生物蛋白分离陈仁良06.docx
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生物蛋白分离陈仁良06
银杏黄酮分离纯化
工艺研究
班级：
08生技
学号：
2008081506
姓名：
陈仁良
本文研究了银杏叶中总黄酮的分离纯化工艺采用柱层析法，以硅胶作为吸附介质，对影响分离纯化银杏黄酮的影响因素进行了单因素实验和正交优化实验的研究。
确定了银杏叶总黄酮的最佳分离纯化工艺参数。
以芦丁为标准品，黄酮回收率作为考察指标，实验结果表明：
上样浓度为0.180mg/ml，洗脱剂配比（石油醚:
乙醇=9:
1），洗脱流速为1.0ml/min。
近年来，随着国内、外对植物化学物研究和应用的逐渐广泛深入，银杏叶中的总黄酮己被证实为具有药用价值和较高保健作用的有效活性成分，日益得到重视，具有极大的研究价值和开发潜力。
银杏又名公孙树，为银杏科银杏属植物。
银杏叶中黄酮类化合物含量较高，为2.5%~5.91%，主要含有黄酮和银杏内酯等有效成分，其中银杏黄酮具有扩张血管，增加脑血管流量，降低脑血管阻力，改善脑血管循环功能，保护脑细胞，免受缺血损害扩张冠状动脉；防止心绞痛及心肌梗塞，抑制血小板活化因子、抗氧化，防止血栓形成，清除有害的氧化自由基，提高免疫力和调血脂等药理作用[1]。
对治疗心脑血管疾病，增加冠状动脉血流量，及治疗脑缺血、脑老化、老年痴呆症哮喘等有独特疗效。
国内外相继有银杏叶黄酮新药投入市场。
图1.1黄酮类化合物的结构图
黄酮类化合物（flavonoids）主要是指基本母核2-苯基色原（2-Phenyl-chromone）类化合物，现在则是泛指两个苯环（A-与B-环）通过中央碳链相互联结而成的一系列化合物。
其中，黄酮醇类（flavonol）化合物是在黄酮本母核3位上连有轻基或其他含氧基团。
目前从银杏叶中分离得到的黄酮类合物有35种之多，已明确结构的有20种，其结构式可归为六种（具体见图1.1）。
目前一些市场上销售的银杏类产品：
银杏叶为银杏科植物银杏的干燥叶。
银杏叶中药用成分重要包括：
银杏黄酮（flavonoids）、菇内酷、聚异戊烯醇、有机酸、银杏酸等，其中银杏黄酮和菇内醋含量较大，其效用也被广为认可。
银杏黄酮具有捕获游离基、清除活性氧、促进血液循环、治疗肝中毒、抗肿瘤活性及脑代谢等功能。
另外银杏叶还含有39种营养及功能成分，这其中包括:
蛋白质、糖、维生素C、维生素E、胡萝卜素、18种氨基酸、25种矿物质营养微量元素，其中钙、磷、硼、硒含量较高，其他如人体所需的铁、氟、铜、锰、锌、铬等含量也较丰富。
其中维生素C、维生素E、胡萝卜素、硒、锌、铜等作为营养性抗氧化剂与非营养性抗氧化剂一银杏黄酮、菇内醋、儿茶素、多酚类等对保护机体不受自由基所致的氧化和损伤发挥着重要的作用。
使用大功率聚能式中间探入超声换能器能在更短的时间得到更高的提取效率，郭国瑞等以水为介质，测得该法是常规水浸提效率的3倍左右。
超声波提取法省时、高效、节能、且属绿色提取技术，具有广泛的应用前景。
为此，以银杏叶为研究原料，总黄酮为指标成分，对其所含的总黄酮成分进行提取、分离纯化及含量测定，以使其物质基础明确、质量稳定可控、使用检测方便，能作为功能性基料使用进行工业化生产，开发相应的保健食品，供应市场。
银杏黄酮定量分析
黄酮类化合物的测定方法有薄层扫描法、紫外分光光度法、液相色谱法等。
（1）色谱法薄层扫描法
多于测定银杏中芦丁含量。
具有取样量少、分离效果好、结果准确的特点。
景仁忠、陈波（1997年）采用此法测定了苦荞叶中芦丁的含量。
高效液相色谱法（HPLC）:
多用于苦荞及其制品中芦丁含量的测定的特点，样品多采用不同浓度的甲醇、乙醇直接提取，也有经柱层层析分离等方法。
（2）分光光度法
由于A13+仅与黄酮类物质有特征反应，因此直接加硝酸铝。
采用分光光度法测定银杏叶提取液中总黄酮含量。
利用银杏黄酮母核上有3-OH/5-OH，B环上有邻苯二羟基,可与A13+在碱性溶液中显色的原理测定其含量。
常见有NaNO2-Al（NO3）3法和AlCl3分光度法。
陈运中[15]（1998年）采用此法以NaNO2-Al（NO3）3法和AlCl3—索氏抽取苦荞麦粉总黄酮，在波长500nm处比色，测定了荞麦黄酮含量。
薄层扫描法、液相色谱法测定银杏叶提取液中总黄酮的含量都比较繁琐，非黄酮类物质干扰比较大。
本文为此，选取紫外分光光度法，方法简单快速，通过绘制芦丁标准曲线，再通过计算来测定分离提取的银杏黄酮总含量。
紫外分光光度法其分析原理为:
其他的试剂与银杏黄酮类物质有特征反应，但是与银杏黄酮类物质中的组分呈现的颜色差别比较大，而铝盐与银杏黄酮类物质的特征显色比较一致,氯化铝或硝酸铝与银杏黄酮类物质生成的络合物多为黄色（最大波长为500nm），可用于银杏黄酮类物质的定性及定量分析。
银杏黄酮定性分析
对于银杏黄酮的定性分析方法很多显微鉴别法、一般化学反应法、紫外光谱法、交流示波极谱法和层析法。
（1）显微鉴别法
显微鉴别法适用于药材性状鉴别特征不明显或外形相似而组织结构不同，不易辨认或区分。
但此方法目前还不成熟，使用不够严谨。
（2）紫外光谱（UV）
由分子中电子能级的跃迁而产生的，位于可见紫外光区，可以用可见—紫外分光光度计进行测定。
它是一种利用某些物质的分子吸收200～800nm光谱区的辐射来进行分析测定的方法。
这种分子吸收光谱产生与价电子和分子轨道上的电子在电子能级间的跃迁，广泛用于无机和有机物质的定性和定量测量。
物质的紫外吸收光谱基本上是分子中发色团和助色团的特性。
在研究化合物结构中的主要作用是推测功能团结构中的共轭体系中取代基的位置、数目等。
（3）红外光谱
当样品受到频率连续变化的红外光照射时,分子吸收了某些频率的辐射,并由其振动和转动引起偶极矩的净变化,产生分子振动和转动能级从基态到激发态的跃迁,使相应于这些吸收区域的透射光强度减弱。
物质的红外光谱具有特征性，不同的物质其红外光谱不同，故可用来进行物质的定性、结构分析及定量分析等。
红外光谱具有快速、高灵敏度、试样用量少，但其操作比较复杂，应用范围小。
（4）元素分析法
一般是用燃烧法确定化合物中存在哪些元素，并能判断出各种元素在该化合物中的相对含量，从而确定元素的分子式。
（5）层析法
层析法种类很多，常用的是纸层析法和薄层层析法。
纸层析，以纸为载体的色谱法。
固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。
将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开。
当组分移动一定距离后，各组分移动距离不同，最后形成互相分离的斑点。
将纸取出，待溶剂挥发后，用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。
根据组分移动距离（Rf值）与已知样比较，进行定性。
用斑点扫描仪或将组分点取下，以溶剂溶出组分，用适宜方法定量（如光度法、比色法等）。
薄层层析，是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。
这是一种快速分离诸如脂肪酸、类固醇、氨基酸、核苷酸、生物碱及其他多种物质的特别有效的层析方法。
它保持了操作方便、设备简单、显色容易等特点。
本文采用薄层层析法进行黄酮的定性分析，因为它具有分离和分析的双重功能，并有简便、快速等优点，其运用关键在于对照品的选择、样品液的制备和展开剂的选择。
而纸层析因为其受外界的影响因素较大，测量结果误差大。
薄层分析方法
将样品溶液用毛细管点在薄层板的一端，置密闭槽中，加入适宜溶剂为流动相。
由于毛细管原理，溶剂被吸上，沿板移动，并带动样品中各组分向前移动，这个过程称为展开。
由于各组分性质不同，移动距离不同，展开一定距离后，即得互相分离的组分斑点。
可用适当方法使各组分在板上显示其位置，如组分本身有颜色，即可直接观察，否则可喷显色试剂或在紫外灯下观察荧光等办法确定斑点位置。
薄层分析制作过程
薄层层析法以吸附层析使用最为普遍。
常用的吸附剂为硅胶、氧化铝等。
薄层层析和其他层析法一样，除吸附法外，也可进行分配、离子交换、分子排阻等机理的层析，即将铺制薄层的材料相应换为涂以固定相的载体、离子交换剂、凝胶等，其操作与吸附法基本相同。
薄层板现在市场上有制好出售的，不需要再进行复杂的制作过程。
购买回来的市售薄层板需要活化。
在选择合适的展开剂后，需要做相应的对照试验来选择适宜的配比。
展开有多种方式，将薄层板垂直或倾斜放置，将展开溶剂加于低部，使之自下向上移动。
下行法则为用滤纸将溶剂引至薄层上端，使其自上向下流动。
平行展开时，将板平放，溶剂被吸上至薄层板点有样品的一端,进行展开。
使用圆形薄层板时,将样品点在圆心附近，使溶剂自圆心向圆周方向移动，称为环形展开或径向展开；将样品点在圆周位置，使溶剂自圆周向圆心移动的为向心展开，适用于比移值大的组分的分离。
将点样品处附近的吸附剂刮去，使溶剂只能通过样品点附近的较窄部分前进展开，因而溶剂前缘呈弧形的展开方式，也称径向展开，这种方式对较难分离的组分可能效果好些。
将样品点在方形薄层板的一角，先沿着一个方向展开，然后将板转动90°，再沿着另一方向展开的为双向展开。
多次展开和双向展开都可加强分离效果。
一般的分离纯化实验
（1）高效液相色谱法 此法在分析测定黄酮类化合物方面起着重要作用。
自70年代以来，应用HPLC技术已成功地分离了大量的黄酮类化合物，由于色谱新技术的不断使用，大大提高了分离效果，计算机辅助下新的优化方法的研究，新的柱子和流动相的研究，特别是近几年应用较多的丙醇－环醚－水体系，使一些用传统的甲醇（乙腈）－水体系难以分离的黄酮类化合物得到了很好的分离。
缺点是有“柱外效应”。
在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。
高效液相色谱检测器的灵敏度较差。
（2）超临界流体色谱法 此法是利用超临界流体作为萃取剂从液体和固体中提取某种高沸点的成分，以达到分离或提纯的目的。
SFC法是近十年来才发展的一种新型技术，尤其近几年得到迅速发展，它具有提取效率高，无溶剂残留，天然植物中活性成分和热不稳定成分不易被分解破坏而保持其天然特征等优点，同时还可以通过控制临界和压力的变化来达到选择性提取和分离纯化的目的，所以广泛用在天然植物中的有效成分的提取方面。
但其设备操作复杂，耗能、耗资较大。
（3）柱层析法 分离黄酮类化合物常用的柱层析有硅胶柱层析、聚酰胺柱层析和葡萄糖凝胶柱层析。
他们的反应原理不同，分别因化合物极性、氢键能力、吸附力不同而达到分离目的。
因此在具体使用时要有选择的综合利用。
结构合理，安装简便，装柱简便，洗脱小，根据实验需要，可调节，能保护凝胶面不受液流的破坏，层析液流动均匀，从而提高分辩率。
湿法、干法上样选择
湿法省事，一般用洗脱剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶剂越少越好，不然溶剂就成了洗脱剂了。
有的上样后在硅胶上又会析出，是因为硅胶对样品的吸附饱和，而样品本身又是比较好的固体才会发生，样品随着洗脱剂流动会溶解。
有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱（比如DMF,DMSO等，会随着溶剂一起走，显色是一个很长的脱尾），这时就必须用干法上柱了。
样品和硅胶的量有一种说法是1:
1，我觉得是越少越好，但是要保证在旋干后，不能看到明显的固体颗粒（那说明有的样品没有吸附在硅胶上）。
压力要求选择
压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。
所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。
减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。
以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。
加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。
压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。
特别是在容易分解的样品的分离中适用。
压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。
实验器材与方法
材料与仪器
实验材料
优质银杏叶
试剂
规格
生产厂家
硅胶（柱层析）
无水乙醇CH3CH2OH
氢氧化钠NaOH
亚硝酸钠NaNO2
硝酸铝Al（NO3）3
乙酸乙酯CH3CHOOC2H5
盐酸HCL
石油醚C5H12O2
芦丁试剂
大孔树脂
化学试剂300-400目
分析纯
分析纯
分析纯
分析纯
分析纯AR
分析纯AR
分析纯AR
分析纯
生化试剂BR
S-8、D101、AB-8
青岛美高集团有限公司
天津市河东区红岩试剂厂
天津市永大化学试剂有限公司
天津市永大化学试剂开发中心
天津市永大化学试剂开发中心
南京化学试剂有限公司
上海苏懿化学试剂有限公司
天津市河东区红岩试剂厂
天津市永大化学试剂有限公司
中国药品生物制品检定所
天津南开大学化工厂
主要仪器
仪器名称
生产厂家
DCTZ-2000三频多用途恒温超声提取机
R206旋转蒸发器
SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（配有布式漏斗）
UV-75系列紫外可见分光光度计
GL-20B高速冷冻离心机
WFH-203B三用紫外分析仪
HL-2恒流泵
JA2003N电子天平
点样毛细管
LG冰箱
层析柱
层析缸
北京弘祥隆生物技术研究有限公司
上海申生科技有限公司
巩义市英峪予华仪器厂
上海欣茂仪器有限公司
上海安亭科学仪器厂
上海精科实业有限公司
上海青浦沪西仪器厂
上海精密仪器有限公司
上海欣鹏玻璃仪器有限公司
浙江星普五星电器有限公司
自备
自备
实验方法
1银杏黄酮提取工艺
采用超声提取法从银杏叶中提取总黄酮。
称取100g磨碎的银杏叶，用1000ml60％的乙醇溶解称取的银杏叶，在超声功率800Hz下提取，超声3s，间隙3s，工作总时间80min。
提取液减压布式漏斗过滤，再旋转蒸发器浓缩回收乙醇。
2银杏总黄酮的含量测定方法
（1）最大吸收波长的选择
以NaNO2、Al（NO3）3和NaOH为显色剂分别做各样品提取液和芦丁标准品的吸收曲线，均在500nm处有一个强吸收峰,因此选择500nm为测定波长。
（2）芦丁标准曲线的绘制
精确配置0.1mg/mL芦丁标准液,分别取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0mL于10mL容量瓶中，各加30%乙醇使成5mL，加入5%NaNO2溶液0.3mL摇匀。
放置6min后，加10%Al（NO3）3溶液3mL摇匀放置6min后加入1moL/LNaOH溶液4mL，再加蒸馏水稀释至刻度,摇匀放置15min后于500nm波长处测定吸光度值，以吸光度值对芦丁标准品含量作图。
根据实验方法，在500nm测定各浓度的吸光度（见表2.1），并制定芦丁标准曲线，结果如图2.1所示。
表2.1芦丁标准品吸光度值
芦丁样品浓度（mg/ml）
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
吸光度/A
0.101
0.235
0.358
0.435
0.512
图2.1芦丁吸光度标准曲线
标准曲线回归方程为：
y=10.529x+0.0103
其线性范围0~0.05mg/mL，相关系数r=0.9945，说明线性关系良好。
3薄层层析方法
通过薄层层析实验，选择合适展开剂。
硅胶板，选用切割刀将板切割为2.5~3cm宽，使用之前，先将其活化，干燥箱中105℃，活化40min。
取出后，进行划线，再用点样毛细管点取黄酮原液。
选择我们的溶剂和配比，配好后加入去层析缸中静置30min，将点好的硅胶板放入其中，让其展开。
4柱层析方法
（1）硅胶的预处理
称取3g硅胶样品放入烧杯中，再放入烘箱中105℃，干燥40min。
现处理现用（防再次吸潮）。
柱层析简易图解（见图2.2）
图2.2柱层析流程图
（2）装柱
干法装柱时，先将柱竖直固定在铁架台上。
将所需量的硅胶（300-400目）通过一支短颈玻璃漏斗慢慢加入柱中至柱容积的1/2，同时，轻轻敲柱身使柱填充紧密。
干法装柱的缺点是容易使柱中混有气泡。
（3）加样
将配好的溶液沿着柱内壁缓缓加入，切记勿冲动吸附剂，否则将造成吸附剂表面不平而影响分离效果。
（4）洗脱
洗脱剂极性大小和对被分离物各组分的溶解度大小对于分离效果非常重要。
如果洗脱剂的极性远大于被分离物的极性，则洗脱剂将受到吸附剂的强烈吸附，从而将原来被吸附的待分离物“顶替”下来，随多余的洗脱剂冲下而起不到分离作用；如果洗脱剂的极性远小于各组分的极性，则各组分被吸附剂强烈吸附而留在固定相中，不能随流动相向下移动，也不能达到分离的目的。
（5）样品收集
用规格相同的试管对样品进行收集，每个试管收集2ml洗脱黄酮液，收集完做紫外可见分光光度法分析。
实验结果与讨论
1、展开剂的选择
表3.1不同展开剂对黄酮类化合物的分离影响
展开剂
分离结果（Rf紫外分光显示）
石油醚：
乙醇（5:
5）
Rf1=0.19Rf2=0.43Rf3=0.65Rf4=0.86Rf5=0.95
乙醇：
乙酸乙酯（5:
5）
Rf1=0.09Rf2=0.24Rf3=0.37Rf4=0.57Rf5=0.74
甲醇：
氯仿：
水（5:
4:
1）
Rf1=0.39Rf2=0.45Rf3=0.50Rf4=0.69
甲醇：
丙酮（5:
5）
Rf1=0.45Rf2=0.58Rf3=0.69
乙酸乙酯
Rf1=0.35Rf2=0.40Rf3=0.56
由上表3.1可知：
石油醚：
乙醇的分离效果较好。
2、黄酮静态吸附
在进行对柱层析的填料的选择中，做了对照试验大孔树脂S-8与硅胶吸附性能的比较由图3.1可知，大孔树脂的吸附饱和时间比较短，但硅胶的吸附率明显大于大孔树脂，由此，选择硅胶作为分离纯化黄酮的柱层析吸附填料。
图3.1银杏黄酮大孔树脂与硅胶静态吸附率比较曲线
黄酮原液分别稀释15倍、20倍、30倍，硅胶对黄酮的静态吸附结果如图3.2所示。
图3.2银杏黄酮硅胶静态吸附率曲线
由图3.2可知，随着吸附时间的延长，稀释的黄酮吸附率逐渐增加，5小时以后，吸附率变化不大，所以吸附时间选择5小时左右为佳。
且直观的看出三种稀释倍数下，稀释20倍的黄酮原液吸附效果比较好，且在吸附时间5小时左右达到饱和状态。
3、黄酮静态解吸
从薄层层析中分析，选取石油醚：
乙醇为洗脱剂做静态洗脱实验，结果如图3.3所示。
图3.3银杏黄酮静态解吸曲线
由图3.3可知，在洗脱过程中，5小时前黄铜浓度逐渐降低，到达5小时后解吸曲线趋于平滑，说明洗脱达到饱和，洗脱时间在5小时左右。
4、单因素实验
对分离纯化工艺来说，上样浓度、溶剂的种类、洗脱剂配比、洗脱流速、提取温度、提取时间等因素对分离纯化效果影响较大，针对银杏黄酮分离纯化工艺我们主要从上样浓度、洗脱剂配比、洗脱流速三个因素来考察对分离纯化的影响，为正交试验设计的水平提供有意义的取值范围。
4-1不同上样浓度对分离纯化的影响
动态吸附实验是在柱层析上开展的，选择了五组不同的稀释黄酮原液浓度分别为10倍、15倍、20倍、25倍、30倍，在动态实验的复杂在于控制单因素变量，在做动态吸附时，得保持其他的变量一致。
如图3.4所示，是不同上样浓度之间的比较。
图3.4不同上样浓度比较
由图3.4可见，在温度、硅胶量等外界条件一致，不同的上样浓度下，所得到的吸附曲线有明显的分开，每条曲线都在5小时左右有一个最大吸附浓度的波峰，说明在这个时候硅胶的吸附量已经达到饱和，可以得出结论黄酮原液稀释20倍，吸附5小时，此时的吸附浓度最好。
最高波峰和最低波峰之间，由于硅胶对浓度为0.02~0.025mg/ml下的黄酮的吸附率比较大，产生不同的波峰。
4-2不同洗脱剂配比对分离纯化的影响
在动态洗脱实验过程中，变量因素只有洗脱剂的配比不同，上样浓度、洗脱流速、温度等是相同且保持不变的，在不同的洗脱配比下，得到如图3.5所示柱状图。
图3.5不同洗脱剂配比洗脱比较
由图3.5可见，在上样浓度、洗脱流速、温度等是相同且保持不变情况下，可以直观的看出在洗脱5小时、石油醚:
乙醇=5:
5的配比时，洗脱浓度是最大的，过了这个配比后洗脱浓度成下降趋势。
从图中还可以分析出极性大的试剂比对黄酮的洗脱量比较大。
4-3不同洗脱流速对分离纯化的影响
由于硅胶颗粒细小，装柱后较致密，流动相的流速慢，分离时间长。
采用恒流泵来调节不同洗脱流速，且上样浓度、洗脱剂配比、温度等是相同且保持不变情况下，以洗脱后的黄酮浓度为指标来确定最佳洗脱流速，结果见图3.6。
图3.6不同洗脱流速比较
由上图3.6可以得出，在5小时前随着洗脱流速的增加，洗脱浓度不断提高，5小时之后洗脱浓度降低。
不同的洗脱流速下得到不同的峰值，这受到硅胶的影响，超出或小于1~1.2ml/min这段流速，由于物质吸附-解吸不充分，降低了柱效。
明显看出，1.2ml/min的流速的洗脱峰值最高，故选1.2ml/min为最佳流速。
5、正交试验
根据单因素试验结果，以上样浓度、洗脱剂配比、洗脱流速为试验因子，进行三因素三水平的正交优化试验。
以实验黄酮回收率（%）为考察指标，如表3.2所示：
表3.2正交试验因素水平表
水平
因素
A
上样浓度（mg/ml）
B
石油醚:
乙醇
C
洗脱流速（ml/min）
1
0.245
9:
1
0.6
2
0.180
5:
5
1.0
3
0.101
6:
4
1.2
表3.3L9（34）正交试验和结果
实验号
A
B
C
D
回收率（%）
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
1
1
2
2
2
3
3
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
2
3
1
3
1
2
1
2
3
3
1
2
2
3
1
43.85
50.00
48.16
80.00
55.16
64.72
74.46
86.67
79.21
Ⅰ
142.01
198.31
195.24
Ⅱ
199.88
191.83
209.21
Ⅲ
240.34
192.09
177.78
极差R
32.78
192.09
10.48
图3.7正交试验结果直观图
由表3.3、图3.7可见，对所得数据进行直观分析和方差分析。
结果可以看出，在上样浓度、洗脱剂配比、洗脱流速这3个因素中，最主要的影响因素洗脱剂配比，其次是上样浓度，最佳条件应为A2B1C2。
经过验证实验，证实A2B1C2条件确切是最佳工艺参数。
结论与应用
本论文对银杏叶中黄酮类化合物的分离纯化条件进行了比较研究。
采用单因素分析和正交实验设计对工艺参数进行了优化。
可以得到以下结论：
1.通过实验中单因素的比较，可以发现，大孔树脂和硅胶在吸附分离纯化银杏黄酮中有较大的区别，硅胶的分离效果较佳。
2.上样浓度、洗脱剂配比、洗脱流速这3个因素，经过正交优化实验，测得最优工艺条件为：
上样浓度为0.180mg/ml，洗脱剂配比（石油醚:
乙醇=9:
1），洗脱流速为1.0ml/min。
经验证实验证实为最佳工
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