甘草酸实验报告之欧阳主创编.docx

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甘草酸实验报告之欧阳主创编

甘草酸的提取、纯化、测定及残渣中甘草多糖的提取分离测定

时间：

2021.02.17

创作：

欧阳主

实验报告

学院：

生物科学与工程学院

班级：

姓名：

学号：

组别：

第七组

组员：

一、实验目的

1.掌握甘草酸提取、纯化的原理和方法，了解甘草酸定量测定方法。

2.掌握多糖类的提取及测定方法。

3.熟悉皂甙的性质。

4.进一步熟悉物质提取与纯化的技术，掌握相关原理。

二、实验器材

1.试剂：

70%的乙醇、0.6%的稀氨水、3.5mol/l的浓硫酸、XAD9型树脂、6%盐酸、50%乙醇、95%乙醇、苯酚、铝片、碳酸氢钠、葡萄糖、标准甘草酸等。

2.器材：

紫外分光光度计、石英比色皿、旋转蒸发仪、真空抽滤机、恒温水浴锅、1000ml量筒、玻璃棒、烧杯、纱布、玻璃漏斗、滤纸、烧杯等。

三、实验原理

1.甘草简介

甘草是蝶形花科（Fabaceae）、甘草属（Glycyrrhiza）植物，甘草地下部分是名贵中药材，地上部分是多年生牧草。

甘草具有抗寒、耐热、耐旱、抗盐碱等优良特性，适生性和抗逆性强，生命力旺盛，为干旱、半干旱地区重要的植物资源之一。

早甘草味甘、性平，有补脾益气、止咳祛痰、清热解毒的功能，用于脾胃虚弱、中气不足、咳嗽气喘、解毒等病症。

现代研究表明，甘草还有肾上腺皮质激素样的作用，可治慢性肾上腺皮质机能低下症和胃、十二指肠溃疡，近年来又发现甘草可抗癌和防治艾滋病，又是预防和治疗SARS的复方组份之一。

甘草的主要有效成分为甘草酸（glycyrrhizicacid）及甘草次酸（glycyrrhetinicacid）等三萜类化合物、甘草黄酮类化合物以及甘草多糖等。

药理研究表明，甘草酸及甘草次酸具有解毒、消炎、镇痛、抗肿瘤的作用。

近年来，还用于防治病毒性肝炎、癌症以及艾滋病等。

甘草酸约占甘草根茎的3-14%，分子式为C42H62O16，分子量822.92，熔点212ºC-217ºC，其结构式为五环三萜皂甙，结构图如图1-1所示：

图1-1甘草酸结构分子式

纯品甘草酸为白色针状晶体，不溶于冷水，可溶于热水，故溶于热水后，经冷却则呈胶体状沉淀析出。

加热、加压及在稀酸作用下可水解为一分子甘草次酸和两分子葡萄糖醛酸。

甘草次酸与单葡萄糖醛酸结合成甘草酸苷元单葡糖苷酸（MGGR）。

2.甘草酸的提取方法

2.1水提法

水提法是最为古老、也是最为常用的一种提取方法。

其操作简单，溶剂成本低廉，但得率较低，按1990年版中国药典中含量测定方法测得甘草酸得率仅约3.0%。

据推测可能是因为水提法提取出的杂质较多，在去除杂质的过程中夹带了甘草酸，损失较大。

工艺流程如1-2所示：

图1-2水提法提取甘草酸的工艺流程

2.2稀氨水提取法

甘草酸成铵盐后水溶性增加可增加提取率。

稀氨水提取法常采取冷渗的方法。

工艺流程如下：

图1-3稀氨水提法工艺流程1.4.2.3氨性醇提取法

在对甘草提取工艺的研究中，发现用含氨0.8%的65%乙醇回流提取乌拉尔甘草的效果优于含氨0.6%的65%乙醇和0.6%的氨水，甘草酸的得率达21%，比水提法提高了两倍以上，节省了资源，降低了成本，也避免了糖类、淀粉等大量水溶性杂质的混入，便于精制。

如果能够解决加热回流过程中氨气逸出造成的污染问题，氨性醇提取法将成为一种较为理想的方法。

工艺流程如图1-4所示。

图1-4氨醇溶液提取甘草酸的工艺流程

2.3超声波提取法

谢果等研究了超声条件下不同因素对甘草酸得率的影响，通过选择，可以得到最佳提取工艺：

溶剂为70%乙醇溶液、超声频率为18kHz、浸泡时间为90min、粒度为18~20目，在此工艺进行提取，甘草酸的提取率可以达到87.4%。

3甘草酸的分离与纯化

3.1超滤法

将甘草提取液酸析后所得的粗品用氨水溶解，然后在一定的压力下进行超滤，滤液浓缩干燥得甘草酸铵。

3.2结晶法

结晶法是利用甘草酸转化为铵盐后在某些特定溶剂中溶解度下降而结晶出来，达到纯化的目的。

较为常用的有晶种法和反复结晶法。

晶种法是先将甘草提取液进行酸析，再用适量甲醇回流提取沉淀物，提取液氨化后减压蒸干得糖浆状物，趁热加入适量冰醋酸使溶解、静置，投入甘草酸单铵盐晶种，隔日吸滤，冰醋酸洗涤，减压蒸干即得甘草酸单铵盐。

反复结晶法是先将甘草提取液进行酸析，再经乙醇或丙酮溶解提取，氨化成盐析出，再经活性炭脱色，反复重结晶得纯品。

3.3树脂法

树脂法包括离子交换树脂法和大孔吸附树脂法，两种方法均是利用甘草酸与杂质理化性质的不同，通过吸附和解吸附的过程，达到纯化的目的。

离子交换树脂法：

因为甘草酸中含有3个羧基，可与阴离子交换树脂上的阳离子结合而吸附在树脂上，其他一些非酸性的杂质不被吸附，从而得以与这些杂质分离。

日本专利中以弱碱性树脂DuoliteA374吸附甘草酸水提液，再用2.0%氨水洗脱即得铵盐产品。

原苏联专利是先用阴离子交换树脂AB-6G富集甘草酸，再用弱酸性阳离子交换树脂除去铵离子，从而得到高纯度的产品。

大孔吸附树脂法：

大孔吸附树脂法是一种较为经济实用的方法。

通常选用的树脂有AmbliteXAD4,XAD8,XAD9,XAD11,DA201以及AB-8等。

姚德佳等用以苯乙烯和二乙烯苯为骨架，由丙烯腈组成的主链上带有CN基的DA-201型大孔树脂柱吸附，以水或稀的低级醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂后得到的甘草酸纯度可90.0%以上。

4.多糖提取方法

种类繁多的植物多糖，存在于植物中的部位不尽相同。

一般植物细胞壁比较牢固，在提取前需进行专门的破细胞操作，包括机械破碎（研磨法、组织捣碎法、超声波法、压榨法、冻融法）、溶胀和自胀、化学处理和生物酶降解。

因此，植物多糖提取的研究中采用了许多不同的方法，包括溶剂提取法、酸提法、碱提法、酶解法、超滤法、超声波强化法、微波法。

本实验中采用的是最常用的方法-------溶剂提取法.

溶剂提取法一般应遵循相似相溶的原则。

多糖是极性大分子化合物，在所有溶剂中，水、乙醇是典型的强极性溶剂，对植物组织的穿透力强，提取效率高，在生产上使用安全。

5．多糖含量测定

糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量。

四、实验内容及步骤

1.甘草酸的提取（稀氨水提取法）

1.1用粉碎机将甘草片粉碎，称取20g甘草粉，加0.6%的稀氨水300mL,在沸水浴中加热60min,过滤，分别收集滤液和滤渣。

1.2将滤渣加300ml稀氨水重复浸提两次，合并滤液，记录滤液体积。

1.3测定提取液中的甘草酸含量：

a.制作标准曲线

精密称取甘草酸标准品10.00mg，置于10ml容量瓶中，加70%乙醇溶解并定容。

精密吸取0.50ml、0.75ml、1.00ml、1.25ml、1.50ml，分别置于25ml容量瓶中，加70%乙醇摇匀定容，静置20min，在波长254nm处测定吸光值。

b.测定甘草酸含量

将提取液摇匀，准确移取一定量的提取液转移到25ml容量瓶中，用70%乙醇定容，静置20min后，于254nm处测定吸光度。

据标准曲线计算提取液中甘草酸的浓度，再计算甘草酸提取率。

计算公式如下：

A=13.17C—0.017（参考）

式中：

A-吸光度；

C-浓度，mg/ml

甘草酸提取率=nCV/m×100%

其中：

n-提取液稀释倍数

C-提取液中甘草酸的浓度mg/ml

V-提取液体积ml

m-甘草的质量mg

将提取液减压浓缩至200ml，滴加3.5mol/l的硫酸至pH2～3，静置使之完全沉淀，离心（拟定为3000r/min10min），沉淀用去离子水洗2～3次，放入真空干燥箱中干燥，得甘草酸粗品。

2.甘草酸的纯化（大孔树脂吸附法）

2.1取甘草酸粗品（2，53g）,加热使之溶于700mL的水中。

2.2将甘草酸溶液与XAD9型树脂（25g活化树脂）混合,静态吸附2h,用四层纱布过滤，取其滤液，并进行抽滤。

2.3滤渣（树脂）用300mL50%乙醇溶液搅拌洗脱2h。

2.4滤液进行减压蒸发浓缩至干,称重，即得到纯化后的甘草酸。

2.5洗脱液中甘草酸含量的测定：

方法如实验一

3.残渣中甘草多糖的提取分离（溶剂提取法）

3.1称取1g甘草酸残渣，加50ml60℃，在60℃恒温水浴锅中浸提3h。

3.2加95%的乙醇至乙醇终浓度为80%，放置过夜沉淀。

3.3将过滤残渣连同滤纸一起干燥，置于烧杯中，加蒸馏水50mL，分别在60℃水浴锅中加热30min。

3.4溶液趁热过滤，残渣用5mL热水洗涤3次，洗液并入滤液，放冷后移至100mL容量瓶中，稀释至刻度，得甘草多糖样液，备用。

3.5甘草多糖的测定

制备葡萄糖标准液：

取适量葡萄糖在105℃中干燥至恒重，然后精密称取100mg，置100mL容量瓶中，加蒸馏水溶解，并稀释至刻度。

此葡萄糖标准溶液浓度为1.0mg/mL。

制备苯酚液：

取苯酚100g，加铝片0.1g，碳酸氢钠0.05g。

再取以上混合物10.0g，加蒸馏水150ml，置于棕色瓶中备用。

制作标准曲线：

吸取葡萄糖标准液1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL、7.0mL、8.0mL、9.0mL、10.0mL，分别置于100mL容量瓶中，加蒸馏水定容。

吸取上述溶液各2.0mL，再加苯酚液1.0mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0mL，摇匀后放置5min，置沸水浴中加热15min，取出后冷却至室温，于490nm处以蒸馏水作参比测吸光度，绘制标准曲线。

测定甘草样品中多糖含量：

量取浸提后的样液2ml，用10ml容量瓶定容。

吸取稀释后的溶液2ml，按照标准曲线方法操作，测定吸光度，计算样品中多糖含量。

五、实验数据及处理

1.甘草酸标准曲线

2.测定样品甘草酸浓度，计算甘草提取率

将提取液摇匀，准确移取0.125ml的提取液转移到25ml容量瓶中，用70%乙醇定容，静置20min后，于254nm处测得吸光度0.636，代入方程y＝12.11x＋0.006中，可以得出稀释后的提取液中甘草酸浓度C=0.052mg/ml，

再由公式：

甘草酸提取率=nCV/m×100%

其中，稀释倍数n=200，总提取液的体积285ml，称取干草的质量为20g

求得甘草酸提取率为14.82％。

3.甘草酸粗品质量

经干燥后得甘草粗品2.53g。

4.洗脱液中甘草酸的含量测定

将洗脱液，用70％乙醇作对照，测得洗脱液的OD为0.043，代入方程y＝12.11x＋0.006中，计算出纯化后的甘草酸浓度为0.00308mg/ml

5.纯化后甘草酸的质量2.132g

葡萄糖标准曲线：

测定甘草残渣中多糖含量

将溶液稀释5倍后测得其OD值为0.195，求得甘草中多糖含量为：

6.4755mg/ml

六、实验结论及误差分析

实验结论：

1.用稀氨水提取法提取甘草酸的提取率为14.82％，提取液中甘草酸含量为0.052mg/ml，得甘草酸粗品2.53g。

2.用大孔树脂吸附法纯化甘草酸，洗脱液中甘草酸浓度为0.00308mg/ml，纯化后甘草酸的质量为2.132g。

3.用苯酚硫酸法测得甘草中多糖含量为6.862mg/ml。

误差分析：

1.在进行甘草酸提取时，浸提时间不够，甘草酸没有完全浸提出。

2．滤渣重复浸提次数过少，致使部分甘草酸损失在残渣中。

3.减压浓缩时间过段，未能得到体积合适的浓缩液。

4.离心转速和离心时间设置的不合理，致使部分甘草酸在离心时有损失。

5.活化树脂时间不够，不能有效的吸附甘草酸。

6.对树脂抽滤时树脂有损失，致使被树脂吸附的甘草酸也有损失。

7.在对甘草酸抽滤、离心时，残渣有损失，残渣中的多糖也有损失。

8.残渣洗涤不充分，部分多糖滞留在洗涤后的残渣中。

9.测定多糖含量时，水浴后未经冷却便进行OD测定，致使测定结果不准确。

时间：

2021.02.17

创作：

欧阳主