碱性大孔离子交换树脂分离熊去氧胆酸.docx
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碱性大孔离子交换树脂分离熊去氧胆酸
目录
1前言1
1.1研究意义1
1.2离子交换树脂分离技术的原理及应用4
2离子交换法精制熊去氧胆酸9
2.1实验材料和仪器9
2.2实验方法与步骤10
3实验结果和讨论13
3.1熊去氧胆酸的HPLC检测13
3.2吸附交换过程热力学研究14
3.3吸附交换过程动力学研究18
3.4静态条件下不同洗脱剂的选定19
3.5柱操作条件研究20
3.6离子交换柱分离熊去氧胆酸21
4产物的鉴定和表征24
4.1材料与方法24
4.2结果与讨论25
5总结与展望31
参考文献32
致谢34
摘要
熊去氧胆酸（UrsodeoxycholicAcid，UDCA）是FDA惟一批准可用于治疗原发性胆汁性肝硬化的有效药物。
在化学合成工艺中，常利用牛羊胆汁中提取出的UDCA差向异构体——鹅去氧胆酸（ChenodeoxycholicAcid，CDCA），由氧化还原法合成UDCA，但中间产物及杂质较多使终产品纯度不高。
本课题的研究方向是采用碱性大孔阴离子交换树脂D201型树脂对UDCA进行纯化，笔者主要从动、静两方面考察树脂对熊去氧胆酸的分离条件。
结果表明，UDCA能良好地吸附在D201树脂上，等温吸附曲线拟合符合Langmiur经验式，在298~318K的条件下，每克树脂的静态实验吸附量为20～35mg，动态实验吸附量为40～50mg。
在298K条件下，进行柱层析分离，并且通过多种方法对终产物进行表征，由分步洗脱得到的UDCA的精制产品纯度可达90%以上。
关键词：
熊去氧胆酸，离子交换树脂，高效液相色谱
Abstract
UrsodeoxycholicAcid（UDCA）istheonlyapproveddrugforthetreatmentofprimarybiliarycirrhosisbyFDA.Inchemicalsynthesisprocess,ChenodeoxycholicAcid（CDCA），epimerofUDCA,extractedfromcattleandsheep'sbile,isoftenusedforthesynthesisofUDCAthroughoxidationreduction.Yet,aquantityofintermediateproductsandimpuritieswillleadtothelowpurityofthefinalproduct.
TheresearchdirectionofthispaperistopurifytheUDCAbybasicmacroporousanionexchangeresinD201,andtheresearchermainlystudyabouttheseparationconditionsofursodeoxycholicacidresinfromstaticanddynamicaspects.TheresultsshowthatUDCAcanbewelladsorbedontheD201resin.What’smore,theadsorptionisothermcurvecannearlyfitwithLangmiurexperience.At298~318K,undertheconditionofstaticexperiments,theadsorptioncapacitypergramofresincanreach20~35mg,whileunderthedynamicexperiments,theadsorptioncapacitycanreach40~50mg.At298K,separatedbycolumnchromatographythroughstepwiseelutionandcharacterizedbyavarietyofmethods,finally,therefinedproductUDCAcanreachapurityofmorethan90%.
Keywords:
Ursodeoxycholicacid,ionexchangeresin,HPLC
1前言
1.1研究意义
在珍贵的中医药材中，熊去氧胆酸（UrsodeoxycholicAcid，UDCA）是熊胆的特有成分，它是一种3α,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸。
在临床医学上，各种胆囊及胃肠道疾病运用该药材均可以获得很好的疗效。
在我国以及东南亚地区，人们已经开始广泛地开发并且有效利用该种药材的中药制剂。
我国通常采用的制备方法是较为原始的传统工艺，然而随着野生动物越发稀有，并且有关动物保护的法规变得日趋严格，化学合成法的普及迫在眉睫。
根据现有资料已经有所报道的制备熊去氧胆酸的方法是从牛、羊的胆汁中提取、分离出牛胆酸，经过多步反应合成得到UDCA的差向异构体——鹅去氧胆酸（ChenodeoxycholicAcid，CDCA），由于二者仅仅在7位羟基构型上有所差异，再经过若干步氧化还原反应，最终就能实现将CDCA转化成为UDCA，然而此法所采用的合成路线、工艺极为复杂，并且产品中往往含有大量的中间产物以及杂质，导致最终所得到的产品纯度不高[1]。
当今世界，欧美厂商是UDCA的生产主力军，对UDCA的主要市场需求为日韩、欧美发达国家，就这一良好的形势而言，胆酸类药物出口的前景十分乐观。
现代有机合成工业发展迅速，离子交换技术发展突飞猛进。
随着多种性能优良的离子交换树脂的研制成功，多种新应用方法的开发也日趋丰富起来，在诸多行业特别是高新技术产业以及科研领域中，该法均得到了广泛地应用。
由于该法高效而又安全，笔者将其应用于分离纯化UDCA的研究中。
在工业化规模生产中，由于离子交换树脂的具备处理能力大、脱色范围广、脱色容量高的优点，并且能够去除各种不同离子，还能反复再生使用、工作寿命也长、运行费用较低，其他方法无法与之相媲美，在工业化生产中具有其他材料无法匹敌的潜在优势。
本课题的研究方向即采用碱性大孔阴离子交换树脂D201型树脂对UDCA进行纯化，笔者主要从动、静两方面考察树脂对其吸附的热动力学性质。
在298K条件下，进行柱层析分离，并且通过多种方法对终产物进行表征，由分步洗脱得到的UDCA的精制产品纯度可达90%以上，使得合成工艺大大简化，有效地提高了产率，由于可以直接在常温下进行，降低了成本，有望实现工业化推广。
1.1.1熊去氧胆酸简介
熊去氧胆酸是高等动物胆汁中最常见的胆汁酸之一，是一种亲水胆酸，其主要成分为3α,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸，属于有机化合物。
就其物化性质而言，UDCA无臭，味苦，易溶于乙醇与冰醋酸，在氢氧化钠试液中也能够溶解，但无法在氯仿中溶解。
表1.1 熊去氧胆酸的物化性质
熊去氧胆酸
化学式
C24H40O4
分子量
392.58
色泽
白色粉末
气味
无臭、味苦
熔点
介于200～2040C之间
比旋度
介于+59.0°～+62.0°之间（40mg/ml无水乙醇溶液测定）
pKa
5
溶解性
几乎不溶于水，易溶于乙醇、冰醋酸等，不溶于氯仿，能溶于碱性溶液
敏感性
对光、氧、高温及湿度等相对不是很敏感
人类胆汁的主要成分是胆汁酸（简称为胆酸），其首先由肝脏合成，并经胆囊或者是小肠分泌，主要是以与牛磺酸、甘氨酸共轭的形式存在。
在小肠中，初级胆汁酸、胆酸（CholicAcid，CA）和鹅去氧胆酸，可能是由肠道细菌脱去结合形式，形成次级胆汁酸，如脱氧胆酸（DeoxycholicAcid，DCA）、石胆酸（LithocholicAcid，LCA）和熊去氧胆酸，它们都是胆烷酸的衍生物，都含有24个碳原子。
随后，为了摄取和重新分泌进入胆汁，胆汁酸经由门静脉系统，能有效地被重新吸收并运输回肝脏（即胆汁酸的肠肝循环）。
在肠道的胆汁酸肠肝循环过程中，肠道胆汁酸的一小部分随粪便排出，并被肝脏从头合成所取代。
胆酸是胆汁的重要组分，在脂类物质消化吸收及调节胆固醇代谢方面，胆酸都起到了十分重要的作用。
在正常人类的胆汁中，UDCA占人体总胆酸的3%，它能够松弛胆总管括约肌，促进肝脏糖原蓄积，有保肝解毒的功效，是名贵中药熊胆所蕴含的主要有效成分，在临床医学上，对于各种胆疾以及消化道疾病方面都具有良好的疗效[2]。
图1-1熊去氧胆酸的结构
图1-2游离型胆汁酸和结合型胆汁酸
熊去氧胆酸最早是由日本冈山大学的Shoda从中国熊的胆汁中分离从而获名。
通常情况下，在正常人体中，只有少量的胆汁酸会存在于周边血液及尿液中。
然而，在肝胆、肠道疾病中，合成、代谢紊乱，以及由肝脏和小肠吸收的清洁等特殊因素，会影响在不同池室（如血清、肝脏、胆囊、尿液、粪便）中胆汁酸的分布浓度[3]。
1985年时，Leuschner等人用UDCA治疗合并肝炎的胆结石时发现血清转氨酶降低，在此之后，大量的临床医学研究也证实了UDCA对治疗一些肝病确实有着显著的效果。
UDCA在治疗肝病方面的作用机制以及疗效如下：
胆汁淤积性肝病与鹅去氧胆酸、去氧胆酸和石胆酸的积聚有关，由于去垢作用，这些胆酸会损害肝细胞，而UDCA却是一种没有毒性的亲水胆酸，能竞争性地抑制回肠吸收具有毒性的内源性胆酸。
通过激活钙离子、蛋白激酶C组成的信号网络，并激活分裂活性蛋白激酶，可以提高胆汁淤积肝细胞的分泌能力，同时降低血液以及肝细胞中的内源性疏水胆酸浓度，从而起到抗胆汁淤积的效果。
UDCA还能竞争性地取代细胞膜和细胞器上的毒性胆酸分子，防止更多的毒性胆酸损害肝细胞和胆管细胞[4-6]。
以上作用具体表现在：
①细胞保护作用。
UDCA结合物能明显减轻疏水胆酸诱发的肝细胞的细胞溶解，减少培养鼠和人类肝细胞由毒性胆酸诱发的细胞凋亡。
②膜稳定作用。
UDCA可防止胆酸诱发的线粒体膜渗透性改变，也就是说可通过膜稳定作用来防止毒性胆酸诱发的腺粒体膜、基底膜和小胆管膜损害。
③抗氧化作用。
UDCA能抑制毒性胆酸引起的枯否细胞激活，还能增加肝细胞谷胱甘肽和含硫醇蛋白的水平，防止肝细胞的氧化损伤。
④免疫调节作用。
UDCA通过降低疏水胆酸的刺激作用间接抑制，并通过激活糖皮质激素受体直接抑制组织相容性复合体（MHC）Ⅰ类和Ⅱ类基因的表达[5]。
1.2离子交换树脂分离技术的原理及应用
在离子交换分离的操作中，其物质基础是离子交换剂，树脂自身性能的优劣决定了分离效果的优良。
在使用过程中，离子交换树脂应当具备满足工艺上所需要的足够交换能力、选择性以及交换速度。
由于离子交换树脂品种良多，而且其各自的化学组成和结构也不尽相同，从而在功能以及特性上显现出不同，可以分别应用于不同的分离用途中。
树脂的交换容量称为交换能力，根据一定的生产规模，可以决定使用的树脂量。
选择性用以度量树脂的分离能力，它反映了树脂对不同离子的亲和力。
树脂工程性能的重要指标之一是交换速度，它能体现出树脂的动力学性能[4]。
在使用树脂的过程中，它与水溶液构成了固－液非均相传质体系。
因此，离子交换树脂必须具备适宜的微观结构，即一定的孔隙率、孔径以及比表面积，此外对密度、粒度以及强度也有一定的要求。
1.2.1原理
大孔树脂包含大孔离子交换树脂及大孔吸附树脂，通常情况下，大孔吸附树脂不含有离子交换基团，但其珠粒内部含有与分离对象分子尺寸相对应的吸附场所以及扩散通道。
离子交换树脂是一种高分子化合物，具有功能基团，它具有一般聚合物没有的新功能——离子交换功能，本质上属于反应性聚合物。
根据基体的种类[7]，离子交换树脂可以分为苯乙烯系树脂和丙烯酸系树脂；根据树脂的物理结构，则可分为凝胶型、大孔型以及载体型。
强酸性阳离子树脂：
此类树脂含有大量的强酸性基团，如磺酸基－SO3H，由于易在溶液中离解出H+离子，故呈现强酸性。
当树脂离解后，其本体含有的负电基团，如SO3－，可以吸附结合溶液中的其他阳离子。
在这两个反应中，溶液中的阳离子与树脂中的H+实现了互相交换的目的。
由于强酸性树脂极强的离解能力，在酸性或碱性溶液中均能发生离解和并进行离子交换。
树脂在使用了一段时间后，需要用化学药品使此前的离子交换反应以相反方向进行，此即树脂的再生处理，这个操作能使树脂的官能基团恢复到初始状态，以便再次投入使用。
上文中提及的阳离子树脂其再生处理采用的是强酸，此前被吸附的阳离子从树脂中释放出来，随后与H+结合，从而恢复原来的组成。
弱酸性阳离子树脂：
此类树脂含弱酸性基团，如羧基－COOH，由于在水中可离解出H+呈现酸性。
树脂离解后，剩下的负电基团，如R-COO－（R代表碳氢基团），可以吸附结合溶液中的其他阳离子，以达到阳离子交换的目的。
此类树脂的离解性即酸性较弱，因此难以在低pH下发生离解以及离子交换，只能用于pH5～14的弱酸性、中性或碱性的溶液中。
此类树脂的再生也采用酸处理，较之强酸性树脂也更容易再生。
强碱性阴离子树脂：
此类树脂含有强碱性基团，如四级胺基（即季胺基）－NR3OH（R代表碳氢基团），由于在水中能够离解出OH－而呈现强碱性。
此类树脂的正电基团能吸附结合溶液中的阴离子，从而实现阴离子交换的目的。
这种树脂的离解性很强，因此可应用于不同的pH环境中。
其再生处理操作采用强碱（如NaOH）。
弱碱性阴离子树脂：
此类树脂含有弱碱性基团，如一级胺基（即伯胺基）－NH2、二级胺基（即仲胺基）-NHR、或三级胺基（即叔胺基）－NR2[8]，由于其在水中能够离解出OH－而呈现弱碱性。
此类树脂的正电基团能吸附结合溶液中的阴离子，从而实现阴离子交换的目的。
在大多数情况下，此类树脂吸附的是溶液中的整个酸分子，只能应用于pH1～9的中性或酸性环境中。
其再生处理操作可采用Na2CO3、NH4OH进行再生。
离子交换树脂应用于很广泛的领域[9]：
①水处理。
水处理领域离子交换树脂的需求量很大，约占离子交换树脂产量的90%，用于水中的各种阴阳离子的去除。
目前，离子交换树脂的最大消耗量是用在火力发电厂的纯水处理上，其次是原子能、半导体、电子工业等。
②食品工业。
离子交换树脂可用于制糖、味精、酒的精制、生物制品等工业装置上。
例如：
高果糖浆的制造是由玉米中萃出淀粉后，再经水解反应，产生葡萄糖与果糖，而后经离子交换处理，可以生成高果糖浆。
离子交换树脂在食品工业中的消耗量仅次于水处理。
③制药行业。
制药工业离子交换树脂对发展新一代的抗菌素及对原有抗菌素的质量改良具有重要作用。
链霉素的开发成功即是突出的例子。
近年还在中药提成等方面有所研究。
④合成化学和石油化学工业。
在有机合成中常用酸和碱作催化剂进行酯化、水解、酯交换、水合等反应。
用离子交换树脂代替无机酸、碱，同样可进行上述反应，且优点更多。
如树脂可反复使用，产品容易分离，反应器不会被腐蚀，不污染环境，反应容易控制等。
甲基叔丁基醚（MTBE）的制备，就是用大孔型离子交换树脂作催化剂，由异丁烯与甲醇反应而成，代替了原有的可对环境造成严重污染的四乙基铅。
⑤环境保护；离子交换树脂已应用在许多非常受关注的环境保护问题上。
目前，许多水溶液或非水溶液中含有有毒离子或非离子物质，这些可用树脂进行回收使用。
如去除电镀废液中的金属离子，回收电影制片废液里的有用物质等。
⑥湿法冶金及其他；离子交换树脂可以从贫铀矿里分离、浓缩、提纯铀及提取稀土元素和贵金属。
1.2.3发展历史
离子交换树脂最早出现于1935年，当时，英国人亚当斯与霍姆斯发现苯酚磺酸－甲醛逐步聚合物可以进行阳离子交换，在此之后，两人又发现间苯二胺与甲醛的聚合物能够进行阴离子交换[10]。
德国法本公司以及美国的树脂产品和化学品公司分别于1939年和1941年开始进行工业化生产，并分别将商品命名为Wofatit和Amberlite。
1944年，美国人G.F.达莱利奥成功合成了苯乙烯系离子交换树脂。
在第二次世界大战期间，德国的法本公司除了将Wofatit应用于精制水之外，还实现了从人造丝工厂废液中回收铜氨，甚至是从影印厂的工业废液中回收得到了贵金属——银。
在此期间，美国将离子交换树脂应用于从贫铀矿中提取铀，除此之外，在分离核裂变生成物、超铀元素以及稀土元素等方面，Amberlite也起到了极为重要的作用。
一直到二战以后，合成与应用离子交换树脂的技术得到了更进一步的发展，在水纯化的领域中，人们采用混合床脱盐法，制得了电阻率为1800万Ω·cm的高纯水。
上世纪50年代以后，膜状离子交换树脂的研究得以开展，这为电化学领域开辟了新的纪元。
在60年代初期，为了适应尖端科学的发展，耐压、耐磨、高交换速度、能交换或吸着高分子量化合物（如水中的腐植酸）的大孔离子交换树脂研制成功，此后，这些树脂被广泛应用于选择分离稀有金属、贵重金属，环境保护，医药，仿生高分子，选择性膜，金属络合催化等方面。
在70年代之后，各种大孔吸附树脂以及新型的特种树脂又涌现在世人面前。
本实验使用的是D201树脂，属于大孔强碱季铵I型系阴离子交换树脂。
大孔吸附树脂是在离子交换树脂的基础上发展起来的。
1935年英国的B.A.Adams和Holmes发表了由甲醛、苯酚与芳香胺制备的缩聚高分子材料及其离子交换性能的工作报告，从此开创了离子交换树脂领域。
20世纪50年代末合成了大孔离子交换树脂，是离子交换树脂发展的一个里程碑。
上世纪60年代末合成了大孔吸附交换树脂，并于70年代末用于中草药有效成分的分离，但我国直到80年代后才开始有工业规模的生产和应用[11]。
大孔吸附树脂目前多用于工业废水处理、食品添加剂的分离精制、中草药有效成分、维生素和抗菌素等的分离提纯和化学制品的脱色、血液的净化等方面[10,12]。
大孔吸附树脂（MacroporousAbsorptionResin）属于功能高分子材料，是近30余年来发展起来的一类有机高聚物吸附剂[13]，是吸附树脂的一种，由聚合单体和交联剂、致孔剂、分散剂等添加剂经过聚合反应制备而成。
聚合物形成后，致孔剂被除去，在树脂中留下了大大小小、形状各异、互相贯通的孔穴。
因此大孔吸附树脂在干燥状态下其内部具有较高的孔隙率，且孔径较大，在100～1000nm之间，故称为大孔吸附树脂。
大孔树脂的表面积较大、交换速度较快、机械强度高、抗污染能力强、热稳定好，在水溶液和非水溶液中都能使用[14]。
大孔吸附树脂具有很好的吸附性能，它的理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶媒，对有机物的选择性较好，不受无机盐类及强离子低分子化合物存在的影响，可以通过物理吸附的方式从水溶液中有选择地吸附有机物质。
大孔树脂是将吸附性和筛选性原理相结合在一起的分离材料，基于该原理，有机化合物根据吸附力的不同以及分子量的大小，在大孔吸附树脂上经过一定的溶剂洗脱可以达到分离的目的[15]。
由于大孔吸附树脂的固有特性，它能富集、分离不同母核结构的药物，可用于单一或复方的分离与纯化。
但大孔吸附树脂型号很多，性能用途各异，而中药成分又极其复杂，尤其是复方中药，因此必须根据功能主治明确其有效成分的类别和性质，根据“相似相溶”的原则[16]，即一般非极性吸附剂适用于从极性溶液（如水）中吸附非极性有机物；而高极性吸附剂适用于从非极性溶液中吸附极性溶质；中等极性吸附剂，不但能够从非水介质中吸附极性物质，同时它们具有一定的疏水性，所以也能从极性溶液中吸附非极性物质[17]。
1.2.4前景
胆酸类药物的原料十分容易获得，生产工艺也很简单，仅花费少量的投资即可在短期内见效，产品亦可出口，尤为适合中小型企业的初期发展，因此国内诸多中小型及乡镇企业纷纷投资生产胆酸，随着生产厂家的数量上升，其产量也相应地不断扩大。
我国胆酸类药物生产的主要问题是收率不高，为此，各相关企业、大专院校和科研单位正在积极研究与开发新兴的胆酸类药物制备技术，使得胆酸类药物的合成工艺日臻改进、完善，抑或通过寻求更为经济合理的生产工艺路线，以提升收率和终产品品质，从而实现成本的降低，并拓展市场竞争力[18]。
当今世界，开发生产胆酸类药物、以及生产和消费的群体主要集中在欧美、日本和韩国等这些科技发达的国家[19]，此外，我国台湾及东南亚一带也有不容小觑的市场有待拓展。
全世界最大的胆酸类药物消费国为美国，现如今，全球经济发展迅速，人类的生活水平也有了显著提升，各个国家对于胆酸的需求均会有不同程度的升高，需求量将渐渐扩大。
同时，随着人们不断深化研究胆酸类药物的应用，其可适用的领域也将不断拓展。
不难预测，胆酸类药物的生产和应用必然会有极为乐观的发展前景。
在熊去氧胆酸的合成工艺中，CDCA的重要性可见一斑——既是重要的中间体，又是重要的原料，曾经有报道[20]选用CDCA作为原料，经过氧化得到3α-5β-羟基-7-羰基胆烷酸（7K-LCA），再通过还原反应，进而实现合成熊去氧胆酸的目的，张国平[21]报道了在丙酮和水中采用NBS氧化CDCA，从而制得7K-LCA的方法，通过此法成品的收率可达89%。
欧洲专利报道中有提到，当7K-LCA在KOCMe3，Me2CHOH同时存在的情况下，于常压下400C，用金属镍氢化可以得到UDCA，该法产率更是高达95%。
日本专利[22]有报道7K-LCA在高压釜中加热到1000C，NaOH、BuOH和Pd/C同时存在的情况下，氢化5h，通过该法获得的UDCA纯度可达88.2%。
此外，还有报道称可通过其他原料合成UDCA。
由上述事例中不难看出，CDCA始终都是生产UDCA的重要中间体。
1.2.4离子交换树脂的热动力学
离子交换热力学是研究离子交换平衡理论的主要内容，离子交换平衡与许多因素有关，主要是离子交换剂的性质、溶质的种类、溶质及交换剂的用量以及溶质的浓度。
此外，温度也影响离子交换平衡。
表征离子交换平衡的手段主要有离子交换等温线和各种参数。
在离子交换分离过程中，主要的平衡分配关系有线性平衡关系（Henry型）、双曲线型（Langmuir型）平衡关系和幂函数型（Freundlich型）平衡关系。
离子交换动力学模型按照不同的角度区分有各种类型，按表达交换过程动力学定律的性质可以划分为化学动力学型和物理动力学型两类。
其中，后者又有膜扩散型、孔扩散型与表面扩散型等不同的类型。
若按照理论基础区则可分为机理模型和经验模型两类。
机理模型是由交换过程的微观反应机理入手导出的理论模型，如Fiek模型、Nernst-Planck模型、Stefan.Maxwell模型及缩核模型[23]。
此类模型概念清晰，有明确的物理意义，但由于实验条件的不同与限制，直接应用于复杂的实际交换体系很不方便。
而经验模型是由实验数据直接回归得到的，如简单线性推动力模型、平方推动力模型、修正平方推动力模型、双参数模型及多项式模型等，此类模型，推导容易，应用方便，但无明确的物理意义，不能外推。
拟均相扩散模型是应用广泛的动力学模型，它包括Fick模型、Nemst-Planck模Stefan-Maxwell模型。
这些模型之所以称做拟均相扩散模型，是因为它们都假定功能基上的反离子是全部解离的、并均匀的分散在树脂颗粒相。
1992年，Bhand等人[24]对弱碱离子交换树脂吸附强酸的离子交换过程进行了研究。
研究发现，矿被排斥在树脂相外的程度比预想的要小得多。
Bhandari分析这种原因，认为树脂相中的反离子没有全部解离，而是以双电层的形式分布在孔道中。
1996年，Hasnat等人对强酸离子交换树脂的离子交换动力学进行了深入研究。
并在Bhandari等人的基础上，进一步完善了非均相颗粒扩散模型。
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