.实验器材：

1显微镜、2玻片标本、3酵母菌、

4．载玻片、盖玻片、擦镜纸、5香柏油、二甲苯、

低倍镜的使用：

先将低倍物镜的位置固定好，然后放置标本片，转动反光镜，调好光线，将物镜提高，向下调至看到标本，再用细调对准焦距进行观察。

除少数显微镜外，聚光镜的位置都要放在最高点。

如果视野中出现外界物体的图像，可以将聚光镜稍微下降，图像就可以消失。

聚光镜下的虹彩光圈应调到适当的大小，以控制射入光线的量，增加明暗差。

高倍镜的使用：

显微镜的设计一般是共焦点的。

低倍镜对准焦点后，转换到高倍镜基本上也对准焦点，只要稍微转动微调即可。

虹彩光圈要放大，使之能形成足够的光锥角度。

稍微上下移动聚光镜，观察图像是否清晰。

油镜的使用方法：

（1）将标本置载物台上，用标本推进器固定，将标本移于接物镜下。

先用低倍镜找出标本位置，然后提高镜筒，在标本要观察的部位滴1滴香柏油后转换成油镜。

（2）从侧面观察并缓慢转动粗调节器，使镜头下移，直至油镜头浸没在油滴内接近玻片时为止。

将眼睛移至接目镜，一边观察，一边缓慢调节细调节器，使镜筒上升（只能上升，不能下降，以防压碎标本片和损坏油镜），待看到模糊物像后再缓慢调节细调节器，直至清晰看到染色菌片时为止。

使用油镜时需要在玻片上滴加香柏油，这是因为：

油镜的放大倍数远远高于透镜，至标本片透过的光线，因玻片和空气介质密度不同，而使部分光线经载玻片和空气折射后不能进入透镜，入射光线较少，物象不清晰。

在油镜和标本片之间滴加与玻璃折光率（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515），使进入油镜的光线增多，视野光亮度增强，物象清晰。

问题思考：

对颜色深的标本与颜色浅的标本在观察过程中有何不同？

如何根据观察对象使用镜头？

为什么先用低倍镜观察

实验二、酵母菌的形态观察

实验目的：

1、观察酵母菌的个体形态及出芽繁殖方式。

2、学习掌握区分酵母菌死、活细胞的染色方法。

实验原理：

酵母菌是单细胞的真核微生物，细胞核和细胞质有明显分化，个体比细菌大的多，酵母菌的形态通常有球状，椭圆状等多种。

酵母菌的无性繁殖有芽殖、裂殖和产生掷芽孢：

酵母菌母细胞在一系列的芽殖后，如果长大的子细胞与母细胞并不分离，就会行成藕节状的假菌丝。

实验器料：

1显微镜、2玻片标本、3酵母菌、接种针

4载玻片、盖玻片、擦镜纸、5香柏油、二甲苯、

制片方法：

取一洁净的载玻片，在载玻片同一位置滴加1滴酵母液和加一滴吕氏碱性美蓝染液，使菌体与染液均匀混合。

用镊子夹盖玻片一块，小心地盖在液滴上。

盖片时应注意，不能将盖玻片平放下去，应先将盖玻片的一边与液滴接触，然后将整个盖玻片慢慢放下，这样可以避免产生气泡。

将制好的水浸片放置观察台上镜检。

先用低倍镜后换高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。

问题：

1、在酵母菌死、活细胞的观察中，使用美蓝染液有何作用？

2、酵母菌和细菌细胞在形态、结构上有何区别？

实验三：

微生物细胞个数的直接计数法

实验目的：

1学习用血球计数板计酵母细胞数。

2学习测定酵母细胞死亡率。

实验器材：

酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管，吸水纸

基本原理：

利用血球计数板在显微镜下直接计数，直观、快速。

将经过适当稀释的菌悬液放在血球计数板与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。

由于计数室的容积是一定的，可根据观察到的数目换算成单位体积的总数目，此法计得的是菌的总数，故称总菌计数法。

血球计数板刻有两方格网，每网分九大方格，中间为计数室。

计数室为25×16（16×25）小方格。

计数时常数五个中格的总数，换算出1ml中的总共菌数。

死亡率测定的原理为：

美兰溶液是对细胞无毒性的、弱氧化性的染液，其氧化形态无色，还原态兰紫色。

活细胞具有还原能力，能将美兰溶液还原为无色，而死细胞不具还原能力。

血球计数板的使用方法

血球计数板是一块特制的厚型载玻片，玻片中央刻有四条槽，中央两条槽之间的平面比其它平面略低，中央有一小槽，槽的两边的平面上各刻有9个大方格。

中间的一个大方格为计数室，它的长、宽各为1mm，深度为0.1mm,容积为0.1mm3。

计数板的规格是把大方格分成25中格，每一中格分成16小格，总共也是400小格。

计算方法如下：

25×16计数板的计算：

细胞数/（ml）=

×400×10000×稀释倍数

计数原则：

计上不计下，计左不计右。

基本原理：

酵母菌是多形的、不运动的单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显的分化，菌体比细菌大。

繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。

本实验通过用美蓝染色制成水浸片。

操作步骤：

1．稀释:

将酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。

2．镜检计数室:

在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。

若有污物，则需清洗后才能进行计数。

3．加样品:

将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。

注意不可有气泡产生。

清洗血球计数板

使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，用手指肚轻轻搽洗，洗完后自行晾干或吹干。

镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。

若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。

显微镜计数方法：

静止3分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜查找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。

在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。

一般样品稀释度要求每小格内约有5―10个菌体为宜。

每个计数室要选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的菌体进行计数。

位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。

如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。

计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。

思考题：

（１）用血球计数板的误差主要来自哪些方面？

如何减少误差？

（２）为什么活细胞能使美兰脱色?

实验四、综合实验

实验目的：

细菌的革兰氏染色法

1．学习微生物的染色原理、染色的基本操作技术，

2．掌握微生物的一般染色和革兰氏染色法。

染色原理：

革兰氏染色原理：

一般细菌的机体是无色透明的，在显微镜下，由于光源是自然光，使微生物体与其背景反差小，不易看清微生物的形态和结构，若增加其反差，微生物的形态就可看得清楚。

通常用染料将菌体染上颜色以增加反差，便于观察。

革兰氏染色法是细菌学中很重要的一种鉴别染色法。

它可将细菌区别为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类。

它的染色步骤如下：

先用草酸铵结晶紫染色，经碘一碘化钾（媒染剂）处理后用乙醇脱色，最后用蕃红液复染。

如果细菌能保持草酸铵结晶紫与碘的复合物而不被乙醇脱色，呈紫色者叫革兰氏阳性菌。

被乙醇脱色用蕃红液复染后呈红色者为革兰氏阴性菌。

革兰氏染色法将细菌分为G＋和G-，这由两类细菌细胞壁的结构和组成的不同而决定。

用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。

碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫-碘的复合物，增强了染料与菌体的结合力。

用乙醇脱色处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。

G＋细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，且壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低，使得结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。

虽经洗脱和复染仍然保持初染剂的蓝紫色。

G-细菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以在脱色处理时，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的颜色。

仪器和材料菌种：

大肠杆菌、

显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、吸管、载玻片、酒精灯

革兰氏染色剂：

1）草酸铵结晶紫染色液。

2）碘液。

3）酒精。

4）番红染色液。

实验步骤

（1）革兰氏染色步骤：

1.涂片:

对于活性污泥，用滴管取其一滴置于玻片上铺成一薄层即可。

2.干燥最好在空气中自然晾干，为了加速干燥，可在微小火焰上方烘干。

但不宜在高温下长时间烤干，否则急速失水会使菌体变形。

3.固定将已经干燥的涂片正面向上，在微小的火焰上通过2～3次，由于加热使蛋白质凝固而固着在载玻片上。

4.用草酸铵结晶紫染液，染色lmin，水洗。

5.滴加革兰氏碘液媒染lmin、水洗。

6.斜置玻片于烧杯上端，滴加95％乙醇脱色并轻轻摇动载玻片。

直洗至流出乙醇刚刚不出现紫色时即停止（约20~30s），脱色完毕后，水洗，滤纸吸干。

7.滴加沙黄染液复染lmin。

水洗，滤纸吸干后，备镜检。

问题绘图：

1．染色后观察到的大肠杆菌的形态图。

2.革兰氏染色过程中，哪些因素是成败关键，为什么?

实验四、综合实验

操作总体步骤：

包扎标记：

提取细菌并稀释→革兰氏染色→形态观察（油镜观察的使用）

结果：

1.根据观察结果，绘出大肠杆菌革兰氏染色后的形态图。

2. 为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?

3.在进行菌液稀释时要注意什么问题？

一、美蓝浸片观察

酵母菌菌液的配制：

干酵母粉1克、蔗糖10克、蒸馏水100毫升混合均匀，7小时可用到3天。

基本原理：

酵母菌是多形的、不运动的单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显的分化，菌体比细菌大。

繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。

本实验通过用美蓝染色制成水浸片，和水-碘水浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。

美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对酵母的活细胞进行染色，由于细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色，而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。

因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。

但美蓝的浓度、作用时间等均有影响，应加注意。

器材：

酵母；0．1％吕氏碱性美蓝染液，革兰氏染色用的碘液；

显微镜，载玻片，盖玻片等。

吕氏碱性美蓝染色液：

美蓝0.3g、95%乙醇30ml、0.01%氢氧化钾溶液100ml、将美蓝溶解于乙醇中，然后于氢氧化钾溶液混合。

染色法：

将涂片在火焰上固定，待冷却后滴加染液，染1min~3min，水洗，待干，镜检。

（1）在载玻片中央加一滴0．1％吕氏碱性美蓝染液，滴不可过多或过少，以免盖上盖玻片时，溢出或留有气泡。

然后按无菌操作法取在酵母菌少许，放在吕氏碱性美蓝染液中，使菌体与染液均匀混合。

（2）用镊子夹盖玻片一块，小心地盖在液滴上。

盖片时应注意，不能将盖玻片平放下去，应先将盖玻片的一边与液滴接触，然后将整个盖玻片慢慢放下，这样可以避免产生气泡。

（3）将制好的水浸片放置3分钟后镜检。

先用低倍镜观察，然后换用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。

（4）染色半小时后，再观察一下死细胞数是否增加。

二、显微镜的使用

（1）、低倍镜观察：

先将低倍物镜的位置固定好，然后放置标本片，转动反光镜，调好光线，将物镜提高，向下调至看到标本，再用细调对准焦距进行观察。

除少数显微镜外，聚光镜的位置都要放在最高点。

如果视野中出现外界物体的图像，可以将聚光镜稍微下降，图像就可以消失。

聚光镜下的虹彩光圈应调到适当的大小，以控制射入光线的量，增加明暗差。

（2）、高倍镜观察：

显微镜的设计一般是共焦点的。

低倍镜对准焦点后，转换到高倍镜基本上也对准焦点，只要稍微转动微调即可。

虹彩光圈要放大，使之能形成足够的光锥角度。

稍微上下移动聚光镜，观察图象是否清晰。

（3）、油浸镜观察：

油浸镜的工作距离很小，所以要防止载玻片和物镜上的透镜损坏。

使用时，一般是经低倍、高倍到油浸镜。

当高倍物镜对准标本后，再加油浸镜观察。

载玻片标本也可以不经过低倍和高倍物镜，直接用油浸镜观察。

对准焦点的方法是从显微镜的侧面观察，将油浸镜下移到与载玻片稍微接触为止，然后用微调向上提升调准焦点。

使用油浸镜时，镜台要保持水平，防止油流动。

油浸镜所用的油要洁净，聚光镜要提高到最高点，并放大聚光镜下的虹彩光圈否则会降低数值口径而影响分辨率。

普通显微镜的保养：

显微镜是精密贵重的仪器，必须很好地保养。

1、观察完后，移去观察的载玻片标本。

2、用过油浸镜的，应先用擦镜纸将镜头上的油擦去，再用擦镜纸蘸着二甲苯擦拭2—3次，最后再用擦镜纸将二甲苯擦去。

3、转动物镜转换器，放在低倍镜的位置。

4、将镜身下降到最低位置，调节好镜台上标本移动器的位置，罩上防尘套。

镜头的保护最为重要。

镜头要保持清洁，只能用软而没有短绒毛的擦镜纸擦拭。

擦镜纸要放在纸盒中，以防沾染灰尘。

切勿用手绢或纱布等擦镜头。

物镜在必要时可以用溶剂清洗，其中最安全的是二甲苯。

方法是用脱脂棉花团蘸取少量的二甲苯，轻擦，并立即用擦镜纸将二甲苯擦去，然后用洗耳球吹去可能残留的短绒。

三、酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管。

大肠杆菌的菌液：

取自来水让学生打球后洗手，放爆气池加入葡萄糖，12小时后过滤备用。

1．稀释:

将酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。

2．镜检计数室:

在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。

若有污物，则需清洗后才能进行计数。

3．加样品:

将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。

注意不可有气泡产生。

四、血球计数板的使用方法

血球计数板是一块特制的厚型载玻片，玻片中央刻有四条槽，中央两条槽之间的平面比其它平面略低，中央有一小槽，槽的两边的平面上各刻有9个大方格。

中间的一个大方格为计数室，它的长、宽各为1mm，深度为0.1mm,容积为0.1mm3。

计数板的规格是把大方格分成25中格，每一中格分成16小格，总共也是400小格。

计算方法如下：

25×16计数板的计算：

细胞数/（ml）=

×400×10000×稀释倍数

计数原则：

计上不计下，计左不计右。

清洗血球计数板

　使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，用手指肚轻轻搽洗，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。

镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。

若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。

五、显微镜计数方法：

静止5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。

在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。

一般样品稀释度要求每小格内约有5―10个菌体为宜。

每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的菌体进行计数。

位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。

如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。

计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。

六、革兰氏染色详细步骤

1 涂片 ；取一洁净的载玻片，用特种笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴一小滴蒸馏水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片，干燥、固定。

玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。

2 初染 ；滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）于两个玻片的涂面上，染色1min，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。

3 媒染 ；用革兰氏碘液媒染约l min ，水洗。

4 脱色 ；用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩净。

  革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。

脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。

脱色时间一般约20～30s。

5 复染 ；在涂片上滴加番红液复染约1min ，水洗，然后用吸水纸吸干。

在染色的过程中，不可使染液干涸。

6 镜检 ；干燥后，用油镜观察。

判断两种菌体染色反应性。

菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G+），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。

7 实验结束后处理 ：

清洁显微镜。

先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少许二甲苯擦去镜头上的残留油迹，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯。

染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗，凉干后备用。

七、灭菌详细步骤：

包扎标记：

要灭菌的水放入的三角瓶中，移液管10ml、1ml各一个、试管6个、包上一层防潮纸，用棉绳系好，在包装纸上标明备制组。

灭菌注意：

1：

按规定条件及时进行灭菌。

普通的为121度20分钟。

以保证灭菌效果。

2：

首先将内层灭菌桶取出,再向外层锅内加入适量的水,使水面与三角搁架相平为宜。

3：

放回灭菌桶,并装入待灭菌物品。

注意不要装得太挤,以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。

三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触,以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。

4：

加盖,打开底下放气阀，同时检查排气阀和安全阀。

5：

通电，调节合适参数，加热。

待冷空气完全排尽后,关上放气阀,让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。

当锅内压力升到所需压力时,控制热源,维持压力至所需时间。

本实验用1．05kg/cm2,121.3℃,20分钟灭菌。

6：

灭菌所需时间到后,切断电源或关闭煤气,让灭菌锅内温度自然下降,当压力表的压力降至0时,打开排气阀,旋松螺栓,打开盖子,取出灭菌物品。

如果压力未降到0时,打开排气阀,就会因锅内压力突然下降,使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口,造成棉塞沾染培养基而发生污染。

八、菌液稀释步骤：

稀释原液：

取6个灭菌空试管，分别加入9ml灭菌水。

取1ml原液注入第一管9ml灭菌水内，摇匀，再自第一管取1ml至下一管灭菌水内，如此稀释到第6管，稀释度分别为10-1～10-6。

3自最后三个稀释度的试管中选取一滴稀释水加入载玻片上。

九、革兰氏染色

十、显微镜的形态观察