药品生产验证指南 第三篇 检验方法和清洁验证无菌保证.docx
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药品生产验证指南第三篇检验方法和清洁验证无菌保证
第三篇检验方法和清洁验证、无菌保证
第一章检验方法验证
第一节概述
一、引言
药品的生产过程中，原料、中间体、成品均需进行检验，检验结果既是过程受控的依据，也是评价产品质量的重要依据，检验结果应具有准确可靠。
而检验方法的验证为检验结果的准确及可靠提供了有力保障。
国内外在检验方法的验证方面已有了许多法规、规定。
如美国食品药品管理局（FoodandDrugAdministration，简称FDA）1994年11月公布了《色谱方法的验证》（ValidationofChromatographicMethods）；1987年2月公布新品注册相关的《送样及上报检验方法验证资料指南》）（GuidanceforSubmittingSamplesandAnalyticalDataforMethodsValidation）；人用药品注册技术要求国际互认协会（theInternationalConferenceonHarmonizationofTechnicalRequirementsforRegistrationofPharmaceuticalsforHumanUse，简称ICH）1995年3月颁布了《分析方法的验证》》（TextonValidationofAnalyticalProcedures），规定了需进行验证的方法的种类和应考察的项目，还对分析方法、专属性、准确度、精密度、重现性作出明确定义，从而统一了各国药典和法规对这些术语的解释；作为对《分析方法的验证》的补充、扩展，ICH于1996年11月颁了《分析方法的验证：
方法学》（ValidationofAnalyticalProcedures．Methodology）；美国药典第24版<1225>规定了《药典方法的验证））（ValidationofCompendialMethods）；中国药典2000版附录ⅩⅨA规定了《药品质量标准分析方法验证》。
这些法规、规定从不同方面对检验方法的验证作了规定，它们是实施检验方法验证的重要依据。
本章将着重讨论检验方法验证的基本内容，并以示例形式介绍验证的基本实践，以使本章的内容具有可操作性。
方法验证有以下几个先决条件，在进行方法验证以前，必须逐条进行检查［1］。
（1）仪器已经过校正且在有效期内。
（2）人员人员应经过充分的培训，熟悉方法及所使用的仪器。
（3）参照品参照品的来源一般有3个：
购自法定机构（如中国生物制品检定所）的法定参照品；购自可靠的供应商，如Sigma，Merck等；自备参照品，其纯度和性能可自行检测或由法定检验机构检测。
（4）材料所用材料，包括试剂、实验用容器等，均应符合试验要求，不给实验带来污染、误差。
如进行高效液相色谱分析时，所用试剂应为色谱级；检查铁盐时使用的盐酸不得含有铁盐等。
（5）稳定性应在开始进行方法验证前考察试验溶液和试剂的稳定性，确保在检验周期内试验溶液和试剂是稳定的。
使用自动进样器，一般是预先配制好一系列样品溶液置进样器中，依次进样。
这时要确保进样周期内样品溶液是稳定的。
随着科学技术的发展，仪器分析在检验方法中所占的比例越来越大。
为保证分析数据的可靠性，仪器的确认也就显得越来越重要。
仪器的确认一般分为安装确认、运行确认、性能确认、预防性维修和再确认5个方面。
本章将用一定篇幅对这5方面进行介绍。
常规化验中常用的容量仪器、分析天平的校正以附录形式附后，便于验证中使用。
二、检验方法验证的意义
检验方法的验证是质量保证体系的重要组成部分，它的必要性至少可从以下4个方面来认识。
（一）药品标准的建立和执行需要经验证的检验方法
《中华人民共和国药品管理法》［2］第五章“药品管理”第三十二条明文规定“药品必须符合国家药品标准”。
第二章“药品生产企业管理”第十二条明文规定“药品生产企业必须对其生产的药品进行质量检验；不符合国家药品标准或者不按照省、自治区、直辖市人民政府药品监督管理部门制定的中药饮版炮制规范炮制的，不得出厂”。
众所周知，药品标准由两部分基本内容组成：
一是项目的规格标准或限度；二是相应的检验方法和操作步骤。
新品开发建立的药品质量标准必须同时包括这两个方面的内容。
只有项目的规格标准或限度，没有具备一定准确度、精密度和重现性的检验方法、操作步骤，就不成其为药品质量标准。
对于现行版药典收载品种的质量标准，我国2000年版药典二部“凡例”第十四条有明确规定“本版药典收载的原料药及制剂，均应按规定的方法进行检验如采用其他方法，应将该方法与规定的方法做比较试验，根据试验结果掌握使用，但在仲裁时仍以本版药典规定的方法为准。
”这里所说的与规定方法的比较试验，其实际含义即是用其他方法进行分析时，必须对该方法进行验证并确认该方法可靠准确时方能使用。
（二）工艺过程的监控需要经验证检验方法
从质量保证的观点出发，厂房、设备、工艺经过验证投入正常运行后，应当对已验证过的状态进行监控。
这种监控包括以下方面。
（1）工艺环境例如，冻干制及粉针无菌分装区洁净级别的监控。
（2）生产作业如无菌过滤器使用前后的完好性检查；又如对输液产品而言，能综合反映工艺环境、生产作业、人员个人卫生等状况的灭菌前药液含菌量的监控。
（3）介质如氮气的纯度控制、生产用水的质量控制。
（4）原料和辅料的质量监控如药用级大豆油中脂肪酸组分的测定；气雾剂生产用的氟里昂中水分的检查；某些原料晶形的检查以及往往被忽视的原辅料细度的检查等。
另外，成品检验结果的统计分析可用于证明已验证工艺的受控状态，如一些固休制剂含
量均匀度检查、含量测定、溶出度测定、崩解时限、注射剂的澄明度等都能从某个方面反映工艺过程的受控状态。
所有这些都离不开检查方法，没有经过验证的、可靠的检验方法，药品质量保证将是一句空话。
（三）药品的商业交换需要经验证的检验方法
药品的商业交换需要验证的检验方法是不言而喻的，生产单位的检验结果与使用单位或监控管理部门的检验结果应在允许范围之内。
如抗生素、肝素钠的商业交换以效价为单位结算费用，如果检验结果不准确，不仅可能带来经济上的损失，更重要的是影响到企业的信誉。
由于方法没有验证，厂方自己的内控方法没有和法定的方法进行验证和对照，供需双方检验结果不一致，引起纠葛，甚至导致客户大批退货事件的发生也是不足为怪的。
总之，法定的、经过验证的方法是药品进行商业交换的必要条件。
（四）药品生产验证需要经验证的检验方法
药品生产验证中不论何种剂型都涉及到检验方法的检验。
分析检验工作通常被人们比作一个人的眼睛，通过分析检验才能对药品质量作出判断。
如果检验方法没有经过检验，在准确性和重现性上存在问题，无论如何进行检验都是徒劳的，对药品质量的评价是盲目的。
药品生产验证中使用的检验方法应经过验证后方能使用。
GMP的基本实践告诉我们，为确保工艺的可靠性和重现性，工艺必须验证；同样，为确保检验方法的准确性和重现性，检验方法同样必须进行验证。
第二节验证的定义及分类
一、验证的定义
WHO1992年版的GMP对验证的定义为：
“能证实任何程序、生产过程、设备、物料、活动或系统确实能导致预期结果的有文件证明的行动。
”按此定义来理解，工艺验证和检验方法验证两者之间有相同或相似的特点。
（一）目标相似
对工艺验证的要求是实现工艺的可靠性和重现性，始终如一地生产出符合预定规格及质量的产品为最终目标。
对检验方法验证的要求则是检验方法的准确度和重现性，始终如一地获得符合客观实际的数据或结果为最终目标。
（二）手段相似
工艺验证以关键工艺变量的控制为手段，检验方法的验证则以控制检验的试验条件为手段。
（三）主体相同
都必须包括GMP中最为活跃的因素——人员。
验证的过程也同时是一个人员在职培训的过程。
（四）前提相同
工艺验证的前提是在产品开发阶段已完成配方及工艺条件的优化工作。
检验方法验证的前提是在检验方法开发阶段已完成方法的测试条件的优选工作，排除了干扰因素。
（五）类型相同
两者都有3种基本的验证类型：
前验证、回顾性验证和再验证。
二、验证的分类
检验方法的验证工作可分为3种类型：
前验证、回顾性验证和再验证。
（一）前验证
检验方法的前验证系指在方法正式投入使用前按照设定的方案进行试验，收集证据以证实检验方法达到预期要求的一系列活动。
前验证的基本步骤和内容可参见第一篇第三章第四节。
（二）回顾性验证
检验方法的回顾性验证系指利用对现有的历史数据进行统计分析，收集证据，以证明检验方法达到预期要求的行为。
对以下两种情况可实施回顾性验证。
①一检验方法已长期使用，结果稳定，由于方法投入使用时，法规尚无方法验证方面的要求，因而缺乏必要的原始验证资料。
②对某一方法的验证数据表示怀疑时。
这类验证的先决条件是生产的工艺条件没有变更，有完整的批生产记录和批检验记录可进行追溯。
每批的投料量和检验的结果，生产作业中出现的偏差和纠正措施以及检验过程中出现的异常情况等均有据可查。
如果一个方法在使用过程中曾做过若干次修改，相应的数据应分段进行统计分析。
在回顾性验证中，可以把产品各批的样品作为一个系列具有目标值的“标准”来看待，把相应的检验结果与之比较，如果检验结果的平均值是目标值且处在一个统计的控制状态，便证明了检验方法的可靠性和重现性。
对上述历史数据进行汇总，统计分析及综合评价并经过批准的报告即是回顾性验证的文件。
第二个进行回顾性验证的方法是利用对照品和相应的辅助材料在实验室配制“检验标准”，得到一系列已知浓度的样品，进行常规检验，把分析结果记录于控制图上。
如果分析结果的平均值接近“标准”，并处在统计的控制状态，那么这些结果可用于验证的目的。
另外，由于实验室不具备生产车间的工艺条件，如车间制粒、灭菌等，这些因素对结果可能产生的影响也应加以考虑。
实际上，在实验室配制“检验标准”将结果和标准比较的方法是一种后补措施，用现实来推断历史。
在可能条件下应尽可能采取前验证的方法进行验证，以减少质量及经济方面可能的风险，提高质量保证的可信度。
（三）再验证
出现下述情况时需对检验方法进行再验证。
①仪器更新或大修。
②检验方法获得的结果作趋势分析，发现系统性偏差。
③对检验方法进行了修订或检测条件发生了变更。
④经过一段使用时间，对检验方法的再验证。
再验证的目的是证实验证的状态没有发生飘移。
第三节检验方法验证的基本内容
一、检验仪器的确认[3]
检验仪器是一统称，它实际分为两类。
一类是测量仪器，只进行测量，不涉及分析过程。
如计时器、温度计、天平、pH计、分光光度计、HPLC中的检测器等。
计量仪器如容量瓶、移液管、滴定管等通常也归人此类。
另一类是分析仪器，它不仅进行测量，还有一分析过程。
如HPLC系统，它先将样品组分进行分离，然后再用检测器进行检测，即测量。
测量仪器只需进行安装确认和校正，无需进行其他确认步骤。
分析仪器的确认一般分为安装确认、运行确认、性能确认、预防性维修和再确认5个方面。
测量仪器的确认因比较简单，故本章只在示例中讨论中加以说明。
以下着重讨论分析仪器的确认。
安装确认指资料检查归档、备件验收入库、检查安装是否符合设计和安装要求有记录和
文件证明的一系列活动。
同工艺验证中生产设备一样，仪器安装确认的主要内容包括如下几点。
①按订货合同核对所到货物正确无误，并登记仪器代号、名称、型号、生产厂商名称、生产厂商的编号、生产日期、公司内部固定资产设备登记号及安装地点。
②检查并确保有该仪器的使用说明书、维修保养手册和备件清单，并收集、汇编和翻泽（必要时）仪器使用说明书和维修保养手册。
③检查安装是否恰当，气、电及管路连接是否符合供货商的要求。
④制定使用规程和维修保养规程，建立使用日记和维修记录。
⑤制定清洗规程。
⑥明确仪器设备技术资料（图、手册、备件清单、各种指南及与该机器设备有关的其他文件）的专管人员及存放地点。
除上面提到的内容外，在安装确认方案中对仪器的性能用途应有一概述并记录维修服务单位的名称，联系人电话号码、传真号、银行账号等。
以利于日后的维修保养活动，这对大型精密仪器尤为重要。
进行运行确认前，应有一份安装确认报告，以文件形式来说明安装确认的有关工作已经完成并符合要求。
运行确认即为空载试验，它在不使用样品的前提下，确认仪器达到设计的要求。
如气相色谱仪的程序升温设定后能否按设定程序执行，溶出仪转速能否达到规定的性能要求，紫外分光光度计的吸收度与透光率的转换是否符合要求等。
对于高效液相色谱（HPLC）系统的运行确认，其内容可参见表3—1。
运行确认前应确定校验方法及限度。
校验方法及限度可参照生产厂家推荐的方法及限度，也可参照使用者的要求。
现在许多大型仪器的运行确认都由仪器生产厂家专派技术人员前来进行，此时只需将他们的测试数据记录下来即可，没有必要再单独重复进行一次运行确认。
性能确认主要考察仪器运行的可靠性、主要运行参数的稳定性和结果的重现性。
通常取某一样品按给定方法进行试验，考察结果是否符合方法设定的要求。
性能确认一般与具体分析方法相联系，如系统适用性试验即属于性能确认的范畴。
预防性维修（Preventive－maintenance）是许多HPLC生产厂商建议进行的步骤。
预防性维修是为了确保仪器处于良好的使用状态，根据仪器的类别、确认的经验制定的维修计划。
它可以减少由于仪器故障而引起实验失败的次数。
预防性维修的频率取决于仪器的使用情况，一般刚开始时定为12个月，而后根据实际情况延长或缩短。
预防性维修的内容一般是对仪器主要的性能参数进行检查，确认其在设定的范围内，实际上是进行一次运行确认。
对于不符合规定的元件，则进行适当的修理或更换，使其达到要求。
再确认一般在分析仪器经过较大的变更后进行，如经过修理或其中的元件被更换等，其目的是在证实已确认的状态没有发生飘移。
再确认一般只需运行确认和性能确认即可。
每件仪器在确认前都应有确认计划，按确认计划进行确认。
确认结束后应有仪器确认报告，记录确认过程及原始数据。
仪器确认报告应归档保存，以便查阅。
表3－1HPLC系统运行确认试验及限度
各仪器名称
仪器中各组件
功能
试验项目
限度
泵
流量控制阀
向系统输出流动相
流速准确度
5%
流动相比例控制阀
控制各流动相的比例
流动相混合比例的准确度
±［F（1－F）10％，F为所测流动相组分所占的体积比
自动进样器
进样体积控制阀
将定量体积的样品注入色谱柱
精密度
RSD应≤1.0％
柱温箱
温度控制器
保持色谱柱的温度
准确度
精密度
≤土3.0℃，波动应在1.0℃内
UV检测器
单色器
从连续光谱中分离出
单色光
准确度
土3nm
光电管
测定样品的吸收度
线性
相关系数不得小于0.999
二、检验方法验证的类型及基本要求
（一）概述
方法验证的目的是证明所采用的方法达到相应的检测要求。
由于分析性质的差异，本节中所讨论的验证内容不适用微生物分析方法，微生物分析方法的验证将在本章第四节中介绍。
验证的内容主要包括准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、范围、粗放性和耐用性9个方面。
药典收载的方法一般比较成熟，需验证的内容与新开发的检验方法有很大差异，美国药典中明确规定其所收载的方法需做系统适用性试验，这即是美国药典对方法验证的要求。
某一方法需到底须进行哪些项目的验证，应根据实际情况而定，并不是所有的方法都必需进行以上9个方面的验证试验。
方法验证的范围，一般来说，可分以下3种情况区别对待。
①对于直接弓1用有法定依据的方法，如药典标准和部颁标准，仅做系统适用性试验即可。
但若将法定方法用于测定新药，或将某一品种的法定测定方法用于另一品种，就需进行系统的方法验证。
②对于已在一实验室验证过但需在另一个实验室使用的分析方法，可采用对照试验法。
即取同一批样品，按此方法在两实验室分别进行检验，将结果进行比较（如用t检验法计算），判断是否有显著性差异。
这特别适用于大公司（包括跨国公司）的情况。
母公司完成了系统的方法验证工作，子公司实验室均可用结果对照的方法进行判断，节省了大量人力、物力。
国外称这种做法为“技术转移”（Technicaltransfer）。
③其他分析方法可分为4种类型，验证要求可参见表3—2［4］。
（二）验证的内容及基本要求
1．准确度
准确度是指用该方法测定的结果与真实值接近的程度，一般用回收率表示。
准确度的测定至少要取方法范围内的3个浓度级别，每个浓度级别至少要测定3次。
如某方法的范围是80％～120％，则应取80％、100％、120％3个浓度，每个浓度测定3次，计算9个测定结果的回收率及相对标准偏差，回收率及相对标准偏差均应在规定限度之内。
（1）原料药含量分析可通过分析已知纯度的对照品或样品进行测定；或用本法所得结果与另一已验证的方法所得结果进行比较。
（2）制剂中各组分的含量分析按制剂处方取适量各组分进行有机混合得一混合物进行测定，从而确定方法的准确度。
若不可能得到处方中所有组分，可往制剂中加入已知量的被分析物进行测定；另一方法是把此方法的分析结果与另一已建立准确度的方法的分析结果进行比较。
表3－2不同分析方法的验证要求
验证项目
类型
类型I
类型Ⅱ
类型Ⅲ
类型Ⅳ
定量测定
限度试验
准确度
精密度
专属性
检测限
定量限
线性
范围
要求
要求
要求
－
－
要求
要求
要求
要求
要求
－
要求
要求
要求
*
－
要求
要求
－
－
*
*
要求
*
*
*
*
*
－
－
要求
－
－
－
－
注：
“－”表示不作要求；“*”表示需根据实验特性决定是否作要求。
类型I指用于测定原料药中主要成分或制剂中活性组分（包括防腐剂）的定量分析方法。
类型Ⅱ指用于测定原料药中杂质或制剂中降解产物的分析方法，包括定量分析和限度试验。
类型Ⅲ指用于测定性能特性（如溶解度、溶出度）的分析方法。
类型Ⅳ指鉴别试验。
（3）杂质的定量分析往样品中加入已知量的杂质进行测定；若不可能得到某种杂质或降解产物，可把此方法的分析结果与另一已验证的方法的结果进行比较来确定。
杂质的量可用杂质与主药响应值的比值来表示。
2．精密度
精密度指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。
精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差（变异系数）表示。
精密度又分为重复性、中间精密度、重现性3类。
在相同条件下，由同一分析人员测定所得结果的精密度称为重复性；在同一实验室，不同时间由不同分析员用不同设备测定结果的精密度，称为中间精密度；在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度，称为重现性。
（1）重复性方法重复性的确定至少要取方法范围内的3个浓度级别，每个浓度级别至少要测定3次；或取100％的样品浓度至少测定6次。
应自样品制备开始制备6份样品溶液，所得结果的相对标准偏差即为方法重复性。
自动进样器重复性的测试，一般取同一样品溶液至少重复进样10次，其相对标准偏差不应大于l％。
（2）中间精密度中间精密度主要是为考察随机变动因素（如时间、人员、设备等）对精密度的影响，但不必对每个可能的影响因素进行单个的考察，可设计方案对其进行统一考察。
色谱分析方法由于受外界因素的影响较大，故一般需考察中间精密度，至少应在两种不同条件下进行考察（如不同时间，更换实验人员等）。
（3）重现性一般实验室不进行此项考察，只有当分析方法将被法定标准采用时，才进行重现性试验。
建立药典分析方法时常需通过协同检查得出重现性的结果。
如紫外分光光度法中吸收系数Σ1%1cm的确定，需通过5个以上实验室分析，测定结果符合数理统计要求，才能采纳使用，收入标准。
准确度和精密度之间没有必然的联系。
测量的精密度不能说明测量值与真值的关系，精密的测量值不一定是准确的，因为引起测量值远离真值的误差可能会对一系列的测量发生同样的影响，而不影响精密度，这即是系统误差的概念。
3．专属
专属性系指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性。
对于鉴别试验，应证明当样品中含有被分析物时呈正反应，当不含被分析物时呈（阴性）负反应。
必要时，需证明与被分析物结构相似或相近的物质均不呈正反应。
对于杂质的测定，一般取含一定杂质量的样品进行分析，证明此杂质测定其具有适宜的准确度和精密度即可。
对于含量分析，可通过加入一定量的杂质或赋形剂至样品中，通过分析证明结果不受影响。
若杂质或降解产物为未知物，可将样品用强光照射、高温、高湿、酸碱水解或氧化的法进行加速破坏，而后将此样品进行分析，将分析结果与另一个经验证的方法或法定方法得结果进行比较。
含量测定应比较两方法的分析结果，杂质测定若有色谱图，则应对比杂质峰的形状。
检测限指样品中被测物能被检测出的最低量。
（1）非仪器分析目视法通过用已知浓度的样品分析来确定可检出的最低水平作为检测限。
（2）仪器分析方法可以非仪器分析所用的目视法来确定检测限，也可用已知浓度的样品与空白试验对照，以信噪比为2：
l或3：
l来确定检测限的最低水平。
不论用哪种方法，均需制备相应检测限浓度的样品，反复测试来确定。
5．定量限
定量限系指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。
杂质和降解产物用定量测定方法研究时，应确定定量限。
（1）非仪器分析方法与检测限的非仪器分析方法所用方法相同，只是所得结果需符合一定的准确度和精密度要求。
（2）仪器分析方法一般以信噪比为10：
1时相应的浓度作为定量限的估计值，然后配制相应定量限浓度的样品，反复测试来进行确定。
6．线性
线性指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程序。
应在规定的范围内测定线性关系。
可用一贮备液精密稀释或分别精密称样，制备一系列的供试品（至少5份不同浓度的供试品）进行测定。
以测得的响应信号作为被测物浓度的函数线性回归，求出回归方程及相关系数。
7．范围
范围指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。
分析方法的范围应根据具体分析方法以及对线性、准确度、精密度的结果和要求确定。
无特殊要求时，通常采用以下标准。
①对于原料药和制剂的含量测定，范围应为测试浓度的80％～20％。
②杂质测定，范围应为测试浓度的50％～20％。
③含量均匀度，范围应为测试浓度的70％～130％，根据某些剂型的特点（如气雾剂），此范围可适当放宽。
④溶出度范围应为标准规定范围的土20％。
、如某一剂型的溶出度规定，1h后溶出度不得小于20％，24h后溶出度不得小于90％，则考察此剂型的溶出度范围应为0～110%
⑤若含量测定与杂质检查同时测定，用百分归一化法，则线性范围应为杂质规定限度的－20％至含量限度的20％。
8．粗放性
分析方法的粗放性（Ruggedness）指在不同实验条件下（如不同实验室、不同实验员、不同仪器、不同批的试剂、不同的分析温度、不同时间等）对同一样品进行分析所得结果重现性。
此实验条件应仍在方法规定的限度内。
将在不同实验条件下所得结果的重现性与方法的重复性进行比较，来衡量分析方法的粗放性。
9．耐用性
耐用用性（Robustness）指测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。
典型的变动因素有：
被测溶液的稳定性，样品提取次数、时间等。
液相色谱法中典型的变动因素有：
流动相的组成和pH、不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱、柱温、流速等。
气
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