愈伤组织培养-3.ppt

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第四章第四章愈伤组织培养愈伤组织培养主要内容主要内容:

材料的制备材料的制备愈伤诱导与分化愈伤诱导与分化形态发生形态发生愈伤的培养愈伤的培养第一节第一节植物材料（外植体）的制备植物材料（外植体）的制备1.一般植物组织都能诱发愈伤组织。

一般植物组织都能诱发愈伤组织。

诱导愈伤组织的诱导愈伤组织的成败关键成败关键主要不是实验材料，而主要不是实验材料，而是是培养培养条件，其中条件，其中激素激素的成分和浓度是最重要的的成分和浓度是最重要的因素。

因素。

双子叶植物为最多，单子叶植物双子叶植物为最多，单子叶植物（1990s），此外，此外，裸子植物、蕨类和藓类植物也有诱发成功的例子。

裸子植物、蕨类和藓类植物也有诱发成功的例子。

:

2.2.材料必须完全无菌材料必须完全无菌微生物微生物一旦与培养基接触，就迅速繁殖，一旦与培养基接触，就迅速繁殖，抑制抑制愈伤组织的生长。

愈伤组织的生长。

用用抗菌素抗菌素来抑制微生物的生长，在来抑制微生物的生长，在短时间短时间有效，有效，而且抗菌素只能对而且抗菌素只能对一定谱系一定谱系中的细菌才产生作中的细菌才产生作用，该谱系以外的微生物仍然可以大量繁殖。

用，该谱系以外的微生物仍然可以大量繁殖。

抗菌素还可能抗菌素还可能抑制植物组织的生长抑制植物组织的生长。

得到无菌材料，植物组织必须得到无菌材料，植物组织必须先进行消毒先进行消毒。

有好几种有好几种化学试剂化学试剂都能起到都能起到表面消毒表面消毒的作的作用，试剂的选择及处理用，试剂的选择及处理时间的长短时间的长短要根据要根据材料对试剂的敏感性材料对试剂的敏感性来决定。

来决定。

一般都采用在消毒后能很容易去除的药剂。

一般都采用在消毒后能很容易去除的药剂。

因为因为消毒剂消毒剂对植物细胞也有对植物细胞也有杀伤作用杀伤作用，若，若不去除就会不去除就会妨碍妨碍愈伤组织的愈伤组织的发生发生。

例如用无菌水例如用无菌水反复冲洗反复冲洗后可以把大部分药后可以把大部分药剂都洗掉，或者能剂都洗掉，或者能自动分解变成低毒性自动分解变成低毒性物物质。

质。

本氯酸钠本氯酸钠能分解成为具有杀菌效能的能分解成为具有杀菌效能的氯气氯气，然，然后就后就散失到空气散失到空气中。

中。

低浓度的氯化汞低浓度的氯化汞是一种令人满意的消毒剂，只是一种令人满意的消毒剂，只是是难以去除难以去除，故在消毒后必须用大量清水，故在消毒后必须用大量清水冲洗冲洗材料。

材料。

在材料放入消毒剂之前，先在在材料放入消毒剂之前，先在乙醇中漂洗乙醇中漂洗一下，一下，可以使材料表面弄湿，从而使可以使材料表面弄湿，从而使消毒剂易于渗入消毒剂易于渗入并杀死微生物。

并杀死微生物。

3.外植体的大小和形态外植体的大小和形态消毒后的植物材料，即可进行培养。

消毒后的植物材料，即可进行培养。

从从外表均一外表均一的外植体长出的愈伤组织，在开始阶的外植体长出的愈伤组织，在开始阶段是相当段是相当一致的一致的，而从茎、根等器官切段上长出，而从茎、根等器官切段上长出的则是一个的则是一个混杂的混杂的愈伤组织。

愈伤组织。

有些外植体有些外植体外表上看来是由同一类细胞外表上看来是由同一类细胞组成，例组成，例如烟草的髓、胡萝卜的次生韧皮部、菊芋的块茎如烟草的髓、胡萝卜的次生韧皮部、菊芋的块茎等，这些细胞中等，这些细胞中DNA的含量有很大差别。

这种差的含量有很大差别。

这种差别可能是由于别可能是由于细胞核中染色体数目的差别，即倍细胞核中染色体数目的差别，即倍性不同性不同所造成的。

所造成的。

接种的外植体的大小和形状并不需要严格限制接种的外植体的大小和形状并不需要严格限制不能太小，小于肉眼能见的限度时，细胞分裂可不能太小，小于肉眼能见的限度时，细胞分裂可能难以发生。

故一般要求切块的大小要适当。

能难以发生。

故一般要求切块的大小要适当。

外植体的外植体的细胞数目多细胞数目多，获得愈伤组织的机会也多。

，获得愈伤组织的机会也多。

如果目的仅在于得到愈伤组织，如果目的仅在于得到愈伤组织，那末将茎的切那末将茎的切段、叶、根、花、果实或种子，或其中的某种段、叶、根、花、果实或种子，或其中的某种组织切成一片片或一块块放到培养基上就可以组织切成一片片或一块块放到培养基上就可以了。

了。

如果要定量地研究愈伤组织的发生，如果要定量地研究愈伤组织的发生，那么外植体那么外植体的的大小必须一致大小必须一致，形状和组成形状和组成也要也要基本基本相同。

进相同。

进行这类研究常选用行这类研究常选用组织块较大的材料组织块较大的材料，例如胡萝，例如胡萝卜的贮藏根、马铃薯的块茎、菊芋、荷兰防风草卜的贮藏根、马铃薯的块茎、菊芋、荷兰防风草等。

这样才能得到等。

这样才能得到足够数量的、无菌的、一致的、足够数量的、无菌的、一致的、适合于培养的外植体适合于培养的外植体。

具体的操作过程：

具体的操作过程：

无菌的块茎或块根，用无菌的块茎或块根，用钻孔器钻孔器钻出一批钻出一批同一类薄同一类薄壁组织圆柱形的组织，平行排列好。

壁组织圆柱形的组织，平行排列好。

多把刀片等多把刀片等距离地固定在一组金属片之间，一次切下去得到距离地固定在一组金属片之间，一次切下去得到许多个长短一致的圆柱形的外植体。

许多个长短一致的圆柱形的外植体。

圆柱形圆柱形大量地大量地、准确地准确地得到得到外形相同外形相同的外植体。

的外植体。

圆柱体的圆柱体的表面积大表面积大，利于组织块和外界，利于组织块和外界气体和营气体和营养物的交换养物的交换。

外植体的外植体的损伤表面分泌物损伤表面分泌物，具有，具有促进愈伤组织促进愈伤组织形形成的能力，因此成的能力，因此表面积越大表面积越大，产生，产生分泌物分泌物数量也数量也越多，愈伤组织的得率也越高。

越多，愈伤组织的得率也越高。

外植体的体积应尽可能小，从而得到较大数量的外植体的体积应尽可能小，从而得到较大数量的外植体。

外植体最小的限度由其亲本外植体。

外植体最小的限度由其亲本组织细胞的组织细胞的平均大小来决定平均大小来决定。

细胞数目。

细胞数目。

例如例如菊芋菊芋的细胞比的细胞比胡萝卜根次生韧皮部胡萝卜根次生韧皮部的细胞的细胞大三倍，一个大三倍，一个3.8毫克的胡萝卜外植体大约包含毫克的胡萝卜外植体大约包含25，000个细胞，这样一个外植体是能够成活的。

个细胞，这样一个外植体是能够成活的。

而同样重量的菊芋外植体，由于细胞大而数目而同样重量的菊芋外植体，由于细胞大而数目少，在分离过程中造成损伤往往难以成活。

必少，在分离过程中造成损伤往往难以成活。

必须重量达到须重量达到8毫克才包含约毫克才包含约20，000个细胞，使个细胞，使之易于成活。

之易于成活。

五、污染的原因及其预防措施11、污染：

、污染：

植物组织培养过植物组织培养过程中培养基和培养材程中培养基和培养材料料滋生杂菌，导致培养失滋生杂菌，导致培养失败的现象败的现象22、污染的原因、污染的原因一是病原菌污染（细菌、一是病原菌污染（细菌、真菌）真菌）二是外植体、培养基、二是外植体、培养基、培养器皿带菌培养器皿带菌三是操作人员未遵守操三是操作人员未遵守操作规程。

作规程。

真菌污染污染的预防措施组织培养中降低污染率是工厂化生产中不可忽视的技术环节。

预防措施有：

防止材料带菌-选择取材时间、材料与培养、外植体灭菌等措施；防止用具带菌-器皿与金属器械灭菌；操作室要处于无菌状态-工作室、培养室灭菌等；操作人员要按照操作程序进行。

在培养基中加入抗菌素分散接种假设污染率为假设污染率为95%：

100块材料，接种于块材料，接种于100支试管，即支试管，即11块块/支支。

得率为：

得率为：

P=（1-95%）100=5块无菌材料块无菌材料200块材料，接种于块材料，接种于100支试管，即支试管，即22块块/支支。

P1（2污）污）=95%95%=90.25%P2（1污污1得或得或1得得1污）污）=295%5%=9.5%P3（2得）得）=5%5%=0.25%若得到若得到1支试管的无菌材料，至少要接种：

支试管的无菌材料，至少要接种：

1/0.25%=400支，即接种支，即接种800块材料，能得块材料，能得2块无菌材块无菌材料。

料。

若按若按33块块/支支接种，需做接种，需做8000支试管培养基，接入支试管培养基，接入2.4万块万块材料，才能有材料，才能有1支试管的（得支试管的（得3块）无菌材料。

块）无菌材料。

六、外植体的褐变及其防止措施褐变褐变褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激后活，使细胞内的酚类物质氧化成棕褐色醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡的现象影响褐变的因素植物种类：

一般木本植物，单宁、色素含量高的植物易发生褐变植物种类：

一般木本植物，单宁、色素含量高的植物易发生褐变。

基因型：

不同种植物、同种植物不同类型、不同品种在组织培养中褐变基因型：

不同种植物、同种植物不同类型、不同品种在组织培养中褐变程度有很大差别。

木本植物一般比草本植物容易褐变。

程度有很大差别。

木本植物一般比草本植物容易褐变。

外植体的生理状态：

一般幼龄材料，幼嫩器官和组织，春季取外植体，外植体的生理状态：

一般幼龄材料，幼嫩器官和组织，春季取外植体，褐变发生较轻褐变发生较轻。

外植体培养条件：

事先对母株或枝条进行遮光处理，之后再切取外植体，外植体培养条件：

事先对母株或枝条进行遮光处理，之后再切取外植体，可减少褐变，因为酚类化合物合成和氧化过程中，有一部分酶系统的活可减少褐变，因为酚类化合物合成和氧化过程中，有一部分酶系统的活性是受光诱导的。

性是受光诱导的。

培养基的成分：

培养基中培养基的成分：

培养基中66BABA或或KTKT能促进褐变发生，而生长素类如能促进褐变发生，而生长素类如IAAIAA可减轻褐变发生。

可减轻褐变发生。

材料转移时间：

一般让材料生长一段时间后再转移，这时酶的活性比较材料转移时间：

一般让材料生长一段时间后再转移，这时酶的活性比较低，褐变也会减少。

低，褐变也会减少。

褐变的防止措施选择适宜的外植体及最佳培养基：

适当降低培养基无机盐浓度，降低PH值，降低细胞分裂素水平等，可显著减轻培养物褐变连续转移加抗氧化剂：

如硫代硫酸钠、抗坏血酸；加活性碳加多胺类物质，如精胺、亚精胺培养物的玻璃化现象及其预防措施玻璃化现象及其产生原因培养物增殖培养时，若细胞分裂素浓度过高或细胞分裂素与生长素相对含量高，培养基中离子种类，比例不适，琼脂浓度低，不良培养环境如温度过低或过高，光照时间过长及通气不良，易造成组培苗含水量高，茎叶透明，出现畸形，发生玻璃化现象玻璃化现象的预防措施适当控制培养基中无机盐浓度适当控制培养基中蔗糖和琼脂浓度适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度增加自然光照，控制光照时间控制好温度改善培养皿的气体交换状况在培养基中添加其他物质培养阶段易出现的其他问题白花苗愈伤组织的愈伤组织的培养培养一、培养基一、培养基培养基培养基一般一般包括包括大量大量元素、元素、微量微量元素和一种元素和一种碳碳水化合物水化合物，最常用的碳水化合物是蔗糖。

，最常用的碳水化合物是蔗糖。

这样简单的培养基这样简单的培养基（基本培养基基本培养基）只有很少几种植只有很少几种植物组织能够培养和维持下去，大多数组织需要物组织能够培养和维持下去，大多数组织需要添加各种各样的附加物添加各种各样的附加物（完全培养基）（完全培养基），如维，如维生素、氨基酸、糖醇，生长素、细胞分裂素、生素、氨基酸、糖醇，生长素、细胞分裂素、赤霉素、螯合剂如赤霉素、螯合剂如EDTA、各种营养性的提取物、各种营养性的提取物如椰子汁等。

如椰子汁等。

注意：

选用完全已知的注意：

选用完全已知的合成化合物合成化合物，不大主张用，不大主张用复杂的复杂的天然产物天然产物，如酵母提取物、番茄汁、椰子，如酵母提取物、番茄汁、椰子汁等。

汁等。

必须强调：

必须强调：

适合于适合于诱发诱发愈伤组织的培养基不一定适合于愈伤组织的培养基不一定适合于维持维持这些愈伤组织；适合于这些愈伤组织；适合于液体液体培养的培养基也不一培养的培养基也不一定适合于定适合于固体固体培养。

培养。

培养基中的培养基中的N，大多数都用，大多数都用硝态氮硝态氮，只有，只有