Western Blot 操作.docx

Western Blot 操作.docx

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WesternBlot操作

Content

1.Objective

2.Scope

3.Materials

ØReagents

ØInstrument

ØConsumable

4.Procedure

5.Changinghistory

1．Objective

－鉴定蛋白表达情况－

2.Scope

－－本SOP适用于Western-Blot试验操作

3．Procedure

仪器：

高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。

试剂：

单去污剂裂解液、0.01mol/LPBS（pH7.3）、12％分离胶、5％浓缩校、2XSDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、一抗（由委托人提供）、HRP-羊抗鼠二抗、HRP-羊抗兔二抗、ECL化学发光试剂、显影液、定影液。

杂品与耗材：

各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；PVDF膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（>20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，

试剂配制：

1.0mol/LTris·HCl

Tris（MW121.14）30.29g

蒸馏水200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。

PHHCl

7.4约17ml

7.5约16m

7.6约15ml

8.0约10ml

10％SDS

SDS10g

蒸馏水至100ml

50℃水浴下溶解，室温保存。

如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。

10％过硫酸胺（APS）

过硫酸胺0.1g

超纯水1.0ml

溶解后，4℃保存，保存时间为1周。

1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）

Tris（MW121.14）45.43g

超纯水200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。

0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）

Tris（MW121.14）15.14g

超纯水200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。

30％Acr

丙稀酰胺（Acr）29g

甲叉双丙稀酰胺（Bic）1g

超纯水至100ml

溶解后，0.45μm滤膜过滤后4℃保存。

使用时恢复至室温且无沉淀。

0.01mol/LPBS（pH7.2-7.4）

Na2HPO42.9g

KH2PO40.2g

NaCl8g

KCl0.2g

蒸馏水至1000ml

12％分离胶和5％浓缩校

10mL12％分离4mL5％浓缩胶

超纯水3.3ml2.7ml

30％Acr4.0ml0.67ml

1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）2.5ml－

1.0mol/LTris·HCl（pH6.8）－0.5ml

10％SDS100l40l

10%AP（过硫酸胺）100l40l

TEMED4l4l

加TEMED后，立即混匀即可灌胶。

还原型2XSDS上样缓冲液

1.0mol/LTris·HCl（pH6.8）0.5ml

SDS0.2g

溴酚蓝10mg

甘油1.0mL

DTT，MW154.5）0.39g

临用前取1.0mol/L贮存液DTT1.0mL加入4.0mL2XSDSloadingbuffer，混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存,一周内用完。

DTT

DTT5.0g

DDW32.4Ml

分成小份，-20度保存。

5*Tris-GlycineBuffer电泳液缓冲液

Tris（MW121.14）15.1g

甘氨酸（MW75.07）94g

SDS5.0g

蒸馏水至1000ml

溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。

10*转移缓冲液

甘氨酸（MW75.07）14.5g

Tris（MW121.14）29g

SDS0.5g

蒸馏水至500ml

溶解后室温保存，临用前取200mL甲醇加入800mL转膜缓冲液中共1000mL。

次溶液可重复使用3～5次。

TBS缓冲液

1mol/LTris·HCl（pH7.5）10ml

NaCl8.8g

蒸馏水至1000ml

TBST缓冲液（含Tween20的TBS缓冲液）

0.05％Tween200.25ml

TBS500ml

混匀后即可使用，最好现用现配。

1*TBST1L

Trisbase2.422g（MW121.4）

Nacl8.775g

Tween200.5ml

封闭液（含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液）

脱脂奶粉（国产，安怡牌）5g

TBST100mL

溶解后4℃保存。

使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。

显影液

一小袋溶于250mLDDW中，棕色瓶保存。

定影液

一盒溶于1000mLDDW，室温棕色瓶保存。

抗体

用封闭液稀释至一定浓度使用，每张膜需0.5ml。

ECL化学发光试剂

购自碧云天，分A和B两种试剂。

操作步骤：

（一）SDS－PAGE电泳

（1）清洗玻璃板：

一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

（2）灌胶与上样

1玻璃板对齐后放入夹中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。

（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

）

2按前面方法配12％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。

然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。

（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。

操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。

加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。

）

3当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。

再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

4按前面方法配5％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。

灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。

插梳子时要使梳子保持水平。

由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。

待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

5用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。

（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。

若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。

）

6测完蛋白含量后，计算含50g蛋白的溶液体积即为上样量。

取出上样样品至0.5ml离心管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×。

（上样总体积一般不超过15l，加样孔的最大限度可加20l样品。

）上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。

7加足够的电泳液后开始准备上样。

（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。

）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。

将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。

（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。

加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。

（3）电泳

电泳时间一般4～5h，电压为40V较好，也可用60V。

电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。

（二）转膜

（1）转一张膜需准备2张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的硝酸纤维素膜。

切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。

将切好的硝酸纤维素膜置于转膜缓冲液中浸15min才可使用。

（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。

这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。

若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。

（2）在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。

（3）将夹子打开使黑的一面保持水平。

在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。

（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。

）在垫子上垫一层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。

（4）要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。

撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。

（撬时一定要小心，玻板很易裂。

）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。

小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。

将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。

在膜上盖3张滤纸并除去气泡。

最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。

整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。

膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。

（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。

）

（5）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。

电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。

一般用60V转移2h或40V转移3h。

（6）转完后将膜取出，可以看到预染Marker已经转印到膜上了，这个过程要保证膜的湿润，不能干燥，否则会产生较强的非特异性。

膜一：

A1B1C1D1A2B2C2D2A3B3C3D3

2

1

5

3

膜二：

1Occluding65kD

2ZO-1220kD

3Claudin-122kD

4Claudin-422kD

5JAM-A36-41kD

6PKC80kD

7UGT64kD

内参βactin42kD

分别将目的蛋白周围的膜切开，以DDW冲洗。

分别加入相应一抗。

（三）免疫反应

（1）将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。

（2）将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5ml离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。

（3）同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，进行化学发光反应。

（四）化学发光，显影，定影

（1）将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。

（2）在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。

显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影