脑膜炎奈瑟菌的检测技术和检测进展.docx

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脑膜炎奈瑟菌的检测技术和检测进展

脑膜炎奈瑟菌的检测技术和检测进展

关键词：

流行性脑脊髓膜炎；脑膜炎奈瑟菌；实验室技术

流行性脑脊髓膜炎（简称流脑）是由脑膜炎奈瑟菌（Ｎｍ）通过呼吸道传播引起的化脓性脑膜炎，为急性呼吸道传染病，常在冬春季引起发病与流行。

脑膜炎发病迅速，病死率超过２０％，且后遗症严重［１］。

我国９０％以上的患者是由Ａ群Ｎｍ引起。

Ｎｍ是只存有于人体的需氧双球菌，其外膜含脂多糖成分，致病性Ｎｍ的外膜外有荚膜多糖。

Ｎｍ有多基因差异。

根据Ｎｍ荚膜多糖的不同，分为１２个血清群：

Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、２９Ｅ、Ｗ１３５和不能分群菌株。

Ｎｍ的病原学检测包括细菌培养、革兰染色、生化鉴定、血清学分群，乳胶凝集反应直接检测抗原等。

脑脊液革兰染色仍是快速检测Ｎｍ的重要方法之一，患者淤点（斑）、脑脊液涂片检测时在中性粒细胞内见到革兰阴性肾形双球菌或脑脊液、血液培养Ｎｍ阳性或脑脊液、血液Ｎｍ特异性核酸片段检测阳性都可作为流脑的确诊依据。

病原学检测是检验Ｎｍ的传统方法，但因Ｎｍ对冷、热、干燥和化学消毒剂的高度敏感性和对外环境的弱抵抗力，以及临床标本的采集、运送、培养、接种方式、培养基质量、检测人员的经验等都可能影响检验结果的准确性。

ＰＣＲ分子学诊断的优点是可测出菌群特异性ＮｍＤＮＡ，不要求阳性结果中存有活的病原体，且结果可在２ｈ内获得［２］。

当前，高敏感性、高特异性、操作简便的分子生物学检验技术已广泛应用于Ｎｍ感染的检验诊断。

本文就Ｎｍ的检测技术及检测进展作初步综述。

１Ｎｍ的病原学检测技术

病原学检测是最早应用于细菌检测的方法。

分离出Ｎｍ是诊断流脑的“金标准”，其鉴定方法包括革兰染色、氧化酶试验、生化鉴定、血清学分群等。

基于获得的阳性菌株，可实行进一步的研究，比如体外药物敏感试验就必须首先分离到阳性菌株。

李马超等［３］就曾对其实验室２００５－２００６年分离的４９株Ｎｍ菌株（１６株Ａ群、３３株Ｃ群）实行体外抗菌药物敏感性检测，结果表明，１６株Ａ群Ｎｍ菌株对复方磺胺甲噁唑、四环素、左氧氟沙星、萘啶酸４种抗菌药物耐药，对环丙沙星耐药或中度敏感，３３株Ｃ群Ｎｍ菌株对复方磺胺甲噁唑耐药，３１株（９３．９％）Ｃ群菌株对萘啶酸耐药，２０株（６０．６％）Ｃ群菌株对左氧氟沙星耐药，１７株（５１．５％）Ｃ群菌株对环丙沙星耐药，４株Ａ群和１株Ｃ群Ｎｍ菌对青霉素不敏感。

冯君平等［４］进一步探索了Ａ群、Ｃ群Ｎｍ的最适培养基，结果表明添加酵母浸出粉的培养基可作为Ａ群、Ｃ群Ｎｍ培养的最适培养基。

郑春早等［５］配制了一种小牛血清“双抗”培养基作为Ｎｍ的增菌培养基，与常规检测培养基比较表明，应用小牛血清“双抗”培养基建立的新方法适用于Ａ、Ｂ、Ｃ群Ｎｍ的检测，且检测效果明显优于常规的咽拭子直接接种法。

病原学检测的缺点是比较繁琐、耗时、影响因素多，特异性可能不够好。

２Ｎｍ的普通聚合酶链反应（ＰＣＲ）

ＰＣＲ是一种用于放大扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术，对于不能用血清学分群的Ｎｍ疑似菌株或无法实行Ｎｍ分离培养的脑脊液、血液、血清标本可采用ＰＣＲ实行ＤＮＡ扩增辅助检测鉴定。

近年来ＰＣＲ技术广泛应用于Ｎｍ的检测中［２，６］。

黄亮等［７］采用普通ＰＣＲ技术对流脑疑似病例的脑脊液和血液标本中Ｎｍ种属及各群的特异性ＤＮＡ片段实行了检测，发现６例流脑疑似患者的脑脊液标本中有５份Ｎｍ属特异性基因ＣｒｇＡ阳性，５份检出ＮｍＣ群ＳｉａＤ（Ｃ）基因片段；血液标本中１份检出ＮｍＣｒｇＡ基因，１份检出ＮｍＣ群ＳｉａＤ（Ｃ）基因片段。

张文艳等［８］对Ｎｍ血红素加氧酶的基因Ｈｅｍｏ实行扩增，结果表明，Ｎｍ标准菌株为阳性结果，即扩增出长为４２４ｂｐ的ＤＮＡ片段，而肺炎链球菌、乙型流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌均未扩增出该ＤＮＡ片段，为阴性结果；ＰＣＲ技术能检测出４ｐｇ的脑膜炎双球菌ＤＮＡ，具有高敏感性；１１份脑脊液样品ＮｍＰＣＲ检测常规培养检测结果显示，ＰＣＲ检出率为３６．３％，而培养法的检出率为１８．２％，ＰＣＲ明显高于培养法（Ｐ＜０．０５）。

徐丽等［９］则利用普通ＰＣＲ技术建立了检测２９Ｅ群、Ｘ群和Ｚ群等３个血清群Ｎｍ的方法，然后将该方法应用于４１份疑似Ｎｍ菌株标本的检测，结果表明，４１份疑似Ｎｍ标本中，２９Ｅ群和Ｘ群ＰＣＲ阳性的标本分别有７份和２份，未检测出Ｚ群菌株，建立了能准确、特异地鉴定２９Ｅ群、Ｘ群和Ｚ群Ｎｍ菌株的ＰＣＲ方法。

３Ｎｍ的多重（复合）聚合酶链反应（ＰＣＲ）

普通ＰＣＲ主要用于单一致病因子的鉴定；多重ＰＣＲ反应原理与一般ＰＣＲ相同，主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定，也可用于某些遗传病及癌基因的分型鉴定。

近年来，多重ＰＣＲ技术越来越广泛应用于Ｎｍ的检测。

任红宇等［１０］针对包括Ｎｍ在内的８种细菌的特异性基因，通过优化单一ＰＣＲ扩增体系及扩增程序，初步建立了能同时检测８种导致细菌性脑膜炎的病原体的复合ＰＣＲ扩增方法。

熊长辉等［１１］应用多重ＰＣＲ技术对其实验室保存的７０株已经血清学鉴定的Ｎｍ实行核酸鉴定及基因分群，同时检测２３例流脑疑似病例脑脊液标本中Ｎｍ特异性ＤＮＡ片段，发现６８株Ｎｍ的多重ＰＣＲ检测结果与血清学分群结果一致，２株血清学未能分群的Ｎｍ经多重ＰＣＲ检测为Ｃ群；２３例流脑疑似病例脑脊液标本经多重ＰＣＲ检测有５例为Ｃ群，１例为Ａ群，１例为Ｂ群，阳性检出率为３０．４３％，传统的病原分离培养、生化鉴定和血清学鉴定４例为Ｃ群，阳性检出率为１７．３９％。

可见多重ＰＣＲ技术对Ｎｍ检测的特异性优于病原学检测。

ＤＩＡＷＡＲＡ等［１２］应用复合荧光实时ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）技术对脑脊液中的Ｎｍ和肺炎链球菌实行了检测，结果表明，Ｎｍ和肺炎链球菌的不同熔融温度的两峰分别为８７．５℃、８５．５℃。

Ｎｍ和肺炎链球菌的ＲＴ－ＰＣＲ的灵敏度分别为１００％（９５％ＣＩ：

８２．４～１００．０，８５．１～１００．０），二者特异度相同，均为１００％（９５％ＣＩ：

８８．６～１００．０）。

Ｎｍ和肺炎链球菌引起的脑膜炎的诊断准确率分别提升到５０．７％和２８．６％。

ＤＥＦＩＬＩＰＰＩＳ等［１３］利用多重ＰＣＲ技术对Ｎｍ、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌实行了检测，总共收集了１１０个分离株和１３４例临床标本（９９例脑脊液和３５例血液标本）并实行了分析，结果表明，所使用的方法快速、特异性好、灵敏度高。

ＺＨＵ等［１４］利用多重ＰＣＲ技术对Ｎｍ实行了基因分型。

结果表明，其检测灵敏度为１ｎｇ基因组ＤＮＡ（相当于４×１０５基因组），脑脊液标本中为３×１０５ｃｆｕ／ｍＬ，这种多重ＰＣＲ检测可能有助于临床诊断和流脑流行病学监测。

４荧光定量ＰＣＲ检测Ｎｍ法

荧光定量ＰＣＲ通过荧光染料或荧光标记的特异性探针对ＰＣＲ产物实行标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过相对应的软件能够对产物实行分析，计算待测样品模板的初始水平。

雷永良等［１５］应用该技术对１６７例流脑监测标本实行了检测，并与传统的病原学检测实行比较，结果表明新方法与传统方法阳性符合率为５５．５６％，另有４例传统方法检测为阴性的标本用荧光定量ＰＣＲ检测为阳性，其特异度、灵敏度都高于传统培养法，且检测周期更短。

杨艳等［１６］针对Ｎｍ特异性基因ｐｏｒＡ设计引物、探针，用实时荧光ＰＣＲ技术实行检测，并与常规ＰＣＲ比较，结果表明应用实时荧光ＰＣＲ检测时，６４株Ｎｍ检测结果均为阳性，６株非Ｎｍ结果均为阴性。

检测灵敏度达５．０×１０３ｃｆｕ／ｍＬ，即５ｃｆｕ／ｔｅｓｔ，比常规ＰＣＲ灵敏度高10倍，并且结果重复性好。

张晓春等［１７］采用荧光定量ＰＣＲ检测健康者咽拭子中Ｎｍ的带菌情况，结果表明，荧光定量ＰＣＲ的灵敏度、特异度均为１００％，阳性预测值（ＰＰＶ）为１３．０９％，阴性预测值（ＮＰＶ）为１００．００％，检出限为０．５ｃｆｕ／５０μＬ体系，荧光定量ＰＣＲ检出结果的时间为３ｈ，而培养法至少要２ｄ。

该方法可用于疾病的快速诊断，特别适合健康者的带菌率调查。

ＭＩＲＯＮＯＶ等［１８］采用荧光定量ＰＣＲ技术对Ｎｍ参考菌株和１８７例脑膜炎患者的脑脊液实行研究，结果表明该方法比传统培养法有更好的特异性和敏感性。

文献［１２］也将荧光定量ＰＣＲ技术与多重ＰＣＲ技术结合，取得了良好的实验结果。

５酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）检测Ｎｍ抗体水平

应用ＥＬＩＳＡ间接法检测患者急性期和恢复期血清中的抗体水平，如恢复期效价较急性期呈４倍或４倍以上升高，可作为流脑的辅助鉴别。

ＥＬＩＳＡ间接法也能够应用于健康者血清抗体的测定，结果可为当地的流脑防控提供参考。

张洪飞等［１９］应用ＥＬＩＳＡ分析了通辽市科左中旗２２１例健康者Ｎｍ带菌情况及其抗体水平，检出脑膜炎双球菌１３株，总带菌率为３．８１％；Ａ群抗体阳性率为７１．９１％，Ｃ群抗体阳性率为４７．５１％，为该地区今后的流脑预防、控制提供了科学依据。

６Ｎｍ的分子分型及其他新技术

多位点序列分型（ＭＬＳＴ）技术是从基因水平通过管家基因的点突变对Ｎｍ实行分型，利用ＭＬＳＴ能够对数十年前不同地区分离的菌株之间的亲缘关系实行评估，尤其是对不同菌群之间基因发生的频繁的重组事件，分析菌株进化关系及判断分离株是否属高致病性克隆系等方面，可补充传统血清型分型方法的不足［２０］。

ＭＬＳＴ适合用于长期的、大范围的流行病学调查和监测菌群结构变化，研究地域性传播和流行性变迁。

两株细菌ＭＬＳＴ分型结果相同，表示这两株细菌属于相同的克隆或者克隆群，不能认为他们之间有流行病学联系。

朱水荣等［２０］采用ＭＬＳＴ技术，对浙江省２００４－２０１３年部分Ｎｍ菌株展开基因分型研究，得出了浙江省Ｎｍ分离株间的遗传进化关系，为今后有针对性地制订流脑预防控制措施提供参考。

邓小玲等［２１］则采用ＭＬＳＴ技术，对广东省Ｎｍ分离株间的遗传进化关系实行了研究，为有针对性地采取预防控制措施提供依据。

脉冲场凝胶电泳（ＰＦＧＥ）是一种分离大分子ＤＮＡ的方法，实践表明，大于４０ｋｂ的ＤＮＡ不能在恒强水平琼脂糖凝胶电泳中分离，ＰＦＧＥ解决了这个难题。

ＰＦＧＥ能够用来分离相对分子质量１０ｋｂ到１０Ｍｂ的ＤＮＡ分子。

其分型的基础是大片段的插入、缺失、重组或质粒的获得、丢失或酶切位点的点突变。

ＭＯＯＤＬＥＹ等［２２］应用ＰＦＧＥ技术对南非２００２－２００６年Ｂ群Ｎｍ克隆分析，发现了一个新的基因克隆ＳＴ－４２４０／６６８８。

邵祝军等［２３］则应用ＰＦＧＥ技术对中国Ｃ群Ｎｍ分离株实行分析，结果发现ＡＨ１是中国Ｃ群Ｎｍ主要的带型。

在流脑调查中，上述两种分子分型的使用原则：

暴发调查时所有菌株实行ＰＦＧＥ，挑选代表菌株实行ＭＬＳＴ，对于流脑特异性引物ＰＣＲ扩增阳性的患者血清或者脑脊液未能分离到菌株的实行ＭＬＳＴ；个案调查时所有菌株实行ＰＦＧＥ和ＭＬＳＴ分型，对于流脑特异性引物ＰＣＲ扩增阳性的患者血清或者脑脊液未能分离到菌株的实行ＭＬＳＴ；健康携带情况调查及在全国范围的、长期的流行情况调查时所有菌株实行ＰＦＧＥ，挑选代表菌株实行ＭＬＳＴ分型。

多位点可变数目串联重复序列分析（ＭＬＶＡ）也是一种分子分型技术，其分型依据为ＶＮＴＲ位点的滑链突变。

该方法具有较好的分辨力、重复性、分型力及可比性，操作简单，试验周期为１ｄ。

ＳＨＡＮ等［２４］应用ＭＬＶＡ技术分析了序列型为ＳＴ－４８２１的Ｃ群Ｎｍ引起的２０１０年中国山东省的流脑疫情暴发。

２０００年日本学者发明了恒温核酸扩增技术，即环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）。

近年来该技术已成功地应用于流脑、ＳＡＲＳ、禽流感、ＨＩＶ等疾病的检测中。

ＬＥＥ等［２５］应用ＬＡＭＰ技术对脑脊液中的Ｎｍ实行了快速鉴定，结果表明，该方法灵敏度高（比传统的ＰＣＲ方法高２～５个数量级），反应时间短（３０～６０ｍｉｎ就能完成反应）。

蛋白质组学技术是从蛋白质水平实行生命科学研究的新方法。

有疾控工作者用该方法初步探索了Ｎｍ部分蛋白表型特征分析。

胡源等［２６］利用双向电泳技术与质谱结合的蛋白质组学技术对６６株Ｃ群Ｎｍ菌株及２株参考菌株的部分外膜蛋白和ｓｕｃＤ蛋白表型实行分析，根据外膜蛋白和ｓｕｃＤ蛋白将实验菌株共分为９型，其中安徽菌株分型结果显示出了高度的一致性，而其他地区菌株分型分布则显示出高度的多态性，结果对理解安徽省流脑的流行规律和有效实行流脑疫情的防控具有重要意义。

综上所述，Ｎｍ的实验室检测技术涉及传统的病原学检测技术、免疫学ＥＬＩＳＡ及持续更新的分子生物学方法，如ＰＣＲ、荧光定量ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、ＬＡＭＰ技术、ＭＬＶＡ分型、ＭＬＳＴ技术、ＰＦＧＥ分型、蛋白质组学技术等。

Ｎｍ的分子生物学方法比传统病原学检测法具有更高的特异性和灵敏度。

当然各种技术并非单一的，实际工作中可能相互融合，以更好地优化Ｎｍ的检测分析。

新的方法也有其不足之处，如ＬＡＭＰ因灵敏度高，容易形成气溶胶污染，因为国内绝大多数实验室不能严格分区，假阳性问题可能比较严重，所以，引物设计要求比较高，有些疾病的基因可能不适合使用ＬＡＭＰ；蛋白质组学技术中２－ＤＥ技术还不成熟，现在有更新的色谱质谱联用法取代２－ＤＥ和质谱鉴定法，对蛋白质的鉴定更准确，将更好地服务于疾病预防控制工作中。

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