CCK8对甲基苯丙胺诱导神经损伤的影响及其抗炎机制研究.docx

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CCK8对甲基苯丙胺诱导神经损伤的影响及其抗炎机制研究

CCK-8对甲基苯丙胺诱导神经损伤的影响及其抗炎机制研究

毒品滥用是目前困扰世界各国的严重医学和社会问题,由毒品滥用引发的疾病和犯罪行为严重影响着人类健康和社会安定,在我国,冰毒、摇头丸等新兴化学合成毒品日益流行。

甲基苯丙胺（methamphetamine,METH）,俗称“冰毒”,属于苯丙胺类精神兴奋剂。

METH为阳离子脂溶性分子,极易透过血脑屏障,选择性作用在脑干以上的中枢神经系统,长期滥用可引起包括啮齿类或灵长类动物在内的神经毒性作用,降低猴子和大、小鼠的纹状体中的神经递质多巴胺（Dopamine,DA）及其代谢产物DOPAC（Dihydroxy-phenylaceticacid,DOPAC）的含量;减少DA与转运体的结合位点,抑制色氨酸羟化酶和酪氨酸羟化酶的活性,引起多巴胺及5-羟色胺能广泛的神经末梢损伤,以纹状体最明显。

METH长期滥用导致明显的行为、精神和认知功能的异常,如记忆力丧失、攻击行为、精神异常等症状,严重者甚至造成心脏和脑的损伤。

但是METH神经损伤的相关作用机制尚未完全明了。

近年来,免疫系统在METH神经毒性中的作用研究越来越广泛。

大量细胞及动物水平的研究结果提示免疫系统细胞和分子在暴露于METH后激活,从受体水平、细胞内组件、炎症因子释放到能量代谢均发生变化。

例如:

单次大剂量给予METH可以引起小鼠纹状体及海马的IL-6和TNF-a、大鼠下丘脑IL-1b的蛋白表达量的升高。

但是,METH诱导促炎因子分泌增多的确切机制研究得并不十分清楚。

小胶质细胞是定居在中枢神经系统的主要免疫细胞,参与中枢神经系统的固有免疫,并作为中枢神经系统的第一道防线对抗外来因素的损伤。

小胶质细胞参与调解多种促炎及抗炎因子的释放,小胶质细胞分子标记物的表达升高与多种中枢系统疾病相关,如阿尔兹海默氏病和帕金森氏病等。

小胶质细胞活化同时调节成瘾性药物的奖赏行为。

越来越多的证据表明,应激或其他因素引起的小胶质细胞活化与促炎因子释放的增多与转录因子NF-kB、AP-1、CREB以及STAT的转录活性增强密切相关。

NF-kB是炎症调节中十分重要的转录因子,抑制NF-kB转录活性或敲减NF-kB基因,可以明显抑制LPS诱导的炎症因子分泌增多,NF-kB的活化是iNOS及TNF-a等炎症因子分泌增多的前提条件。

胆囊收缩素（cholecystokinin,CCK）是由33个氨基酸组成的多肽,广泛存在于中枢和周围神经系统。

CCK通过激活两种不同的受体亚型（CCK1R和CCK2R）参与镇痛、认知、奖赏、学习记忆、内分泌、免疫等多系统机能活动等过程,是神经-内分泌-免疫调节网络的重要物质基础。

它参与调解神经递质的释放,诸如,DA和GABA,CCK有可能作为一种神经递质调节因子。

在由VTA投射到NAC的多巴胺神经元,CCK与DA存在共释放。

CCK受体敲除的小鼠,DA系统活性受到影响。

抑制CCK2受体后,突触前膜及后膜的多巴胺D2受体敏感性增强。

LoonamTMetal等发现CCK调节METH在纹状体的神经化学反应。

并且CCK-8在神经损伤模型中具有神经保护作用,CCK-8通过抗炎机制在糖尿病肾病中发挥保护作用。

但CCK-8是否对中枢神经炎症具有抗炎作用,CCK-8是否通过干预METH诱导的神经炎症改善METH引起的神经毒性作用,目前并无相关报道。

基于以上研究背景,本研究通过动物行为学及组织学观察,明确CCK-8对METH神经损伤过程的作用及其量效关系;观察小胶质细胞表面CCK1/2受体的表达,阐明CCK-8对小胶质细胞具有何种调节作用,以及CCK-8对炎症细胞因子释放的影响;阐明CCK-8调节小胶质细胞的活化以及炎症细胞因子释放的受体及受体后信号传导机制,以及CCK1/2受体介导的信号途径与调节炎症的信号途径之间的相互作用关系,为CCK-8在甲基苯丙胺滥用防治方面的实际应用提供新的思路和可靠的理论依据。

第一部分CCK-8对METH诱导的行为变化及多巴胺神经损伤的作用目的:

动物水平评价外源性CCK-8对METH诱导小鼠行为变化的作用。

包括低剂量METH（1mg/kg）诱导的小鼠行为敏化的形成、表达;高剂量METH（10mg/kg）诱导的小鼠刻板行为;并评价外源性CCK-8对METH急性作用引起的高热及黑质纹状体内多巴胺神经毒性的作用。

方法:

1提前15min侧脑室注射CCK-8（0.01、0.1μg）预处理C57BL/6小鼠,之后腹腔注射METH（1mg/kg）,放入自发活动箱,测试小鼠30min内活动总路程,评价CCK-8对METH单次注射诱发的小鼠活动性增高的作用;2评价CCK-8对低剂量METH诱导的小鼠行为敏化的影响。

小鼠适应性测试活动性3天,腹腔注射METH（1、2mg/kg）7天,并自然消退7天,然后皮下注射METH1、2mg/kgMETH激发,测试小鼠30min内运动总路程,建立小鼠行为敏化模型,确定METH模型的剂量,之后在形成期及表达期注射METH前15min各组小鼠分别给予侧脑室注射不同剂量CCK-8（0.001、0.01、0.1μg）观察其对行为敏化形成及表达的干预作用。

最后,按METH训练时间,侧脑室注射不同剂量CCK-8（0.01、0.1μg）后,测试大鼠30min内运动总路程,观察CCK-8是否诱导小鼠形成行为敏化;3评价CCK-8对高剂量METH诱导的小鼠刻板行为的影响,刻板行为评分参考Sams-Dodd’s刻板行为评分标准。

首先观察METH诱导小鼠刻板行为的剂量效应关系,建立小鼠刻板行为模型,腹腔注射METH（3、10、20、40mg/kg）一天4次,间隔3h,最后一次注射METH后评分1h,每10min评分一次,计算总分值进行比较。

之后观察每次注射METH（3、10mg/kg）前15min各组小鼠侧脑室注射CCK-8（1μg）对小鼠刻板行为评分的作用。

最后,侧脑室单独注射CCK-8（1μg）,一天4次,时间间隔3h,观察CCK-8本身是否诱导小鼠刻板行为;4评价CCK-8对高剂量METH诱导的高热的作用。

腹腔注射METH（10mg/kg）一天4次,间隔3h,每次METH注射前15min侧脑室注射CCK-8（1μg）,肛温测量时间为第一次注射前30min、每次药物注射后1h及第一次药物注射后24h;5评价CCK-8对METH诱导的纹状体及黑质多巴胺神经损伤的影响。

腹腔注射METH（10mg/kg）一天4次,间隔3h,每次METH注射前15min侧脑室注射CCK-8（1μg）,第一次给药后24h处死动物。

免疫组织化学及Westernblot法检测纹状体内多巴胺神经元末梢TH及DAT变化,以及中脑黑质内多巴胺神经元的变化。

结果：

1CCK-8（0.01、0.1μg）预处理明显抑制METH（1mg/kg）单次给药诱发的小鼠活动性增高;2METH（1、2mg/kg）诱导小鼠形成明显的行为敏化。

CCK-8（0.01、0.1μg）单药本身不能诱导小鼠形成行为敏化,但能剂量依赖性的抑制METH（1mg/kg）诱导的行为敏化的形成期和表达期小鼠活动性增高的程度;3METH（3、10、20、40mg/kg）剂量依赖性的升高小鼠刻板行为总评分,CCK-8（1μg）预处理对小鼠刻板行为总评分无作用,CCK-8（1μg）预处理降低METH（3mg/kg）引起的刻板行为总评分的升高,但对METH（10mg/kg）无作用;4CCK-8（1μg）预处理明显抑制METH（10mg/kg）诱导的小鼠高热,CCK-8对小鼠体温无明显作用;5CCK-8（1μg）预处理改善METH（10mg/kg）重复给药引起的小鼠纹状体内TH及DAT表达的降低,同时改善中脑黑质内TH表达量的降低。

小结:

CCK-8预处理,能够抑制METH单次或重复给药引起的C57BL/6小鼠行为异常,如活动性增高,行为敏化的形成和表达、刻板行为;并减轻METH诱导的纹状体内多巴胺神经末梢的损伤、多巴胺转运体的降低以及黑质多巴胺神经元细胞的损伤。

这些发现提示,CCK-8可能对METH滥用引起的多种症状具有治疗意义。

第二部分CCK-8对METH诱导的神经炎症的作用目的:

在体及离体水平评价CCK-8对METH诱导的小胶质细胞活化及炎症因子分泌的变化的干预作用,明确CCK-8对METH致中枢损伤的炎症机制的调节作用。

方法：

1C57BL/6小鼠,METH10mg/kg一天重复给药4次,间隔3h,第一次给药后24h取脑组织。

应用微量样本多重蛋白定量技术检测METH诱导的小鼠纹状体炎症因子变化及CCK-8的干预作用;免疫组织化学法观察METH诱导的小鼠纹状体、前额叶皮层和海马的内小胶质细胞活化及CCK-8干预作用;2流式细胞术及细胞免疫荧光法鉴定离体小鼠源小胶质细胞系N9细胞Iba1表达;3RT-RCR及细胞免疫荧光法检测N9细胞CCK1R和CCK2R受体mRNA及蛋白水平表达;4MTT法检测METH对N9细胞生存率的影响及CCK-8的干预作用;5流式细胞术观察METH诱导的N9细胞活化及CCK-8的干预作用;6RT-RCR法检测METH诱导的N9细胞炎症因子mRNA水平变化的时效及量效关系,以及CCK-8与METH共处理细胞对METH作用的影响;7微量样本多重蛋白定量技术检测METH诱导的N9细胞培养上清内炎症因子分泌量的影响,以及CCK-8与METH共处理细胞对METH中作用的影响。

结果：

1METH10mg/kg一天重复给药4次,第一次给药后24h纹状体、前额叶皮层和海马广泛的小胶质细胞活化,表现为小胶质细胞数目明显增多,呈阿米巴样激活状态,CCK-81mg侧脑室给药对小胶质细胞的数目及形态无明显作用,但在METH给药前15min预处理小鼠,能明显减弱METH诱导的小胶质细胞激活状态;METH10mg/kg一天重复给药4次,第一次给药后24h小鼠纹状体内促炎因子MCP-1、IL-6和TNF-a水平明显升高,抗炎因子IL-10明显降低,在每次METH给药前15min侧脑室给予CCK-8（1mg）,明显减弱METH升高促炎因子与降低抗炎因子分泌的作用,IL-12p70和IFN-g纹状体内含量低,METH及CCK-8作用并不明显;2活化的小胶质细胞表达多种的分子标记物,Iba1是其中明显升高的标志物之一,Iba1表达增强表示小胶质细胞活化。

我们首先鉴定N9细胞Iba1的表达。

流式细胞术结果显示N9细胞Iba1阳性表达,细胞免疫荧光法标记N9细胞Iba1,激光共聚焦显微镜观察可见N9细胞胞浆及胞膜呈红色,DAPI标记胞核呈蓝色,细胞Iba1呈强阳性表达,鉴定结果显示N9细胞具有小胶质细胞表达特性,可应用为体外研究小胶质细胞功能的工具细胞;3N9细胞在mRNA及蛋白水平均检测到CCK1R与CCK2R在的表达,N9细胞可用于细胞模型的建立;4METH（0、0.5、1、2、4mM）剂量依赖性降低N9细胞生存率,CCK-8（0、0.1、0.5、1mM）对N9细胞的生存率无影响,但是CCK-8（0、0.1、0.5、1mM）与METH（0、0.5、1、2、4mM）共处理N9细胞24h,明显减弱METH对N9细胞的损伤作用,对METH1mM的干预作用最明显;5流式细胞术检测各组N9细胞标记的FITC-Iba1的平均荧光强度,LPS1mg/mL及METH1mM处理细胞6h平均荧光强度值较对照组明显升高,METH1mM成功诱导N9细胞活化。

CCK-81mM对细胞平均荧光强度值无影响;CCK-81mM与METH1mM共同处理细胞6h,明显抑制METH诱导的小胶质细胞活化;6我们检测了METH诱导的7种炎症因子在N9细胞的表达变化,包括:

IL-1b、IL-6、TNF-a、MCP-1、IL-10、IL-12p70、IFN-g。

首先观察METH的时效关系,METH1mM处理N9细胞不同时间（0、1、3、6、12h）,3h时为炎症因子表达增强的高峰,促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP1较0hmRNA表达明显增强;根据时效关系结果,我们检测METH处理细胞3h的量效关系,METH（0、0.5、1、2mM）处理N9细胞3h对炎症因子的表达变化没有明显的剂量效应关系,1mMMETH处理N9细胞3h引起促炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1表达明显升高,抗炎因子IL-10明显降低;然后METH1mMMETH处理细胞3h为细胞模型,评价CCK-8对METH诱导的炎症因子mRNA表达变化的结果。

CCK-81mM对TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1mRNA表达无影响;CCK-8（0.1、0.5、1mM）剂量依赖性减弱METH引起的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP1mRNA表达水平升高;7METH1mM处理N9细胞24h引起促炎因子IL-6、TNF-a分泌量明显升高,但没有引起MCP-1蛋白水平的变化,N9细胞上清中IL-1b蛋白量明显低于标准曲线的最低量,低于标准曲线范围,对IL-1b的结果不做统计,并在后续实验中以IL-6、TNF-a分泌量为指标评价CCK-8对METH诱导的炎症因子分泌量增高的作用。

METH1mM处理N9细胞24h,促炎因子TNF-α、IL-6分泌明显增多,CCK-81mM对N9细胞分泌TNF-α、IL-6无影响,但CCK-81mM与METH1mM共同处理细胞明显抑制METH引起TNF-α、IL-6分泌量的升高。

小结:

小胶质细胞表达CCK1R与CCK2R;在体及离体水平外源性给予CCK-8能够抑制METH诱导的小胶质细胞活化与促炎因子IL-6和TNF-a分泌增多;CCK-8能够减弱METH诱导的N9细胞生存率的降低。

第三部分CCK-8抑制METH诱导的小胶质细胞NF-kB活化的受体机制及信号通路研究目的:

观察METH诱导的小胶质细胞活化与促炎因子分泌增多与IkB-NF-kB炎症通路活化的关系及外源性给予CCK-8的干预作用;并探讨CCK-8对METH诱导的小胶质细胞IkB-NF-kB通路活化的受体机制及CCK受体后PKA/PKC通路与NF-KB信号通路的交互作用方法：

1METH1mM作用N9细胞0、5、15、30、60、90min,WesternBlot法检测细胞胞核及胞浆phospho-NF-kBp65（Ser536）与NF-kBp65蛋白表达变化以及胞浆phospho-IkB-a（Ser32）和IkB-a蛋白表达变化;2CCK-8不同剂量0、0.1、0.5、1mM与METH1mM共同作用N9细胞30min,以及METH1mM组与METH1mM+CCK-81mM分别处理细胞0、5、15、30min,WesternBlot法检测胞核phospho-NF-kBp65（Ser536）与NF-kBp65蛋白以及胞浆phospho-IkB-a（Ser32）和IkB-a蛋白表达变化;3应用CCKR特异性拮抗剂与CCK-8共同干预METH诱导的小胶质细胞IkB-NF-kB通路活化及IL-6和TNF-a的分泌增高,明确CCK-8发挥中枢抗炎作用的受体机制;4应用cAMP与PLC抑制剂与CCK-8共同干预METH诱导的小胶质细胞IkB-NF-kB通路活化及IL-6和TNF-a的分泌增高,明确CCK受体后PKA/PKC通路与炎症IkB-NF-kB的相互作用。

结果：

1METH1mM处理N9细胞5、15、30min,引起小胶质细胞胞浆内和胞核内pp65、胞浆内IkB-a蛋白磷酸化水平显著上调,在30min时,胞核内NF-kBp65蛋白升高倍数显著高于胞浆内NF-kBp65的量,说明METH处理小胶质细胞,诱导了小胶质细胞胞浆内NF-kBp65入核,激活NF-kB通路,升高NF-kB的转录活性;2CCK-8不同剂量0、0.1、0.5、1mM处理N9细胞30min,胞核内pp65、p65、胞浆内pIkB-a和IkB-a均无明显作用。

CCK-8（0、0.1、0.5、1mM）剂量依赖性的抑制METH1mM诱导的小胶质细胞IkB-NF-kB通路的活化,CCK-81mM与METH1mM共同处理细胞不同时间,CCK-8降低METH同一时间IkB-NF-kB信号通路的蛋白磷酸化水平的升高程度;3阻断CCK2R能够逆转CCK-8对METH诱导IkB-NF-kB通路活化及促炎因子IL-6和TNF-a分泌增多的抑制作用,而CCK1R拮抗剂则无此作用,但CCK1R拮抗剂能够直接抑制METH诱导的IL-6和TNF-a分泌增多;4cAMP与PLC抑制剂均不能反转CCK-8对METH诱导IkB-NF-kB通路活化及促炎因子IL-6和TNF-a分泌增多的抑制作用,但cAMP与PLC抑制剂能够直接抑制METH诱导的TNF-a分泌增多,PLC抑制剂的作用更明显。

小结:

METH能够诱导小胶质细胞内IkB-NF-kB通路活化,外源性给予CCK-8能够抑制小胶质细胞IkB-NF-kB信号通路活化;阻断CCK2R后CCK-8的抗炎作用被逆转,CCK受体后PKA/PKC通路共同与IkB-NF-kB信号通路相互作用调节METH诱导的神经炎症。

结论:

本文在体水平评价了外源性侧脑室给予神经肽CCK-8对METH诱导的C57BL/6活动性增高、行为敏化、刻板行为、高热、以及纹状体及黑质多巴胺神经损伤的影响;并在体及离体水平系统评价了CCK-8对METH诱导的神经炎症的作用;系统了研究了METH对小胶质细胞IkB-NF-kB信号通路的影响,及CCKR受体及受体后PKA/PKC通路在CCK-8抑制METH诱导的神经炎症中的调节作用。

得出以下结论:

1外源性给予CCK-8能够改善METH引起的C57BL/6小鼠活动性增高、行为敏化、刻板行为、高热,减轻METH引起的黑质和纹状体多巴胺神经损伤的程度;2小胶质细胞表达CCK1R与CCK2R,在体及离体水平外源性给予CCK-8能够抑制METH诱导的小胶质细胞活化与促炎因子IL-6和TNF-a分泌增多。

CCK-8能够减弱METH诱导的N9细胞生存率的降低。

3METH能够诱导小胶质细胞内IkB-NF-kB通路活化,外源性给予CCK-8能够抑制小胶质细胞IkB-NF-kB信号通路活化;阻断CCK2R后CCK-8的抗炎作用被逆转,CCK受体后PKA/PKC通路共同与IkB-NF-kB信号通路相互作用调节METH诱导的神经炎症。