肿瘤生物治疗张.docx
《肿瘤生物治疗张.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《肿瘤生物治疗张.docx（30页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
肿瘤生物治疗张
肿瘤生物治疗2001/4/5
张叔人
一．肿瘤生物治疗发展概况
＃ 早期的肿瘤免疫治疗多采用非特异性免疫增强剂。
如卡介苗（BCG）和小棒状杆菌（C.Parvum）菌苗。
膀胱癌
＃ 80年代初期，Rosenburg应用LAK过继免疫治疗晚期癌症病人取得明显疗效，再次掀起免疫治疗的高潮。
（TILCIK 生物导弹）
＃ 90年代，比利时ThierryBoon首先应用T细胞克隆的方法找到了人类肿瘤抗原。
SEREX法发现了一批肿瘤抗原。
DC 肿瘤抗原肽
＃ 肿瘤基因治疗。
P53Rb
＃ 针对阻止肿瘤血管生成治疗肿瘤。
近几年随着分子生物学的发展，在肿瘤抗原、抗原递呈和T细胞识别等方面均有了突破性进展，对于肿瘤的免疫效应机制，以及肿瘤的免疫逃逸机理有了深入的认识。
众多肿瘤免疫疗法如雨后春笋般应运而生。
肿瘤免疫治疗与手术、放疗、化疗三大常规疗法有明显的互补性，在控制肿瘤的复发和转移方面展示良好前景。
生物治疗：
应用生物的组织、细胞、蛋白质、多糖、基因等生物制剂
治疗疾病。
肿瘤的生物疗法的策略：
调节强化抗肿瘤免疫、祛除免疫抑制、直接
杀伤或诱导肿瘤凋亡、促肿瘤分化、阻断肿
瘤营养供应、提高肿瘤被杀伤的敏感性。
二．肿瘤的免疫治疗
策略：
去除免疫抑制、提高免疫原性、增强宿主免疫细胞的反应性
以及免疫导向。
1．过继免疫治疗（adoptiveimmunotherapy）：
LAK,TIL,CIK
（1）淋巴因子活化的杀伤细胞（LymphokineActivatedKiller）：
制备：
IL-2；测定：
51Cr释放法、乳酸脱氢酶（LDH）释放法
NationalBiotherapyStudyGroupinterleukin-2
Trials:
TumorResponseAccordingtoTypeofCancer
Response
DiseaseCRPRMRSDPDTotal（CR+PR）%
Melanoma52824587333/18818
Lung17318228/5116
Breast14113155/3415
Renal31011766713/1678
Colon01636331/761
Other0124475912/12210
Total10624924826972/63811
CR:
completeresponse;PR:
partialresponse,MR:
mixedorminorresponse
SD:
stabledisease:
PD:
progressivedisease.
rIL-2：
半衰期短，给药方式：
皮内、瘤内、腔内、淋巴管内、吸入
副作用：
寒战、发热、恶心、乏力、心律失常、神经异常、毛细血
管渗漏综合症（Capillaryleaksyndrome，CLS），肺水肿
预防和处理：
地塞米松、消炎痛、安定类、吸氧
（2）其他非MHC限制性过继免疫治疗
粘附MNCA-LAK
+抗CD3CD3AK
LAK（MNC+IL-2）+抗CD3+IFN-+IL-1CIK
+MEP（TCR-V9、V2）T
Monoethylpospate
LAK、CD3AK、CIK细胞活性及增殖数量（李殿俊）
LU/106cellsCellnum.x106TotalLU
LAK238104
CD3AK18871566
CIK26782028
TAK：
IL-2+抗CD3+Tu-Ag
（2）肿瘤浸润性淋巴细胞
富含肿瘤细胞
1.055-
富含TIL
1.077-
（Tumor-infiltratinglymphocyte，TIL）
制备：
肿瘤组织消化（透明脂酸酶、胶原酶、DNA酶）单细胞密度梯度分离富含TIL+IL-2/抗CD3/100Gy自体肿瘤
标志：
CD3+/CD8+CD3+/CD4+
NK、LAK、TIL之间的区别
NKLAKTIL
来源外周血，脾外周血，脾肿瘤区域
抗原致敏+
产生条件自然存在IL-2IL-2、Ag、抗CD3
选择性杀瘤能力++++++
抗瘤谱窄广窄
MHC限制+
体内增殖能力差弱强
聚集肿瘤部位差差强
免疫记忆+
LGL特征++
CD3/++
TIL和LAK体内抗肿瘤效力的比较
回输TIL或LAK早期荷瘤小鼠肺转移抑制率%
数量 X106TIL+IL-2LAK+IL-2
0.4~0.516±8
1~274±12
4~596±4
8~10100
3012±1
6028±4
10059±26
20097±2
肿瘤——照射灭活裂解+DC——注入淋巴结区域腹股沟——
取淋巴结——CTL克隆——扩增——回输
2．肿瘤疫苗：
（1）细胞瘤苗
a. 细菌或病毒佐剂瘤苗：
BCGNDV
b. 转基因细胞瘤苗：
细胞因子（IL-2GM-CSF）
MHC（classIIIB7）
共刺激分子（B7）
c.基于DC的瘤苗：
负载多肽 导入肿瘤抗原基因
d. 红细胞瘤苗：
RBC-唾液酸酶
e. 细胞融合瘤苗：
肿瘤细胞＋B细胞／DC
（2） 亚细胞瘤苗：
exosome（外泌小体）
近期发现DC分泌的exosome属于亚细胞结构，具有多种抗原递呈分子和T细胞共刺激分子。
肿瘤抗原肽刺激的DC产生的exosome能够呈递肿瘤抗原，活化CTL，抑制和根除已建立的小鼠肿瘤，所以exosome瘤苗极具发展潜力。
（3） 多肽分子瘤苗：
肿瘤提取抗原多肽（酸洗脱），病毒成分（HPV16-E6、E7）合成肿瘤抗原多肽，HSP
（4） 多糖瘤苗：
MUC-1
（5） 基因瘤苗：
CEA-痘苗V、HPV、erbB2/neu
3．基于抗体的免疫治疗：
Ag抗体抗抗体
（1）激活效应细胞（抗CD3AbCIK，TIL，抗4-1BBT）
（2）
idiotype-抗抗体瘤苗
（3）抗肿瘤相关抗原抗体，体内应用直接产生抗瘤作用。
Trustuzumab（Herceptin）anti-HER2
VLlinkerVH
VL
VH
VLNVHCPPVHNVLC
Base-loop
LHHLKGGK
鼠Fab
人Fc
（4）抗体导向治疗
对抗体改造克服HAMA反应
a.小分子抗体：
SinglechainFv（ScFv）1/6
Disulfide-stabilizedFv（DsFv）
PermutatedFv（pFv）
b.双功能抗体（BispecificAb）
●杂化杂交瘤技术
轻重链无改变X2
重链不变X4
重、轻链均变X4
●化学交联Fab
●基因重组两套重轻链基因
c.嵌合抗体（chimericAb）Fc
d.人源化抗体（humannizedAb）
重构抗体,VH,VL区6个CDR
移植,骨架区的一些氨基酸同
时移植
e.人源抗体：
利用基因工程技术
构建的小鼠XenoMouse，产生
抗EGFr单抗，在裸鼠模型显
示很强的抑瘤作用。
FcRScFv
Ag
TcellTumor
FcRScFv
f.
T-body:
T细胞表达的嵌合受体（Fv或ScFv为胞外区与Fcγreceptor
和ζ链 铰链区重组）。
不受MHC限制，杀伤肿瘤或半抗原修饰的肿瘤。
毒素
分类：
双链毒素：
Abrin,Ricin,Modeccin,
植物毒素Viscumin
单链毒素：
PAP,SAP,Lonin,Monoridin,
内化毒素Triuchosanthin
细菌毒素：
Diptheriatoxin（DT）,Pseudomonas
exotoxin（PE）,
膜活性毒素：
staphylococcal-hemolysin（HL）,streptolysinO,
E.coli-hemolysin,pneumolysin,aerolysin,
perferins,eqinatoxins
a.毒素改造：
●PE664E（将结合细胞能力的DIa中Lys57,His246,Arg247,
和His249诱变为Glu,使其失去结合能力）
●PE40（缺失DIa，剩40KD）
●PE38（从PE40的DIb中去除365-380aa）
●PE38KDEL（将PE38中DIII的C端Arg-Glu-Asp-Leu-Lys用
Lys-Asp-Glu-Leu,KDEL替代，提高IT跨膜效率）
Reiter证明：
ScFv-PE38KDEL较ScFv-PE38对直肠癌多
种细胞系细胞毒活性高3-5倍，体内高2倍。
b.杂合毒素：
植物与细菌毒素杂交100-1000倍
c.基因重组毒素：
融合蛋白，必须存在与天然毒素一样的蛋白水解
位点，使毒素与载体内化时解离，便于进入胞质，发挥
杀伤效应。
d.膜活性毒素：
不需内化，杀伤力大，毒副作用大，需改造。
靶向治疗肿瘤相关的靶抗原
抗体靶向治疗的临床研究
●淋巴瘤
Kaminski:
1996131I-抗CD20鼠源，顽固性非何杰金氏淋巴瘤
75%患者有效，分化低的>分化高的，化疗不敏感的也取得较好疗效。
Knox:
90Y（钇）-抗CD20对非何杰金氏淋巴瘤有效率72%（治愈率
33%）。
90Y-抗个体基因型治疗B细胞淋巴瘤有效率近33%
●白血病
人源化抗CD33单抗M195治疗急性髓样白血病和急性早幼粒细胞白血病。
131I-M195与白消安或环磷酰胺合用于骨髓移植（BMT）,除去排异反应的T细胞。
131I－抗CD54（ICAM-1）急性髓样白血病或急性单核细胞增多型白血病的BMT，与传统全身辐射除去T细胞对正常细胞毒性小。
●结直肠癌
鼠源抗表皮粘附分子单抗17-1A，对Duke’C期结肠癌死亡率和复发率分别降低了30%和27%，主要与低分化肿瘤结合，ADCC，80%产生HAMA，但未影响疗效。
人源化改造。
放免治疗：
131I-抗A33，与骨髓也有相当数量的结合，5/23有一定的疗效。
125I与靶向抗体偶联物易为肿瘤细胞内吞。
125I-抗A33，21例患者，10例显效，而骨髓细胞很少与125I标记抗体作用，被射线损伤机会少。
近来证明：
放射偶联物离细胞核越近，细胞毒越强，并成指数增加。
免疫毒素：
LeY-Ab与PE化学偶联，I期研究，5/38例好转，正常组织表达同样靶抗原，但未受损。
但是，由于毒素的免疫原性强，再次使用应有效果。
●乳腺癌
●肾癌
131I标记鼠源G250，由于HAMA反应，二次使用则失效。
131I-G250人鼠嵌合型，肿瘤富集浓度>0.1%（每克组织达到的注射计量，一般水平为0.001%-0.01%）,16例中的2例有轻微
HACA反应。
ADCC
干扰素治疗肿瘤
肿瘤疗效
毛细胞白血病60-90%缓解
慢性白血病50%PR
淋巴瘤37%PR+CR
Kaposi氏肉瘤26%PR
急性白血病24%PR
多发性骨髓瘤20%PR+CR
神经胶质瘤17%PR+CR
肾细胞癌16%PR+CR
黑色素瘤10%PR+CR
局部应用好
卵巢癌10%PR
乳腺癌10%PR
4．细胞因子治疗
（1）干扰素（interferon,IFN）
I型干扰素:
细菌、病毒白细胞、成纤维细胞等，IFN-166-172aa（1、2亚族）无糖基；IFN-166aa糖蛋白；广谱抗病毒作用，促进多数细胞MHCI类分子的表达，提高巨噬细胞、NK细胞、CTL抗肿瘤作用。
II型干扰素:
IFN-成熟分子143aa的糖蛋白，同源双体形式存在，活化T细胞和NK细胞产生。
它可上调多种细胞MHCI类分子、II类分子表达，上调血管内皮细胞细胞间粘附分子-1的表达。
促转移？
（2）Interleukin,IL白细胞介素糖蛋白18种
IL主要生物学活性
1促T细胞分化，增殖、CTL,NK活性↑
2 促T细胞分化，增殖、CTL,NK,LAK活性↑
3 多能干细胞、T细胞增殖
4 促B细胞增殖，产生Ig,DC
5 促B细胞分化
6 促T、B、干细胞增殖，Ig↑,巨核细胞分化
7 促T、B细胞增殖，诱导LAK
8 趋化中性、嗜碱性粒细胞、T细胞
9 T细胞生长，协同IL-3刺激肥大细胞
10 抑制TH1，促胸腺和肥大细胞增殖
11 促Ig分泌，促血小板形成
12 协同IL-2促进CTL、NK、LAK分化
13促B细胞增殖
14 促B细胞增殖
15 CTL,NK,LAK活性↑
16 促进CD4+细胞增殖，抑制病毒复制（HIV）
17 促IL-6、IL-8、PGE2、MCP-1、G-CSF↑
18 NK、T↑
IL-12：
●35KD、40KD异二聚体，激发NK、LAK、T细胞增值、分化；向肿瘤趋化；诱导IFN-产生；促巨噬细胞产生NO；抑制肿瘤血管生成；有利于TH1细胞分化。
●临床研究：
I期美国遗传研究所主持安全性和耐受性
II期另一研究组，肾癌17人中15人出现严重副作用。
胃肠
道出血，肝毒性和贫血，2人死亡。
动物实验表明：
第一次单计量注射两周后再多次给药可预防毒
性反应。
SC代替iv，减少用药次数，未出现毒性反应。
●改进：
IL-12基因自体纤维母细胞扩增注入体内（或与灭活的瘤细胞混合，作为瘤苗）CD4+,CD8+细胞浸润，出现大量并指状细胞。
对晚期肿瘤有效。
（3）肿瘤坏死因子TNF：
分为两种，TNF-又称为恶质素；TNF-又称为淋巴毒素。
两者都是同源三聚体。
炎症因子，与败血症休克、发热、多器官衰竭、恶病质有关。
体内外均能杀死某些类型的瘤细胞，或抑制其增殖，激活免疫细胞攻击肿瘤，增强IL-2依赖的胸腺细胞、T细胞增殖能力，促进IL-2、CSF、IFN-等淋巴因子产生，干扰肿瘤血液供应。
它的许多功能与IL-1相同。
另一方面，肿瘤坏死因子又可促肿瘤有丝分裂、肿瘤扩散、血管生成和恶液质。
毒性大，基因重组突变型
（4）血细胞生成因子 G-CSF、GM-CSF、TPO、EPO、IL-6、SCF
其他生物反应调节剂：
BCG、OK432、香菇多糖、中草药（黄芪、女贞子
对抗免疫抑制：
PGE2-InM；Ts-CYC或低剂量辐射；反义RNA（TGF-，IGF，IL-10）
配体导向治疗：
IL-2/IL-2R、EGF/EGFR
三、抗血管生成
肿瘤长至1-2mm3无新血管行成供应营养，则不能生长。
策略
Fourstrategies（todesignanti-angiogenesisagents）
（1）Blocktheabilityoftheendothelialcellstobreakdownthe
surroundingmatrix.
（2）Inhibitnormalendothelialcellsdirectly.
（3）Blockfactorsthatstimulateangiogenesis.
（4）Blocktheactionofintegrin,amoleculeontheendothelial
cellsurface.
1阻断内皮细胞降解周围基质的能力
2直接抑制正常内皮细胞
3阻断刺激血管生成的因子
4阻断整合素的作用（内皮细胞表面的分子）
活化内皮细胞生长、运动的因子
activeendothelialcellgrowthandmovement
1vascularendothelialgrowthfactor（VEGF）
2fibroblastgrowthfactor（FGF）
3angiogenin
4epidermalgrowthfactor（EGF）
5scatterfactor（SF）
6placentalgrowthfactor（PlGF）
7interleukin-8（IL-8）
8tumornecrosisfactoralpha（TNF-α）
天然抗血管因子
naturallyoccurringinhibitorsofangiogenesis
1.Angiostatin
2.endostatin
3.Interferons（IFN）
4.plateletfactor4（PF4）
5.thrombospondin（凝血栓蛋白）
6.transforminggrowthfactorbeta（TGF-）
7.16Kdfragmentofprolactin
8.tissueinhibitorofmetalloproteinase-1,-2,and-3
（TIMP-1,TIMP-2andTIMP-3）
●Angiostatin血管抑素：
1994年O’Reily研究转移癌抑制机制时从Lewis肺癌鼠血清和尿中提取38Kda蛋白，亲肝素和赖氨酸，抑制血管内皮生长和新的血管形成。
是纤溶酶原的酶解产物。
●endostandin内皮抑素：
1997年从血管内皮细胞培养上清中发现，20kDa，胶原XVIII的酶解产物，原核表达无天然折叠，可溶性差，体外无活性。
皮内注射出现活性。
●抗肿瘤作用：
手术、放疗、化疗、免疫治疗各有其局限性，肿瘤生长严格依赖血管形成。
肿瘤长至1-2mm3无新血管行成供应营养，则不能生长。
通过抑制血管形成对各种实体瘤均有效。
血管内皮细胞为新生血管前体，很少发生变异，治疗效果稳定不易产生耐药性。
对正常静止的血管内皮细胞无抑制作用。
O’Reily称其为休眠疗法（dormancytherapy）。
真核表达的血管抑制素有种属差异。
小鼠实验中达同样抗肿瘤效果，人血管抑制素用量100mg/kg.d,小鼠血管抑制素为6mg/kg.d
●基因重组内皮抑素皮下注射已长至小鼠体重3%的多种肿瘤都缩小至镜下可见水平。
凋亡率是对照组的7倍之多。
接种3%endostandinendostandin
2-6个周期
●andostandin+Angiostatin肿瘤不复发
●非实体瘤白血病血管形成在骨髓，血管形成抑制剂同样有效。
●优越性；几乎对所有的原发和转移瘤都有效。
不产生耐药性。
无毒副作用。
给药途径方便（SC）
●问题：
长期应用对人类能否产生副作用。
对自发性人类肿瘤的疗效是否与小鼠实验效果相同。
四 基因治疗
1．策略:
基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活
内容：
直接攻击肿瘤（诱导凋亡和直接杀伤）、调节免疫系统、
对抗肿瘤血管生成、修饰保护正常细胞
2．载体：
retrovirus（RV）、adenovirus（AdV）、adeno–asociatedvirus（AAV）、herpessimpexvirus（HSV）、Epstein-Barrvirus（EBV）、vacciniavirus（VV）、其他真核表达质粒
各种病毒载体的特点
RVAdVAAVHSV
类型双链RNA双链DNA单链DNA双链DNA
整合与细胞染色体随机整合不整合定点19号短臂可整合
产生感染病毒条件 缺陷病毒 穿梭载体 复制：
辅助 缺陷病毒
包装细胞 缺陷病毒 病毒AdV,VV 包装细胞
PA317（gag包装细胞HSV 或 （早期病毒
Pol,env）293（E1）UV,γ-射线 基因IE3）
外源基因装载容量8kb35kb4.9kb>30kb
感染细胞谱广谱，分裂期广谱广谱,辅助病毒神经和上皮类细胞
制备效价（PFU/ml）106-107101210121011-1012
感染效率较低高高高
安全性有风险安全安全有风险
3．基因导入方法：
病毒感染、脂质体（图）、电穿孔、基因枪（图）、
裸基因注射、基因缝线等
基因缝线:
汤健缝线直接涂抹DNA或通过polylysine偶联到缝线上
血管、骨骼肌、心肌比单纯注射表达率高5-10倍。
尿激
酶基因缝线微小动脉缝合防止吻合口血栓形成和狭窄。
基因针：
用polylysine将基因粘附在不锈钢针上（75-100gDNA）
刺入肌肉（0.2V,1mA,直流脉冲，DNA为负极无关电极为
正）电针30分钟第3天表达14天达高峰持续一个
月。
针刺捻转为电针效率的1/3-1/5。
基因球囊和支架：
外源基因（反义N-ras）在冠状动脉中表达，抑
制损伤造成的血管内膜下增生和狭窄
血管外基因转移：
a外科切开蘸有基因的滤纸贴于血管外膜
b可溶性纤维蛋白＋DNA——血管周围注射——凝血酶＋组织凝血因子——网状不溶性纤维蛋白／DNA复合物——>１４天纤溶酶作用降解
4．肿瘤基因治疗的靶向性和组织特异性表达
（1）病毒：
●RV：
IL-2替代其envN端部分IL-2-Env淋巴细胞
胶联EGF、Ab有待评价
●AdV：
Ad5-纤维蛋白的糖基，经化学修饰与一种血清类粘蛋白（ASOR）和多聚赖氨酸连接物共价连接与ASOR+细胞结合
●HSV：
具有嗜神经性，改造成只感染分裂相胶质瘤细胞，而脑内正常细胞不受影响。
●EBV：
EBNA-1是EBV复制所需唯一的反式激活因子。
存在于所有的EBV转化的细胞中。
pFR-tk-Zta质粒中溶细胞性复制周期反式蛋白Zta是依赖EBV激活。
（HBV-嗜肝性）
（2）脂质体：
特异性配基（抗体、凝集素、病毒表面的糖蛋白）
EGFp-LysDNA
+++
（3）受体介导：
转铁蛋白-多聚赖氨酸/DNAK562
EGF-多聚赖氨酸/DNAK562
（5）肿瘤组织特异性表达：
组织特异性启动子、增强子、反式作用因子调控表达。
AFP启动子/增强子-TK
5．目的基因及其应
升级会员 