细胞工程动物组织和细胞的培养.docx

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细胞工程动物组织和细胞的培养

第4节动物细胞培养

一动物细胞培养类型

（一）细胞原代培养

1.取材分离

·取出组织块放入小烧杯中，用尖嘴剪刀将组织

块剪碎成1mm3大小，加入Hanks液（平衡盐水

BSS），冲洗数次。

·

Adult

Embryo

Egg

取材分离

Dissection

EnzymeDigestion

CellCulture

Finelychopped

PrimaryExplants

Furtherdissection

ifnecessary

OrganCulture

2.组织消化：

·是用酶法将剪碎的组织块分散成

细胞团或单细胞。

·将剪碎的组织块放人三角烧瓶中，

加人30～50倍体积的0.25％浓度

胰蛋白酶；

·消化：

37℃水浴内消化30～60分

钟。

·过滤：

如果大部分细胞已经分散，

终止消化，以不锈钢筛过滤

（100μm）滤除未被消化的组织块。

·离心：

8000rpm/min离心5分钟，

弃上清液,沉淀为细胞。

·漂洗；Hanks液漂洗两次，每次

2～3分钟，加人营养液。

3.细胞计数

·细胞悬液制成后，需要计数

悬液中细胞的浓度，通常以

细胞个数／ml表示。

检查方

法如下：

·1）在干净的离心管中加人数滴

细胞悬液，再加人6.4％台盼蓝

（trypanblue）1滴，混匀后静

置2～3分钟；

·2）将计数板（如图）平放在显

微镜台上，在盖片边缘加人l～2

滴染色的细胞悬液，使之完全充

满计数板与盖片间的空间，勿留

气泡，勿使盖片漂浮；

·3）显微镜下记录计数板四角

四个大格中的细胞总数，原

则是:

染蓝的细胞不数（死

细胞），无色的细胞计数

（活细胞），一团细胞按一

个细胞计数。

·计数时要注意：

·如果细胞团数超过10％，说明

消化过程进行的不充分；

·如果细胞数少于20-50个说明

稀释的不当.

（二）传代培养

·当原代培养成功后，细胞分裂增

殖扩展连片，占满器皿表面。

·这时需要对其分离重新培养，这

一操作过程称之为传代。

·有80％～90%或刚刚全部汇合的

细胞，是传代的理想时期。

具体方法如下：

1）吸出培养瓶内旧培养液；

2）加人胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶

底对细胞进行消化；

3）吸出消化液，加人Hanks液，洗去

残留的消化液。

4）加入培养液，用吸管轻轻吹打瓶壁，

使细胞脱落制成悬液，计数后记录

其浓度；

5）重新接种培养

Tissuecultureflasks

·T-flasks

·Petridishes

（三）微载体培养

（microcarrierculture）

·1967年，VanWezel开发了

微载体系统培养贴壁细胞。

微载体是直径为60-250μm

的微珠。

·最初使用的材料为二乙基氨

基乙基－交联葡聚糖A－50

·后经改进，用带不同基团的葡

聚糖（dextran）交联成几种

大分子，以利于细胞的贴壁及

生长。

·目前使用的dextranI、Ⅱ、

Ⅲ三种型号都属于交联葡聚糖

为基质的微载体，每种微载体

所带基团各不相同。

微载体培养细胞的具体步骤

1）选择合适的微载体类型

●先用少量三种微载体做细胞培

养试验，一定时间内计算细胞

贴壁数量，比较细胞用量、微

载体用量，以此选出适当的微

载体。

（2）浸泡水化及消毒

·在玻璃容器中加人适量的微载体，

加入磷酸缓冲液（PBS）浸泡3小

时以上，轻轻搅动。

·搅动速度50～70rpm／min为好。

·高压蒸汽灭菌，

（3）接种

·根据细胞类型决定接种浓度，

例如，人成纤维细胞的适宜接

种浓度为10cells／微载体；

非洲绿猴肾细胞（vero）为5

cells／微载体。

·接种要达到一定浓度，但过高

也不利。

培养中的搅拌转速：

·提供均相培养环境

·防止微载体集聚

·促进汽液交换

·30-120r/min

（4）培养观察

·显微镜直接观察微载体上细胞生长

·将微载体上的细胞消化下来计数并

计算其浓度:

·取1ml均匀的培养细胞样品，待微载

体沉淀后吸去上清液，加PBS液清洗。

·加胰蛋白酶37℃消化15min，吸

出消化液后加到培养液中，过滤

分离微载体，离心弃上清夜，保

留细胞沉淀；

·加美蓝染液2ml，血球计数器计

数，计算细胞浓度。

（5）消化

·传代培养或收获细胞均需使细胞脱

离微载体，通常采用酶消化法。

消化步骤：

·停止搅动，待微载体沉淀后，去净培养液，

用含0.25％EDTA的PBS（pH6.7），按50～

l00ml／g微载体量清洗微载体，弃EDTA-PBs。

·加人胰蛋白酶一EDTA，37℃搅动消化15min

·加人含10%血清的培养液，终止消化作用。

（6）分离细胞

·脱离微载体的细胞培养液放人容

器，

·离心沉淀微载体（400r／min，2

分钟）收集细胞。

·还可用过滤方法，采用直径

100μm孔径的尼龙网、不锈钢网

等可将细胞与微载体分离开。

（7）传代培养

·微载体上分离下来的细胞可进一步做微

载体传代培养。

·可在细胞脱离微载体后，转接细胞，加

人一些新的微载体以增大培养体积。

·另一种放大培养方法：

也可在微载体长

满细胞后直接加人微载体,更换培养基。

（四）微囊化培养

（microcapsuleculture）

·微囊是用一种人造的半透膜

制成的多孔微球体，小分子

物质可以自由透过，而各种

酶、辅酶、离子交换剂、活

性炭及蛋白等大分子物质包

裹在其中不能逸出；

·细胞生长在各自的

微小环境里受到一

定的保护。

·减少了搅拌对细胞

产生的剪切力

·由于环境的改善，

细胞得到很好的生

长，代谢产物浓度

增加，纯度提高。

·制备动物细胞微囊所用的材料，主

要是海藻酸（ALG）和多聚赖氨酸

（PLL）.

·海藻酸和多聚赖氨酸分子量的大小

及其溶液的浓度；细胞与海藻酸钠

混合的时间；溶液的pH，温度等都

会影响微囊膜直径的大小.

微囊制作

1）分离好的细胞悬浮在1.0

％～1.2％的海藻酸钠液

中，细胞终浓度达到

1×107cells／ml；

2）细胞悬浮液经微囊发生

器制成微滴，将微滴加人

1.3%CaCl2溶液后成凝胶球，

10分钟后，去除上清收集

胶球;

3）加人0.05％的聚赖氨酸，

微球胶体颗粒表面包裹一

层膜.

·例1:

应用微囊化方法培养杂交瘤细胞

时，微囊膜孔径大小控制截留

8×104D以内的分子量，免疫球蛋白

IgG（杂交瘤细胞产生的单抗）的分

子量为1.5×105D。

·当细胞生长稳定，达到6×107cells

／ml培养液时，抗体的产量可高达

1.5mg／ml。

·例2:

将分离的胰岛细胞培养

1～3天后，按1.75×103

cells／ml浓度悬在1.5‰海

藻酸钠溶液中制成微囊，按

4×103个微囊／只老鼠，腹

腔植人培养一段时间后，老

鼠血糖下降,保持了一年。

二、影响动物细胞体外培养的环境

因素

1、培养温度

·哺乳类细胞的最适培温度37℃，鸡

细胞在39～42℃，昆虫类细胞25～

28℃，冷水鱼细胞23℃，温水鱼

26℃。

·细胞对低温的耐受力强于高温，

有人做过实验：

·放在45℃温度下，1小时死亡；

·放在41～42℃下，10～24小时细

胞退化或死亡；

·放在在25～35℃时，细胞缓慢生

长，

·放在4℃下几小时后再放人37℃下

培养，细胞仍能生长。

2、培养液的pH值

·大多数动物细胞都适合在

pH7.2～pH7.4范围内生长.

·原代培养细胞对pH值要求较严，

传代培养细胞对pH值要求较宽。

·细胞对偏酸环境的耐受性要强

于偏碱环境。

·通常是在培养液中加人一定量的

磷酸缓冲液（PBS），保持培养液

的pH值相对稳定。

·或用羟乙基呱嗪乙烷磺酸（HEPES）

氢离子缓冲液。

3、溶氧水平

·细胞生长离不开氧气的供应，培

养初期细胞数量少，可以控制较

低水平的溶氧量。

·随着细胞数量的增多，营养物质

的消耗，加大溶氧量。

·对大多数动物细胞来说，培养过

程中对氧的消耗速率范围是：

·4.5×10ˉ12～4.8×10ˉ12g／

（cell●h）。

4、培养液渗透压

·

培养液的渗透压是指用以阻止细胞

水分子通过半透膜进人培养液的压力，

其大小与其浓度成正比。

·原代培养的细胞一般对渗透压的波动

较敏感，而细胞株和细胞系则耐受性

较大。

·培养液需要一定的渗透压。