学年高中生物专题5DNA和蛋白质技术课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段练习新人教版.docx

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学年高中生物专题5DNA和蛋白质技术课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段练习新人教版

1．DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。

2．DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。

3．PCR反应需要DNA模板、引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶等条件。

4．PCR原理：

DNA热变性的原理。

5．PCR每次循环都包括变性、复性和延伸三步。

6．PCR扩增DNA片段可以使目的片段呈指数增长。

课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段

PCR扩增的原理和过程

[自读教材·夯基础]

1．细胞内DNA复制的条件

原料

4种脱氧核苷酸

模板

2条DNA母链　

酶

解旋酶和DNA聚合酶

引物

使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸

2．PCR扩增的原理及条件

（1）PCR技术：

即多聚酶链式反应，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。

它能以极少量的DNA为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。

（2）引物：

DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。

（3）扩增方向：

总是从子链的5′端向3′端延伸。

（4）原理：

DNA的热变性原理，即：

双链DNA

单链DNA

（5）条件

3．PCR的反应过程

（1）过程：

（2）结果：

DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。

1．DNA复制时为什么需要引物？

提示：

DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链。

2．PCR扩增DNA过程中是否还需要解旋酶？

提示：

不需要。

3．PCR缓冲液相当于细胞内的什么成分？

提示：

因为缓冲液为DNA的复制提供场所，相当于细胞内DNA复制的场所，所以缓冲液相当于核基质。

4．PCR循环之前，常要进行一次预变性，预变性的目的是什么？

提示：

预变性的目的是增加大模板DNA彻底变性的概率。

5．利用PCR技术扩增1个DNA分子n次，所得DNA分子中，不含引物的脱氧核苷酸链所占的比例是多少？

含引物的DNA分子所占的比例是多少？

提示：

1/2n；100%。

[跟随名师·解疑难]

1．细胞内DNA复制与体外DNA扩增（PCR技术）的比较

项目

细胞内DNA复制

PCR

不同点

解旋

解旋酶，边解旋边复制

80～100℃高温解旋，双链完全分开

酶

DNA解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶

TaqDNA聚合酶

引物

RNA

DNA或RNA

温度

体内温和条件

高温

子链合成

一条链连续（先导链），另一条链不连续，先合成片段，再由DNA连接酶连接（滞后链）

两条子链均连续合成

相同点

①提供DNA模板

②四种脱氧核苷酸作原料

③子链延伸的方向都是从5′端到3′端

2．PCR反应过程

（1）变性：

当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，如图：

（2）复性：

系统温度下降至50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：

（3）延伸：

当系统温度上升至72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸（A、T、G、C）在DNA聚合酶的作用下，据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：

[特别提醒]PCR反应的结果

①PCR一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、复性、延伸三步。

②两引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。

实验操作及DNA含量的测定

[自读教材·夯基础]

1．实验操作程序

2．DNA含量的测定

（1）原理：

利用DNA在260_nm的紫外线波段的吸收峰曲线来测定相应含量。

（2）计算公式：

DNA含量（μg/mL）＝50×（260nm的读数）×稀释倍数。

[跟随名师·解疑难]

1．实验操作注意事项

（1）为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压灭菌。

（2）所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存。

（3）在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。

所有成分都加入后，通过手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀。

2．结果分析与评价

DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定，以判断DNA片段的扩增是否成功。

具体方法如下：

（1）稀释：

取2μLPCR反应液，加入98μL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释。

（2）对照调零：

以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。

（3）测定：

取DNA稀释液100μL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。

（4）计算：

检测DNA片段的扩增情况，可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，计算公式为：

DNA含量（μg/mL）＝50×（260nm的读数）×稀释倍数

如果扩增不成功，则要分析失败原因。

可能的原因有：

漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。

[特别提醒]　公式中的50代表在波长260nm紫外波段照射下，吸收峰为1时，DNA含量为50μg/mL。

PCR技术的原理

[例1]多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。

PCR过程一般经历下述三十多次循环：

95℃下变性（使模板DNA解旋）→55℃下复性（引物与DNA模板链结合）→72℃下延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。

下列有关PCR过程的叙述中错误的是（　　）

A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，生物体内复制时是通过解旋酶实现的

B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的

C．延伸过程中需要DNA聚合酶和四种核糖核苷酸

D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高

[解析]　变性是为了使DNA内部的氢键断裂，双螺旋打开，体内复制时借助解旋酶来实现；借助碱基互补配对原则，引物可与DNA模板链结合；延伸时是形成新的DNA分子，需要以脱氧核苷酸为原料；PCR过程的温度高，会导致一般的DNA聚合酶失活，需特定的耐高温DNA聚合酶。

[答案]　C

归纳拓展

（1）DNA母链的3′端对应着子链的5′端，即DNA的两条链是反向平行的。

（2）解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都是催化形成磷酸二酯键的。

（3）DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3′端上，需要模板；而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。

PCR反应过程及产物

[例2]在遗传病及刑侦破案中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。

据图回答相关问题：

a链5′－G－G……T－C－3′　5′－G－G－OH（引物Ⅰ）

b链3′－C－C……A－G－5′　　　　　　　（引物Ⅱ）

　　　　　　　　95℃↓

5′－G－G……T－C－3′　　3′－C－C……A－G－5′

　　　　　　　　55℃↓

5′－G－G……T－C－3′　　3′－C－C……A－G－5′

　　　　　　　　　　　　5′－G－G－OH

　　　　　　　72℃↓

　________________　________________

（1）在相应的横线上写出引物Ⅱ，并在复性这一步骤中将引物Ⅱ置于合适的位置。

（2）在相应的横线上写出循环一次后生成的DNA分子。

（3）若将作为原料的四种脱氧核苷酸用32P标记，请分析循环一次后生成的DNA分子的特点是______；循环n次后生成的DNA分子中不含放射性的单链占总单链的比例为______。

[解析]　

（1）DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，引物就提供了3′端。

子链延伸方向为5′→3′，引物Ⅰ与b链部分碱基互补，引物Ⅱ则与a链部分碱基互补，且连接到a链的3′端，故引物Ⅱ的结构为5′－G－A－OH，复性结果为：

　HO－A－G－5′

5′－G－G……T－C－3′。

（2）经过一次循环后，产生的两个DNA分子分别含有引物Ⅰ和引物Ⅱ。

（3）由于作为原料的四种脱氧核苷酸被32P标记，所以新合成的子链均含有放射性，一次循环后的两个DNA各有一条链含32P，若复制n次，产生子链共2n×2，其中只有亲本的两条母链不含32P，则其所占比例为2/（2n·2）＝1/2n。

[答案]　

（1）5′－G－A－OH

a链5′－G－G……T－C－3′

　　　　HO－A－G－5′

（2）5′－G－G……T－C－3′　3′－C－C……A－G－5′

　3′－C－C……A－G－5′　5′－G－G……T－C－3′

（3）每个DNA分子各有一条链含32P标记　1/2n

[随堂基础巩固]

1．下列说法错误的是（　　）

A．一条DNA母链只有一个3′端，即羟基末端

B．DNA的两个3′端位于相反的两端

C．TaqDNA聚合酶只能与引物的3′端结合并延伸子链

D．DNA的合成方向是从子链3′端向5′端延伸的

解析：

选D　我们通常将DNA单链的羟基（—OH）末端称为3′端，而磷酸基团的末端称为5′端，一个DNA分子有两个3′端和两个5′端，它们分别位于DNA分子的两端，即每一端都有一个3′端和一个5′端。

TaqDNA聚合酶只能与引物的3′端结合并开始延伸DNA链，即子链总是从5′端向3′端延伸。

2．标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是（　　）

A．92℃、50℃、72℃　　B．72℃、50℃、92℃

C．50℃、92℃、72℃D．80℃、50℃、72℃

解析：

选A　当温度上升到90℃（90～96℃）以上时，双链DNA解聚为单链，称之为变性；当温度下降到50℃（40～60℃）左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，称为复性；当温度上升到72℃左右（70～75℃）时，溶液中的四种脱氧核苷酸（A、T、C、G）在TaqDNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，称为延伸。

3．使用PCR仪的具体实验操作顺序应为（　　）

①设计好PCR仪的循环程序

②按配方准备好各组分

③用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分

④进行PCR反应

⑤离心使反应液集中在离心管底部

A．②③⑤④①D．①⑤③②④

C．②③⑤①④D．④②⑤③①

解析：

选C　PCR反应的操作步骤一般分为准备（包括配制配方及将各配方放于实验台上）―→移液―→混合―→离心―→反应。

因PCR仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。

4．下列对操作过程的叙述，错误的是（　　）

A．PCR反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌

B．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存

C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化

D．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的吸液枪头都必须更换

解析：

选C　为了防止外源DNA等因素的污染，PCR反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌；所用的缓冲液及酶应分装成小份保存，并使用一次性吸液枪头，即A、B、D均正确。

在冰箱中放置的缓冲液和酶取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化，故C错误。

5．PCR（多聚酶链式反应）技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，下图表示合成过程，请据图分析回答问题：

（1）A过程高温使DNA变性解聚，对该过程原理的叙述，正确的是________。

A．该过程用到耐高温的解旋酶破坏氢键

B．该过程用到限制酶破坏磷酸二酯键

C．该过程不需要解旋酶的作用

D．该过程与人体细胞的过程完全相同

（2）C过程要用到的酶是________________。

这种酶在高温下仍保持活性，因此在PCR扩增时可以________加入，________（填“需要”或“不需要”）再添加。

PCR反应除提供酶外，还需要满足的基本条件有：

______________________________________________

________________________________________________________________________。

（3）如果把模板DNA的两条链用15N标记，游离的脱氧核苷酸不做标记，控制“94℃―→55℃―→72℃”温度循环3次，则在形成的子代DNA中含有15N标记的DNA占_____。

解析：

PCR技术用高温使DNA两条链解开，该过程不需要解旋酶的作用。

C过程是链的延伸，需要DNA聚合酶参与；PCR反应除提供酶外，还需要满足的基本条件有：

DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行等。

循环3次共形成8个DNA分子，其中两个DNA分子含15N标记，占总数的25%。

答案：

（1）C　

（2）DNA聚合酶　一次　不需要　DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、同时要控制好温度　（3）25%

[课时跟踪检测]

（满分50分　时间25分钟）

一、选择题（每小题3分，共24分）

1．下列有关PCR技术的叙述，不正确的是（　　）

A．PCR技术利用的是碱基互补配对原则

B．PCR技术可用于基因诊断，判断亲缘关系等

C．PCR技术需在体内进行

D．PCR技术可分为变性、复性、延伸三个阶段

解析：

选C　PCR技术是聚合酶链式反应的简称，是在体外快速大量复制DNA片段的一种新技术。

2．PCR一般要经过三十多次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时将（　　）

A．仍与引物Ⅰ结合进行DNA子链的延伸

B．与引物Ⅱ结合进行DNA子链的延伸

C．同时与引物Ⅰ和引物Ⅱ结合进行子链延伸

D．无需与引物结合，在酶的作用下从头合成子链

解析：

选B　当由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时，此单链引物端为5′端，因此与它互补的子链应从另一端开始合成，即与引物Ⅱ结合延伸DNA的子链。

3．在PCR扩增实验中，引物是很重要的。

下列属于引物特点的是（　　）

①引物长度一般是80～100个碱基对（bp）为宜

②DNA聚合酶能从引物的5′端开始延伸DNA链

③引物是一小段DNA或RNA

④引物能与DNA母链的一段碱基序列互补配对

A．①②　　　　　　　　B．③④

C．①③D．②④

解析：

选B　引物长度一般以20～30个碱基对（bp）为宜，包括引物Ⅰ和引物Ⅱ两种。

引物太短或太长，都可能降低产物的特异性。

引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对；DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，当引物与DNA母链结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链。

4．在PCR扩增DNA的实验中，根据设计，一分子DNA经30次循环后，应得到约230个DNA分子，但结果只有约210个DNA分子。

出现该现象的原因可能是（　　）

①循环次数不够

②TaqDNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制

③引物不能与母链结合

④系统设计欠妥

A．①②③D．①②④

C．①③④D．②③④

解析：

选B　解答本题应从PCR扩增过程的条件进行分析：

①循环次数过少，产物的量比预期的少；

②TaqDNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制，导致催化效率降低，得到的产物比预期的少；

③如果引物设计不合理，则无法进行扩增；

④PCR系统设置不妥，达不到预期的效果。

5．下列有关PCR技术的叙述，不正确的是（　　）

A．聚合酶链式反应，是用DNA聚合酶在体外扩增DNA片段的技术

B．在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似

C．PCR反应需在一定的缓冲溶液中进行，只需提供DNA模板以及四种脱氧核苷酸即可

D．PCR一般经历三十多次循环，每次循环均分为变性、复性和延伸三个阶段

解析：

选C　PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行，需提供DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。

6．右面为DNA变性和复性示意图，下列相关说法不正确的是（　　）

A．向右的过程为加热（80～100℃）变性的过程

B．向左的过程是DNA双链缓慢降温复性

C．变性与在生物体内解旋过程的条件、实质都相同

D．图中DNA片段共有2个游离的磷酸基、2个3′端

解析：

选C　DNA体外的变性同体内的解旋实质是相同的，都是使氢键断裂，DNA双螺旋打开，只是体内需解旋酶，体外是高温条件。

7．复性温度是影响PCR特异性的较重要因素。

变性后温度冷却至40～60℃，可使引物和模板发生结合。

PCR的结果可不考虑原来解旋开的两个DNA模板链的重新结合，原因不包括（　　）

A．由于模板DNA比引物复杂得多

B．引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞

C．加入引物的量足够多而模板链数量少

D．模板链加热解旋已经变性不可能再次结合

解析：

选D　复性的原理是碱基互补配对，解旋后DNA分子变成单链，碱基序列未发生改变，冷却后仍可以进行复性。

8.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。

经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如图2所示，其中第⑤种DNA分子有几个（　　）

图1

图2

A．2D．4

C．6D．8

解析：

选D　PCR技术扩增时，由两种引物决定所扩增的片段的特定序列，上一次循环的产物为下一次循环的模板。

第一次循环形成①和②，第二次循环形成①②③④四个DNA，以此类推4次循环后共形成16个DNA，其中①②各一个，③④各三个，⑤共8个。

二、非选择题（共26分）

9．（13分）资料显示，近十年来，PCR（聚合酶链式反应）技术成为分子生物实验的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制的特性，在试管中进行DNA的人工复制（如下图），在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使分子生物实验所需的遗传物质不再受限于活的生物体。

请据图回答下列有关问题：

（1）加热至95℃的目的是使DNA样品的________键断裂，此过程在生物体细胞内是通过________酶的作用来完成的。

（2）新合成的DNA分子与模板DNA分子完全相同的原因是____________________和________________________________________________________________________。

（3）通过PCR技术使DNA分子大量复制时，若将一个用15N标记的模板DNA分子（第一代）放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制到第五代时，含15N标记的DNA分子单链数占全部DNA总单链数的比例为________。

（4）PCR技术不仅为遗传病的诊断带来了便利，而且改进了检测细菌和病毒的方法。

若要检测一个人是否感染了艾滋病病毒，你认为可用PCR技术扩增他血液中的（　　）

A．白细胞DNAD．病毒的蛋白质

C．血浆中的抗体D．病毒的核酸

解析：

通过PCR技术使DNA分子大量复制时，同样遵循碱基互补配对原则，其复制方式仍然是半保留复制；复制到第5代即复制了4次；检测一个人是否感染了艾滋病病毒，可以通过检测该人的血液中是否含有病毒核酸来判定。

答案：

（1）氢　解旋　

（2）DNA分子独特的双螺旋结构　复制过程中严格遵循碱基互补配对原则

（3）

　（4）D

10．（13分）请回答PCR技术方面的有关问题：

（1）利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。

图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。

①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为________。

②在第________轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。

（2）设计引物是PCR技术关键步骤之一。

某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。

①第1组：

_________________________________________________________；

②第2组：

_________________________________________________________。

（3）PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为___________________________________________________。

解析：

（1）①依据图解特点，第四轮循环产物中可以得到16个DNA分子，其中有15个含引物A的单链，以及一个不含引物A的模板链。

②从图解原DNA与引物A、B的比例关系分析，经三次复制后开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。

（2）比较第一组引物的碱基顺序，可以发现引物Ⅰ与引物Ⅱ有两对碱基能发生互补配对形成局部双链结构而失效；而第二组引物中，引物Ⅰ′折叠后会发生碱基互补配对而导致失效。

（3）在PCR反应体系中，引物首先与模板DNA单链互补配对形成局部双链DNA片段，然后在DNA聚合酶的作用下将单个脱氧核苷酸依次连接到引物链上。

答案：

（1）①

　②三

（2）①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效

②引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效

（3）DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上