DNA甲基化检测技术应用及技术比较.docx

DNA甲基化检测技术应用及技术比较.docx

《DNA甲基化检测技术应用及技术比较.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DNA甲基化检测技术应用及技术比较.docx（13页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

DNA甲基化检测技术应用及技术比较

DNA甲基化检测技术应用与技术比较

DNA甲基化作为表观遗传学研究的重要范围，已经越来

越碰到研究者的关注。

近些年来，随着DNA甲基化与组蛋白甲基化的结合作用体系、RNA搅乱体系及去

甲基化体系的发现，使得DNA甲基化研究碰到广泛关注，从医学领域扩展到动植物研究中间，同时在研究方法上也获取了很大的打破。

现在用于DNA甲基化检测

的方法大概有十多种，从应用上来分，大概能够分成两类：

全基因组甲基化解析及特异位点甲基化检测。

下面，我们就这两大类检测技术进行解析比较，以便于在实质的科研工作中进行选择。

一、全基因组甲基化检测技术

1.基于芯片平台的全基因组甲基化优选

芯片平台作为目前比较成熟的优选工具，已经在很多领域有

了相应的应用。

多家芯片公司在DNA甲基化这块儿有了相

应的产品供应，其中应用最为广泛的就

Agilent平台和Illumina平台，相应的产品包括Agilent

HumanCpGIslandMicroarray

Kit，InfiniumHumanMethylation27BeadChip和Infinium

HumanMethylation450K

BeadChip。

其他RocheNimbleGen和Affymetrix也有相应的芯片推出，但是NimbleGen的芯片今年下半年已经停产。

不一样的芯片平台，各自的实验过程也是不同样的。

安捷伦前

期采用的甲基化DNA免疫共积淀〔MeDIP〕技术。

将基因组DNA分成两份，一份用来做

MeDIP，另一份作为比较。

两个样品都标记荧光（富集的样品

用Cy5标记，比较用Cy3标记），尔后与芯片杂交。

芯片上每个探针的Cy5/Cy3强度比

例显示出该地域的甲基化程度。

安捷伦公司芯片平台因其富强的eArray进行芯片的定制。

在甲基化领域同样合用。

探针设计平台，能够

Agilent平台因为MeDIP技术自己的特点，都不能够到达单碱

基的分辨率，而Illumina的Infinium和GoldenGate检测技

术却做

获取。

Illumina的Infinium甲基化检测技术本源与先期的SNP检测，采用的是单碱基延伸的原理。

解析利用两个位点特异的探针检测这些序列差

异的位点，一个探针是为甲基化位点（M磁珠种类）设计的，而另一个是为未甲基化位点（U磁珠种类）设计的。

探针的单碱基延伸掺入了一个标记的ddNTP，

它随后被荧光试剂染色。

经过计算甲基化与未甲基化位点的

荧光信号比率，可确定检测位点的甲基化水平。

Illumina公

司早期推出的Infinium

HumanMethylation27

BeadChip芯片覆盖27,578个CpG位点。

这款芯片在医学

领域有广泛的应用，除了和肿瘤相关的甲基化优选之外，也

能用于其他疾病相关甲基化检

测。

因此对这款产品，研究者恩赐了很高的议论，目前此产

品已停产，取而代之的是InfiniumHumanMethylation450

BeadChip芯片。

它以单碱基分辨率覆盖了基因组中高出45

万个甲基化位点，实现了基因地域和CpG岛的全面覆盖。

其他，还包括CpG岛之外的CpG

位点，在人类干细胞中判断出的非CpG甲基化位点，以及

肿瘤和正常组织中差异表达的甲基化位点等等。

它的高覆盖

度、高通量以及低价格，让它成为进行全基因

甲基化优选的有力武器。

对照之下，VeraCode

GoldenGate甲基化解析技术更适合中通量的优选及考据研

究，它以以矩阵微珠芯片（SentrixArray

Matrix（SAM）〕形式解析48至384个用户指定的CpG位点。

第一，将亚硫酸氢盐办理的基因组DNA

与解析oligo混杂，oligo与未甲基化位点的U互补，也许与

甲基化位点的C互补。

杂交此后，引物延伸，并连接上位点

特异的oligo来产生通用

PCR的模板。

最后，用标记的PCR引物生成可检测的产物。

据Illumina的产品专家介绍，其产品的最大优势在于单个

CpG位点的分辨率。

其他解析将

甲基化定位在一段地域，而经过Illumina解析，你能精确测

定某个CpG位点的甲基化水平。

2.基于高通量测序平台的甲基化图谱解析

随着二代测序技术的告诉睁开，测序本钱大幅度下降，使得

真切实现全基因组甲基化解析的研究成为可能。

随着人类甲

基化图谱绘制成功，已经陆续有多个物种的甲

基化图谱成立完成。

研究者将传统的DNA甲基化检测方法，

如亚硫酸氢盐转变与高通量测序相结合，能够实现单碱基精

度的甲基化图谱的成立。

其他将成熟的

MeDIP技术与二代测序相结合，能够快速有效地搜寻基因组

上的甲基化地域，从而比较不一样细胞、组织、甚至疾病样本间的DNA甲基化修饰模式的差异。

因此

该技术也特别合用于大样本量的疾病表观研究。

第三代测序技术的出现，更是让甲基化的直接测定成为可

能。

一年前，美国PacificBiosciences公司利用独有的单分子实时（SMRT）测序技术，直接测定了DNA的甲基化。

这项成就公布在?

NatureMethods?

杂志上。

二、特异位点甲基化检测技术应用比较

1.甲基化特异性PCR〔MS-PCR〕

DNA在亚硫酸氢盐作用后，

CpG假设无甲基化，那么序列中的

保持不变，因此从理论上讲，

DNA

C改变成U，假设有甲基化那么

用不一样的引物做PCR，即可检

测出这种差异，从而确定基因有无CpG岛

甲基化。

因此依照目的基因修饰前后的改变，便能够相应设计M和U引物，有时我们需要设计两轮引物。

这种方法矫捷度高，无需特别仪器，因此经济合用，是目前应用最为广泛的检测方法。

但是也存在必然的限制性，起初需要知道待测片段的DNA序列，引物的设计特别重要。

其他，亚硫酸氢盐办理也十分要点，假设办理不完好那么可能以致假阳性的出现。

2.亚硫酸氢盐测序PCR（BSP）

这种方法一度被认为是DNA甲基化解析的金标准。

它的过

程以下：

经过亚硫酸氢盐办理后，设计引物进行PCR扩增

目的片段，并对PCR产物进行克隆测序，将

序列与未经办理的序列进行比较，判断CpG位点可否发生

甲基化。

这种方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每

一个CpG位点的甲基化状态，但因为涉及到

测序，其结果正确但要求克隆时所挑克隆很多，操作繁琐，

不易大批量操作。

其他，甲基化程度的定量依赖于优选克隆

的数目，因此这种方法只能算得上是一种半定

量的技术方法。

目前一般会先用BSP找到甲基化位点，尔后依照甲基化位点设计MSP引物，进行相应PCR条件探究，以用于大批样本的优选。

3.甲基化敏感性高分辨率熔解曲线解析（MS-HRM）

经过熔解曲线解析能够将单碱基序列的差异转变成熔解曲

线的差异，因此DNA样本经过亚硫酸氢盐办理后，甲基化与未甲基化DNA会存在序列差异，这种差异可

经过熔解曲线解析来发现。

使用该方法进行甲基化解析仅需一对引物，相对简单，但是这种方法对仪器的要求颇高，需要带HRM模块的荧光定量PCR仪，并且在

进行实时定量PCR过程中，需要使用饱和的荧光染料。

利

用MS-HRM技术进行甲基化检测只能对检测片段整体甲基

化情况进行解析，其实不能够明确每个CpG位

点的甲基化状态。

因此这种技术合用于大批样本的检测，优选出感兴趣的CPG位点，尔后利用其他方法进行单个位点的精确检测及甲基化程度的精确定量。

4.结合亚硫酸氢钠的限制性内切酶解析法〔COBRA〕

这种方法是将亚硫酸氢盐办理与酶切相结合来进行甲基化

检测。

DNA样本经亚硫酸氢盐办理后，利用PCR扩增。

扩

增产物纯化后用限制性内切酶〔BstUI〕

消化。

假设其鉴别序列中的C发生完好甲基化（5mCG5mCG），

那么PCR扩增后保存为CGCG，BstU

I能够鉴别并进行切割；假设待测序列中，C未发生甲基化，

那么PCR后转变成TGTG，BstUI鉴别位点丧失，不能够进行切割。

这样酶切产物再经电泳分别、探

针杂交、扫描定量后即可计算出原样本中甲基化的比率。

这种方法最大的优点就是相对简单，可进行快速定量，且需要的样本量少。

但是，它的限制性也十清楚显，只能获取特别酶切位点的甲基化情况，且阴性结果其实不能够消除样品DNA中存在甲基化的可能。

5.荧光定量法〔Methylight〕

这种技术是在MSP技术上睁开起来的，在MSP扩增过程中

利用荧光染料进行定量。

TaqMan?

探针法的应用使得该技术拥有更高的精确性。

其原理与SNP

检测近似，针对亚硫酸氢盐办理此后的DNA片段，在甲基化位点上会存在单碱基的差异，依照这种差

异进行探针设计，随后进行实时定量PCR，便能够检测甲基化的差异。

这种方法最大的优势在于其高敏感性和较高通量，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减

少了污染和操作误差。

但是TaqMan?

探针订购花销较高，合用于少量位点大批样本优选。

6.焦磷酸测序（Pyrosequencing）

随着技术的不断改良，现在认为焦磷酸测序技术

（Pyrosequencing〕是甲基化检测新的金标准。

焦磷酸测序作为一种新的序列解析技术，能够快速地

检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测，为甲基化研究供应了新的路子。

在序列延伸过程中，依照C和T的掺入量来定量确定单个位点的

C-T比率。

因此，不一样位点的甲基化变异就能被正确检测，

并给出精确的甲基化程度的数据。

QIAGEN公司在焦磷酸测序的应用上拥有明显的优势，目前供应三种焦磷酸测序仪器，通量由低到高，适合不一样的应用。

PyroMarkQ24

的强处在于可对多达24个样品进行焦磷酸测序。

需要大样

品量的应用更适合在PyroMarkQ96ID

进步行。

在考虑到办理不计其数个样品所需的大批试剂时，

运行通量最大化可能会使实验本钱变得很高。

而PyroMark

Q96

MD装有一台高度矫捷的光检测摄像头，能够在减少试剂量的情况下对少量的DNA模板进行正确测序。

这些不一样平台的推出，对于我们实质研究供应了更有效的检测手段。

诚然焦磷酸测序能够进行单个位点甲基化程度的精确定量，

但是目前来看，测序的片段长度还比较短，只有一百多bp，其中有效长度约为60bp。

以上是对几种常用的特异位点甲基化检测方法进行了介绍及比较，还有一些检测技术是在常用的检测手段进步行优化

也许将不一样的方法进行结合应用，比方以MSP

方法为基础，睁开了SMART-MSP技术，该技术利用定量

技术对MSP扩增过程进行检测，同时后续结合HRM技术来

解析甲基化差异。

其他，利用质谱平台

进行甲基化检测的有MALDI-TOF技术，能够对甲基化进行

精确检测并能进行高通量优选。

从对这些技术的比较解析来

看，没中检测技术都有各自的优点，并也存在必然的限制性，

研究者能够依照自己的实质研究情况进行选择。