黑木耳栽培的生物学基础第四讲.docx

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黑木耳栽培的生物学基础第四讲

（第四讲）

四、设备条件

　　1、场址选择

菌种厂要建在黑木耳生产集中、交通运输、水电供应方便、空气新鲜（厂房周围无污染源）、场地较宽阔便于摊晒和存放原材料的地方。

2、菌种厂的布局及所需设备

（l）配料室　　是刷洗菌瓶、器具、配料和拌料的工作室。

设备要有上下水道、清洗箱（或池子）、配料操作台（或平整的水泥地面）、平板锹、喷壶。

也可根据生产的需选购相应规格的原料搅拌机。

因为机械拌料更加均匀。

配料室的面积可视菌种日产量来确定。

（2）装料室　　是将拌好的菌种培养料分装在菌瓶或菌袋中的操作室。

室内要求有水泥地面。

装料室的面积可根据生产量和机械化程度来定。

主要机械是装瓶、装袋机。

内设有装料槽、薄铁漏斗、装瓶器、压实器、扎孔器等。

（3）灭菌室　　是用来给培养料灭菌的地方。

设备有常压灭菌锅和高压灭菌锅。

（4）冷却室　　是灭菌后的培养料瓶或袋降温的冷却间。

冷却室上方设有排气孔。

（5）准备室　　是工作人员更换作业服、检查母种或原种、进行消毒等一般作业房间。

准备室备有药品柜、器械柜、盆、天平、酒精灯和所需的各种药品等。

（6）接种室　　由隔离缓冲间和接种操作间组成。

　　隔离缓冲间是接种室的外间。

一般长2一3米，宽2米,高1.8~2.2米。

内装有波长253.7毫微米、功率30瓦的紫外线灯和日光灯各l支，以及工作服、工作帽、口罩、拖鞋、消毒药品、废物桶等，供灭菌操作入员更衣、换鞋及洗手等物品。

　　灭菌操作间是接种室的内间，一般长2~3米，宽2米，高1.8~2.2米。

工作间太小，工作不方便，工作间太大，不易保持无菌状态。

要求室内密闭、透光，安装上述的紫外线灯和日光灯，必要时要在隔离墙上设一个双层的小型玻璃窗，便于内外传递物品，以减少进出灭菌操作间的次数。

接菌操作间是接种母种、扩繁原种和栽培种的场所。

（7）接种箱　　似小型无菌操作室，木质结构，镶嵌玻璃，关闭严密，便于熏蒸消毒和进行无菌操作。

接种箱的容积以每次接种80~100瓶培养料为宜。

箱的内外均要用油漆涂刷，箱内上方装有紫外线灯和日光灯各l支。

箱前两上圆筒口装有40厘米长的布套（如套袖），双手伸入箱内操作时，布套的松紧带能紧套在手腕处，可以防止外界空气进入。

接种箱有许多优点，体积小，封闭性好，消毒较容易，相对无菌状态保持时间长，双手在箱内操作，人体不受消毒药物的影响。

缺点是箱的容积小，内含氧气少，操作速度慢。

（8）菌种培养室　　是用来放置接种后的各级菌种，并提供适宜的温度和通气条件，使菌丝能有一个较好的生长发育条件的场所。

　　室内装有放置菌种的培养架，其面积在15一5平方米，以便控制室内温度和光线。

用锅炉取暖升温的，每个培养室在取暖管道上要安装控制阀门，这样容易控制各间的温度，培养室升温取暖也可设火墙，但最好是火炕。

用火炕升温，可做到培养架上下温度差异小。

培养室的间数可依据菌种的生产量来确定。

室内一定要清洁、干燥、通风、遮光。

（9）贮藏室　　是贮存已培养好的菌种的库房。

库房面积视存放量而定。

室内温度要求控制在0~7℃，并要求有遮光设施，室内干燥而无其他刺激性气味。

　　3、主要器具

（l）配制培养基的器具　　天平（灵敏度l/1O克）、小秤、台秤、试管、菌种瓶（5⑺一750毫升）或塑料袋、量杯与量筒、漏斗、玻璃棒、电炉、铝锅、漏斗架、试管架和筐、吸管、平板铁锹、喷壶、棉花和广范试纸等。

（2）灭菌设备　　高压蒸汽灭菌锅，有手提式、卧式、直立式等种类。

高压蒸汽灭菌锅用于对培养基高压蒸汽灭菌。

常压灭菌锅。

（3）接种器具　　试管夹架、酒精灯（250毫升）、接种钩、接种铲、接种环、解剖刀、培养皿、镊子（长20厘米）、搪瓷盆、原种瓶架、消毒棉花、玻璃铅笔、酒精棉球、消毒瓶、小喷雾器等。

（4）培养设备　　电热恒温培养箱，用于母种和少量原种的培养。

（5）菌种贮藏设备　　电冰箱（冷藏箱），要求箱内温度在l℃~5℃，用于贮藏原种。

（6）观测器具　　生物显微镜、玻璃棒、温度计、干湿温度计。

　4、主要消毒药品

　　甲醛溶液（福尔马林）、石炭酸（苯酚）、乙醇（酒精）、煤酚皂液（来苏儿）、洁尔灭、高锰酸钾、甲基托布津、菇保l号、克霉净、克霉灵、漂白粉、生石灰、硫磺、强氯消毒片、过氧乙酸等。

5、消毒与灭菌

　　消毒,是用物理、化学、生物学等方法,杀死抑制除细菌芽孢、霉菌厚垣抱子以外的微生物体的措施，防止这些微生物在我们所控制范围内的传播和繁殖。

灭菌，是指用物理或化学方法，灭除一切微生物的措施。

黑木耳纯培养，必须在培养和操作过程中做好消毒灭菌工作，否则容易导致菌种大量被污染，给生产带来损失。

常用的消毒灭菌方法有如下几种:

物理方法

（1）高温灭菌　　高温灭菌的原理是根据高温能使组成生物有机体的蛋白质、核酸等物质的结构与功能遭到不可逆转的破坏，从而使细胞的功能急剧下降以致死亡。

与高等生物相比,微生物对温度有较宽的适应范围，在-10℃~95℃范围内均发现有微生物的踪迹，但每种微生物只能在一定的温度范围内生活，超出这个范围就会死亡。

多数细菌、酵母菌、真菌的营养细胞和病毒在50℃~60℃下10分钟内可致死。

放线菌和霉菌的孢子较营养细胞抗热性强,在76℃~80℃下10分钟内致死。

细菌芽孢和霉菌的厚垣孢子抗热性最强，在高于100℃的条件下，处理相当时间才能致死。

依据这些特征，可采用高温引起其细胞蛋白质凝固，使微生物致死的方法,达到消毒灭茵的目的。

高温灭菌分为干热灭菌和湿热灭菌。

　　干热灭菌又分为火焰灭菌和干燥箱灭菌两种方法。

①火焰灭菌法　　此法迅速简便，彻底可靠。

但应用范围有限，常用于接种工具、试管口、瓶口，以及处理被污染的废物。

在接种操作时，经常用酒精灯封闭管口。

洒精灯的火焰分为三层，最外层火焰温度最高，中层次之，中心最低。

所以，用酒精灯灭菌时，一定要把接种工具放到外层火焰上加热灭菌,同时不要使试管目或瓶口离开火焰过高过远。

②干燥箱灭菌法　　此法只适用于玻璃器皿、金属用具等耐干热物品，如培养皿、三角瓶、刀剪等。

灭菌时，先将被灭菌的物品用牛皮纸包好，放在干燥箱中密闭，打开电源加温。

当温度达到140~160时，开始计时保持恒温l~2小时切断电源。

待温度下降到45℃以下时，开门取出。

注意不要使温度超过180℃,温度过高会使箱中的纸、棉花等物品炭化变焦。

另外,在灭菌过程中禁止打开干燥箱,以防引起玻璃器皿爆裂和纸、棉燃烧。

（2）湿热灭菌　　由于细胞原生质在含水量较高的情况下更易变性凝固；另外，蒸汽有很强的穿透力，当蒸汽与被灭菌物体接触凝结成水时，又可以放出热量使温度迅速升高。

所以，在同样温度下，湿热灭菌比干热灭菌效果要好一些。

培养基的灭菌处理一般都采用湿热灭菌。

人工配制的培养料中，常混有其他微生物，必须经过严格灭茵。

在常压下，水的沸点是100℃，只有在加压的条件下，才能得到高于l00℃的温度。

高压蒸汽穿透力强，迅速引起蛋白质凝固，所以湿热灭菌又可分为高压灭菌和常压灭菌。

常压灭菌要l00℃连续8~12小时，也可以采取间歇灭菌法,即100℃蒸2小时，12小时后，再蒸l小时，共进行2~3次。

专业菌种厂一般都采用高压灭菌柜。

有些菌种厂采用常压灭菌，效果不好，原因有二：

一是常压灭菌时间较长，木屑中的一些结合状态的鞣酸变为游离状态，使培养基的酸性增加，影响木耳菌丝的生长；二是常压灭菌不能使木屑颗粒内部组织软化，致使菌丝生长在木屑颗粒的表面，结块不牢固。

　　原种的瓶袋培养料用高压灭菌柜灭菌时，在0.147帕斯卡的压力,温度125℃一般持续90分钟即可。

栽培种培养料灭菌压力0.147帕斯卡，温度125℃保持120分钟。

高压灭菌时间不可过长，以免破坏培养基的营养成分。

高压灭菌应注意：

第一，装锅不要太挤，以免影响蒸汽的流通和灭菌效果；

　　第二，灭菌器使用前，要排放冷空气，冷空气排出程度与温度的关系很大。

排放方法有两种。

一种是送气前，先打开排气阀门，待排气门排出大量高热蒸汽时，再关闭排气阀门；

另一种是当灭菌器内压力升高到0.05帕斯卡时,打开排气阀门把压力降到0，重新增温升压。

　　第三，额定压力，要从气压达到要求时开始计算时间，要始终保持恒定压力。

如因故中途降温，要重新加压，重新计算灭菌时间，否则影响灭菌效果。

　　第四，使用高压灭菌柜时,送气和排气都要徐徐进行,

避免因气压骤增、骤减,使培养瓶炸裂或冲掉棉塞。

　　第五，灭菌时,要注意防止棉塞潮湿。

防止的办法是在棉塞上扣上塑料制成的防潮湿盖（见图2）。

瓶上覆盏一层牛皮纸。

如棉塞潮湿，应在灭菌后利用余热使其干燥。

　　检查灭菌效果：

为了掌握培养基的灭菌效果，每批培养基灭菌后，抽样3~5瓶做灭菌效果检查。

检查方法:

将抽样移到恒温箱或培养室内，在28℃条件下进行培养，经5~10天不生杂菌，证明灭菌彻底。

　　常压灭菌：

各地小菌种厂都采用常压灭菌。

灭菌时应在锅内温度达到100℃时，开始计算时间，一般8~12小时。

注意观察锅内的水，及时补充，加水时一定加热水。

　　（3）紫外线辐射灭菌　　紫外线辐射对微生物有明显的致死作用，杀菌力很强。

紫外线的杀菌作用主要是它能够损伤细胞内的去氧核糖核酸（DNA），同时，紫外线使空气中产生大量的臭氧（O3），臭氧也有灭菌作用。

紫外线的穿越能力很差，不易透过物体，一层玻璃就可以滤掉大部分紫外线。

所以，紫外线只适于空气及物体表面的消毒。

在木耳菌种的生产中，紫外线适用于接种室或接种箱的消毒。

紫外线的作用与紫外线灯的功率和被照射物的距离有关。

一般灯与被照射物的距离在2米以内为宜。

10米3以内的空间用l支30瓦的紫外线灯照射30分钟可以达到消毒目的。

使用紫外灯时，要注意不能用眼睛直接看灯源，以免损伤晶，也不能在开着紫外灯的情况下工作。

化学方法

　　在一定的浓度范围内,一些化学药剂可以杀死微生物，或者抑制微生物的生长发育,称为消毒灭菌剂。

在不同的情况下，黑木耳菌种生产或防治病害时，常用的消毒灭菌药剂有如下几种：

（l）甲醛　　甲醛能使蛋白质变性，是一种较好的杀菌剂，常用于接种室、接种箱和培养室的消毒。

使用剂量为36%的水溶液（即福尔马林），每立方米5~10毫升，必要时可适当加大用量。

使用时，可根据用量把甲醛液倒入容器内加热，使其挥发，也可以每立方米空间加入5克高锰酸钾，两者通过化学反应产生的热量使其挥发。

甲醛具有很强的刺激性，对人的皮肤和粘膜组织有很大的损害作用，使用时操作人员应当尽快离开现场。

培养室、接种室或接种箱，要在使用前进行消毒，不连续使用的接种室，应提前24小时进行消毒，密闭熏,24小时。

为了减少对人体的刺激，可在工作前2小时将与甲醛等量的氨水倒入容器，送入熏蒸室内进行中和。

连续使用的接种室（箱），可在每次使用前4小时进行熏蒸。

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（2）石炭酸（苯酚）　　石炭酸的渗透力很强，能损伤微生物的细胞膜，使蛋白质变性沉淀而失去生理机能。

3%~5%的石炭酸液在几分钟内就可以使细菌致死（细菌的芽孢在5%的石炭酸内能活几小时）。

所以，常用石炭酸进行器皿消毒和空气喷雾消毒。

0.5%一l%的浓度可用作皮肤消毒，但对皮肤有腐蚀作用，使用时应注意。

（3）煤酚皂液（来苏儿）　　由于煤酚在水中溶解度低，已用肥皂制成悬浊液，增加了悬浮性和吸附能力，杀菌作用提高。

50%的煤酚皂液消毒能力比石炭酸强四倍。

3%~4%可用于各种室内喷洒和器皿消毒，l%一2%可用于皮肤消毒，但要注意浓度高时会使皮肤变硬、脱皮。

（4）乙醇（酒精）　　乙醇能损害细胞质膜，使蛋白质脱水变性，起到杀菌作用。

70%一75%的酒精杀菌能力最强。

浓度过高会使细胞表面的蛋白质很快脱水凝固，形成一个变性的蛋白质外，,阻止进一步渗透，杀菌作用反而减弱。

浓度低，杀菌作用也减弱。

一般商品酒精为95%。

配制时量取75份酒精，加入20份蒸馏水即可。

乙醇常用于皮肤、器械或子实体表面消毒。

由于酒精易挥发，要密封保存、现用现配。

（5）新洁尔灭　　新洁尔灭是一种有消毒作用的表面活性剂。

对人畜毒性小，可稀释20倍用于皮肤及不耐热的器皿及桌凳表面消毒和用于空气喷雾消毒。

（6）高锰酸钾　　高锰酸钾是一种强氧化剂,0.1%的浓度就可以使蛋白质和氨基酸氧化。

常用于皮肤、器皿消毒，用于栽培袋表面消毒能抑制或杀死杂菌。

应随用随配,不宜久放。

（7）克霉灵　　克霉灵是食用菌栽培过程中易发生的霉菌及各种病害研制出的一种复合型消毒杀菌剂，可以用于栽培的全过程，对木霉、青霉、链孢霉有极强的消杀功能。

器械消毒每50克加水I5~20千克，拌料每50克加水33一50千克。

（8）漂白粉　　漂白粉是次氮酸钙、氧化钙和氢氧化钙的混合物，在水中水解成亚氯酸，渗入菌体中使蛋白质变性导致死亡。

应用时配制成3%一5%的溶液，洗刷接种室墙壁和培养架及其他用具。

要随配随用，不能久放。

（9）生石灰　　生石灰可通过提高环境的pH值来抑制大多数酵母及酶菌的生长繁殖，而达到消毒的目的。

可以配制成3%~5%的水溶液，喷洒培养室。

培养室湿度过大时，可以在架下面撒一些生石灰，降低湿度，减少杂菌的繁殖。

（10）硫磺　　硫磺燃烧时产生的二氧化硫，是强还原剂。

它可以夺走微生物体中的氧而使之死亡。

常用来熏蒸接种室、培养室和仓库。

每立方米用量15克。

熏蒸前在室内喷洒水雾，可增加杀菌效果。

（11）过氧乙酸　　过氧乙酸是酸性消毒剂。

常用于接种室空气消毒，每立方米用5毫升熏蒸消毒。

过氧乙酸的杀菌效果是甲醛的10倍。

（12）菇保l号　　菇保l号是高效、快捷、经济的熏蒸灭菌剂，使用火柴或烟头直按点燃可喷出大量的烟雾。

对菇类病菌，特别晕为害极大的链抱霉、绿霉、黄黑曲霉等，杀灭率100%，点燃后关闭门窗30分钟即可。

可用于接种室培养室接种箱消毒。

　　在大规模菌种生产过程中，除了做好培养室的消毒卫生、工具的随时消毒和操作人员接种前的消毒之外，最重要的是对接种室的消毒。

为了检查接种室（无菌室）的消毒效果，拧开一个无菌的有琼脂培养基的培养皿，在接种室内放置15分钟，然后盖好棉塞放入28℃的恒温箱培养一二天，如果培养皿内的菌落不超过4个，则认为是灭菌彻底。

杀菌剂要交替使用，禁忌长期使用一种药品，以免抗某种药剂的杂菌大量滋生。

6、母种制作

a.培养基的配制

（l）葡萄糖马铃薯琼脂培养基　　

配方　　马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂（洋菜）20g，水l000毫升。

配制过程　　选好的马铃薯洗净去皮，挖去芽眼，切成2mmx2mm的小方块。

用天平称取200g,放在锅中加水l000ml，加热煮沸至马铃薯熟而不烂的程度，,煮沸I5~20分钟，然后用6~8层纱布过滤,取其滤液。

加足水至l000ml，在滤液中加入琼脂，小火加热，用玻璃棒不断搅拌，待琼脂全部溶化开后，再用4一6层纱布过滤，滤液用热水补足至1000ml，而后加入葡萄糖或其他配料搅拌溶化。

测其pH值，将pH值调整为5.0一5.5，然后趁热分装入试管中。

（2）马铃薯、葡萄糖琼脂综合培养基　　

配方　马铃薯200g,，葡萄糖20g，磷酸二氢钾（KH2PO4）2g，硫酸镁（MgSO4）0.5g,蛋白胨0.5g,胡萝卜5g,琼脂20g,水l000ml。

pH值5.0一5.5。

配制过程　制作方法同上。

（3）木汁米糠琼脂培养基　　

配方　　木屑200g，细米糠（最好麸皮）l00g，琼脂20g，葡萄糖20g，硫酸铵[（NH）4OS4]]克，水l000ml，pH值5.0一5.5。

配制过程　　取新鲜木屑200ｇ和新鲜米糠l00ｇ,加水1000ｍl，加热煮沸10分钟，边煮边搅拌。

过滤去渣，于滤液中加水至l000ml加入琼脂和其它组成成份。

此培养基适用于分离菌种和生产。

（4）蛋白胨、葡萄糖琼脂培养基

配方　蛋白胨2g，葡萄糖20g，琼脂18，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，维生素B10.3毫克,水l000ml，pH值5.0一5.5。

配制过程　　同上

（5）玉米粉培养基　　玉米粉l00ｇ，琼脂20ｇ，蔗糖10ｇ,磷酸二氢钾0.2ｇ，水l000ml，pH值5.0一5.5。

配制过程　　先将玉米粉加冷水凋成稀糊，煮沸30分钟，用纱布过滤。

其他制作过程与以上方法相同。

b.培养基分装试管

　　用漏斗或有嘴量杯将制作好的培养基趁热分装于试管中，装至试管的1/5。

装管时勿使管口沾着培养基，若沾上则需用纱布擦去，以防杂菌从管口侵入。

分装结束后，塞上棉花塞。

棉花塞要求松紧适中，达到既通气，又能防止杂菌侵入的目的。

棉塞塞入管口内的长度约为棉塞总长度的2/3。

燃后，把每7一10支试管扎成一捆，试管棉塞部分用牛皮纸或聚丙烯塑料薄膜包好,竖直放入试管筐中待灭菌。

　　c.母种培养基的灭菌

　　培养基分装后，要及时竖直放到高压灭菌锅中，在0.098~0.11帕斯卡压力下保持30分钟。

灭菌结束后，可利用高压锅夹层温度烘干试管棉塞。

待培养基温度下降至60℃时，再竖直取出试管。

　　d.母种培养基斜面的制作

　将灭菌后的试管培养基摆成斜面时,先在桌面上放一根小方木条，将试管逐支或逐捆斜放在小方木条上，使试管内培养基形成斜面，斜面的长度为试管的1/2一2/3，冷却凝固后即成斜面培养基。

　　制成的斜面培养基要迸行灭菌效果测定，测定时可以从每批次灭菌试管中取出若干支，置于28℃~30℃的恒温培养箱中培养3天，若无杂菌出现，表明灭菌彻底，可供接种用。

一旦发现某批次出现杂菌，表明该批次灭菌效果差，应重新进行灭菌，以免造成不必要的损失。

e.接种

　　母种扩繁接种是一个转管过程，就是将保存管母种扩大成生产管母种（见图3）。

（I）消毒　　将各种接种用具等放入无菌操作间接种箱内。

按10ml/m3的用量，将福尔马林（含甲醛37%）置入瓷碗或罐头瓶内，按用量的5g/m3加入高锰酸钾混合熏蒸。

在接种的前一天晚上进行或接种前12小时前进行。

每次接种前40分钟将母种管和待接种的试管斜面放入无菌操作间或接种箱内，用5%石炭酸液喷雾后，打开紫外线灯30分钟。

（2）接种人员的准备　　消毒过后，接种入员进人隔离缓冲间，穿好接种工作服，戴好帽子和口罩，换上拖鞋，用2%来苏儿或0.25%新洁尔灭溶液将手浸泡2分钟。

（3）接菌操作　　将酒精灯点燃后，拔出原种保存管的棉塞，将管口对着火焰，用经火焰消毒后的接种工具将管内老菌种及斜面口端薄薄的部分培养基挖出。

用接种铲、接种针或接种钩在保存管母种斜面上挑取少量的菌丝，把保存管夹在试管架夹中，再将待接种的斜面试管棉塞拔开，管口对着火焰，用接种针挑出一小块保存管母种，通过酒精灯火焰迅速地转接在培养基斜面中部，用原棉塞将管口封住。

一般一支试管母种可扩繁新母种60支以上。

f.培养

　　将接种后的母种试管移入电热恒温培养箱中，把电热恒温培养箱的温度调到26~28℃，培养10天后菌丝长满试管，便可用来接种原种或作原种保存。

g.保藏

　　将生长丰满的斜面菌种放入冰箱内，在4℃左右低温保藏。

以后每隔3个月左右移接入新鲜的斜面培养基上，以补充养料、水分，培养后再进行保藏。

培养基中添加磷酸二氢钾等弱酸强碱盐类，能对菌丝生长过程中培养基pH值变动起缓冲作用。

为了延长保藏时间，可将试管口处用塑料薄膜包扎或用蜡封口，以防培养基干涸。

7、原种制作

　　制作原种，是将母种在固体培养基上扩大培养，这样既能取得大量的菌丝体，又能增强初生菌丝的生活力。

此培养基可用来扩大为栽培种，也可作为木屑试管保藏菌种用。

可保存一年不需转管。

a.原种培养基的配制

（1）颗粒培养基　　

配方　麦粒（小麦或燕麦）、玉米、玉米楂99%，碳酸钙l%，料水比为l：

1.5~2.0。

制作方法　把麦粒过筛，除去杂物及缺损麦粒、病粒及虫蛀麦粒，放入清水中浸泡，使其吸足水分后放进沸水中煮沸15~20分钟，捞出与碳酸钙拌均，立刻装瓶。

一般麦粒、玉米粒装半瓶即可，以利于灭菌后摇瓶（见图4玉米颗粒原种）。

（2）木屑培养基　　阔叶树锯木屑78%，麸皮或米糠19%，豆粉1%，石膏粉，1%，糖l%。

制作方法　按上述比例称取各种培养料，先把木屑、麸皮、石膏粉拌匀，然后用喷壶加入

已溶化的糖和水，使其混合并搅拌均匀，使培养料含水率达60%。

由于木屑原料含水量不一，水不宜一次性加入，拌至手用力握捏培养基没有明显水滴自手指缝中溢出，松开手后培养基仍能成团，用三个指头用力捏时，有水印挤出为宜。

培养基的pH值为6.5~7.5。

b.装瓶

　　洗净玻璃瓶，沥尽瓶内积水。

使用小口瓶的，应用漏斗将培养料装入瓶中，边装边用力振动，使瓶中的料上下松紧一致。

当料装至瓶肩处,将瓶擦净。

并在料中间扎一直径1.0~1.5厘米的圆孔。

瓶口用棉塞封口，大口瓶用聚丙烯薄膜和皮套封口，图5装瓶后的木屑原种。

c.灭菌　　　　　　　　　　　　　　　　`

　　培养基灭菌时间的长短要根据瓶内装料多少松紧度，在北方还要视瓶内培养料冰冻程度而定。

一般高压蒸汽湿热灭菌，木屑培养基可在压力0.15帕斯卡，或温度126℃下持续1.5小时；而麦粒培养基要持续2小时才能达到彻底灭菌效果。

常压灭菌的木屑培养基在100℃下持续灭菌8~10小时，麦粒培养基持续12小时为宜。

检查灭菌效果，可将经过灭菌的培养基随机抽出几瓶，在30℃左右温度下进行空白培养15天，无杂菌出现，说明灭菌彻底。

d.冷却

　把灭菌的培养基送到冷却间，待瓶内培养基温度降至30℃以下时，可送入接种室，准备接种。

e.接种

　　母种接种原种的消毒准备过程与原种扩繁相同。

其接种操作过程是：

将酒精灯点燃后,拔去母种棉塞，将管口对着火焰，把接种工具进行火焰消毒后，再将管内老接种块及斜面口端薄薄的部分培养基去除。

用接种工具将母种斜面分割成8块左右，把母种试管夹在试管架夹中。

再将待接种的原种瓶棉塞拔开，瓶口对着火焰。

用接种铲从原种试管中取出一块原种。

通过火焰迅速地接种到原种瓶内的培养基上，再用原棉塞通过火焰封住瓶口（见图6原种接种过程）。

f.培养

　　将接种后的原种瓶移进经过消毒的培养室上架。

前10天要将培养室的温度控制在26℃~28℃。

待菌丝长满料面时，开始倒架，剔除被杂菌污染的菌瓶。

再将温度控制在24℃~26℃。

因为当菌丝生长达到旺盛生长时，瓶内料中的温度比培养室内温度要高2℃~3℃。

当菌丝长满瓶后，再在比培养加上低10℃左右的条件下，缓冲培养10一Ⅰ5天即可使用。

栽培种制作

a.栽培种培养基的配制

配方　1锯沫麦麸

锯沫　82.5%（或一麻袋锯沫）；麦麸　15%　；石膏　0.5%；白灰　0.5%；豆粉　1.5%；水分　60%

2锯沫麦麸米糠

锯沫　80.5%；麦麸　8%；米糠　7%；玉米面　2%；豆粉　1.5%；石膏　0.5%；白灰　0.5%　水分　60%

3锯沫玉米粗粉

锯沫　80.5%（或一麻袋锯沫）；玉米粗粉（玉米和棒一同粉碎）15%；豆粉1.5%；石膏　　　　　　　　　　　　　　0.5%；白灰　0.5%；水分　60%。

　装瓶、灭菌、冷却栽培种的制作同原种的制作。

b.接种

消毒准备过程同母种和原种的制作。

其接种操作过程是：

点燃酒精灯，拔出原种瓶棉塞，放在原种接种架上，使瓶口对着火焰。

若用小口瓶原种接种栽培种，首先选在粗细适合的部位（一般直径在3cm左右），用酒精灯转圈烧过以后，再用浸过冷水的棉团擦，使瓶腰断开,出现直径3cm左右的开口。

将瓶放在原种架上，开口用酒精灯火焰封住，用75%酒精棉球擦试母种瓶口和内壁，把原种表面褐色的厚膜及老接种块挖弃。

再把待接种的栽培种瓶棉塞拔开，瓶口对着酒精灯火焰。

用接种铲取出原种，通过火焰迅速接入栽培种培养基上。

一般每瓶原种（500ml）可接种25~30瓶栽培种。

接种后放迸培养室培养，方法同原种培养。

接种方法很多，基本上是在酒精灯接菌的基础上演化而来，如干热接菌、无菌风接菌等。

c.菌种质量及保藏

在生产实践中,有时在相同的生态条件下，用同样的方法进行管理，不同的菌种成活率和产耳量差异很大。

这种现象除了母种的种性差异以外，菌种质量的好坏也有很大的影响。

一个种性好的菌种，如果在培养过程中条件不适宜，或一些条件没有得到满足