显微技术作业课后作业A综述.docx

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显微技术作业课后作业A综述

生物电子显微技术作业

课后作业A

1.上网搜索或查阅其他资料，列表简要说明你认为能用于生物形态、结构、功能观察研究的所有方法。

以及这些方法的应用实例。

显微技术方法

应用实例

解剖显微镜

主要应用于在生物、医学领域广泛用于切片操作和显微外科手术

一、光学显微镜

复式显微镜

用于观察软木及其他植物组织

1、偏光显微镜

用于研究所谓透明与不透明各向异性材料的一种显微镜。

凡具有双折射的物质，在偏光显微镜下就能分辨的清楚，当然这些物质也可用染色法来进行观察，但有些则不可能，而必须利用偏光显微镜。

反射偏光显微镜是利用光的偏振特性对具有双折射性物质进行研究鉴定的必备仪器,可用以做单偏光观察，正交偏光观察，锥光观察。

检术方式：

1、正相镜检又称无畸变镜检，其特点是使用低倍物镜，不用伯特兰透镜（BertrandLens）,被研究对象可直接用偏振光研究。

同时为使照明孔径变小，推开聚光镜的上透镜。

正相镜检用于检查物体的双折射性。

2、锥光镜检又称干涉镜检，研究在偏振光干涉时产生的干涉图样，这种方法用于观察物体的单轴或双轴性。

在该方法中，用强会聚偏振光束照明。

2、暗视场显微镜

使用特殊的暗视场聚光镜使照明光线偏移而不进入物镜，只有样品的散射光进入物镜。

因而在暗背景上得到亮的像，与暗视场照明相反，照明的光线直接到达成像平面的，称明视场照明。

　　暗视场显微镜主要用于观察结构和折射率变化有关的物体，如硅藻、放射虫类、细菌等具有规律结构的单细胞生物以及细胞中的线状结构，如鞭毛、纤维等。

用暗视场显微镜还可观察到物镜分辨极限以下的质点，但不适用于观察染色的标本。

3、相差显微技术

正置相差显微镜

相差显微镜有暗相差和明相差之分。

这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。

倒置相差显微镜

倒置相差显微镜，是相差显微镜和倒置显微镜的结合，即既具有倒置显微镜的倒置观察方式，同时，成像原理则与相差显微镜成像原理相一致。

可以很方便地对培养中的细胞进行观察。

且相差系统的观察效果远好于一般光学观察系统。

如果安装了显微操作系统，则可以利用机械臂对细胞甚至染色体进行精细地操作，如核移植、基因导入、染色体显微切割等。

微分干涉差显微

能显示结构的三维立体投影影像。

与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。

使细胞的结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。

目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。

4、荧光显微技术

荧光显微镜

荧光显微镜是以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。

荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。

细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光。

全内反射荧光显微镜

全内角反射荧光显微镜，利用光线全反射后在介质另一面产生衰逝波的特性，激发荧光分子以观察荧光标定样品的极薄区域，观测的动态范围通常在200nm以下。

因为激发光呈指数衰减的特性，只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，大大降低了背景光噪声干扰观测标的，故此项技术广泛应用于细胞表面物质的动态观察。

荧光显微CCD

荧光显微CCD是与荧光显微镜密切相关的数码摄像产品，一方面它可以将荧光显微镜拍摄的显微摄影产品通过usb接口传输到电脑中，便于图像的采集研究，另一方面，通过荧光显微镜CCD我们可以拍摄到比单纯使用荧光显微镜更好的图片。

荧光显微镜CCD可以连接荧光显微镜组成显微成像系统。

活体体内荧光成像系统

活体生物荧光成像技术是指在小的哺乳动物体内利用报告基因-荧光素酶基因表达所产生的荧光素酶蛋白与其小分子底物荧光素在氧、Mg2+离子存在的条件下消耗ATP发生氧化反应,将部分化学能转变为可见光能释放。

然后在体外利用敏感的CCD设备形成图像。

荧光素酶基因可以被插入多种基因的启动子（promoter）,成为某种基因的报告基因,通过监测报告基因从而实现对目标基因的监测。

5、聚焦显微镜

激光共焦扫描显微镜（confocallaserscanningmicroscopy）

激光共聚焦扫描显微镜是用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。

由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨率，大约是普通光学显微镜的3倍。

系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。

调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。

激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析。

它的主要特点是：

①以激光作为光源。

②采用共焦成像系统。

③扫描、显示及记录系统。

激光具有发散角小、方向性好的优点，光束通过聚焦后落在样品（如细胞等）的不同深度；在不同方向、不同深度的平面上进行聚焦扫描，从而得到一系列不同层次的清晰图像。

平面间隔最小约600～800nm；利用微机图像合成系统可重建细胞的三维图像，可以更精确地检测、识别组织或细胞内的微细结构及其变化

双光子共焦激光扫描显微镜

双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。

双光子激发的基本原理是：

在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。

双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。

这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有100飞秒，而其周期可以达到80至100兆赫。

在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。

双光子荧光显微镜有很多优点：

1）长波长的光比短波长的光受散射影响较小容易穿透标本；2）焦平面外的荧光分子不被激发使较多的激发光可以到达焦平面，使激发光可以穿透更深的标本；3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小；4）使用双光子显微镜观察标本的时侯，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。

所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。

二、超高分辨率成像技术

1、Fluorescenceimagingwithone-nanometeraccuracy

FLONA可以追踪1.5纳米范围内的单个分子的位置。

2、Photoactivatablelocalizationmicroscopy

PALM，可以将荧光显微镜的分辨率大大提高，可达到20nm。

而PALM能做到这一点的原因是它每次只激发成像少数几个甚至只有一个分子，这样就不会有受制于分辨率了。

在定位单个荧光分子之后便要数据处理再将它们一个个的组合成原来的样子。

3、Stochasticopticalreconstructionmicroscopy

STORM是一种超分辨率数字显微镜系统的新技术，该技术将“随机光学重构显微术”（哈弗大学授权）与尼康的EclipseTi研究级倒置显微镜结合在了一起。

N-STORM能够显著提高分辨率可达到传统光学显微镜分辨率的十倍或者更多，N-STORM可采集纳米级的二维或三维多光谱图像，横向分辨率接近20nm轴向分辨率也接近50nm。

N-STORM将光学显微镜的分辨能力延伸到了前所未有的分子水平。

远大于传统光学显微镜的分辨率;通过重叠单分子图像构建超分辨率的影像;以超高的分辨率获取三维信息;独特的多色彩技术;甚至可以进行动态观察。

三、电子显微技术

1、透射电子显微镜

在光学显微镜下无法看清小于0.2µm的细微结构，这些结构称为亚显微结构或超微结构。

要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。

1932年Ruska发明了以电子束为光源的透射电子显微镜，电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。

目前TEM的分辨力可达0.2nm。

2、扫描电子显微镜

扫描电子显微镜（scanningelectronmicroscopy，SEM）主要是利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态，即用极狭窄的电子束去扫描样品，通过电子束与样品的相互作用产生各种效应，其中主要是样品的二次电子发射。

二次电子能够产生样品表面放大的形貌像，这个像是在样品被扫描时按时序建立起来的，即使用逐点成像的方法获得放大像。

四、探针显微技术

1、原子力显微镜

原子力显微镜（AtomicForceMicroscope，AFM）一种可用来研究包括绝缘体在内的固体材料表面结构的分析仪器。

它通过检测待测样品表面和一个微型力敏感元件之间的极微弱的原子间相互作用力来研究物质的表面结构及性质。

将一对微弱力极端敏感的微悬臂一端固定，另一端的微小针尖接近样品，这时它将与其相互作用，作用力将使得微悬臂发生形变或运动状态发生变化。

扫描样品时，利用传感器检测这些变化，就可获得作用力分布信息，从而以纳米级分辨率获得表面结构信息。

通过观察细胞表面形态和三维结构，可以获得细胞的表面积、厚度、宽度和体积等的量化参数等。

例如，利用AFM可以对细胞表面形态的改变、蛋白质结构及分子间作用力进行研究。

2、扫描隧道显微镜

扫描隧道显微镜（scanningtunnelmicroscope，STM）作为一种扫描探针显微术工具，扫描隧道显微镜可以让科学家观察和定位单个原子，它具有比它的同类原子力显微镜更加高的分辨率。

此外，扫描隧道显微镜在低温下（4K）可以利用探针尖端精确操扫描隧道显微镜纵原子，因此它在纳米科技既是重要的测量工具又是加工工具。

五、特殊显微技术

1、冷冻蚀刻技术

冷冻蚀刻技术是在冷冻断裂技术的基础上发展起来的更复杂的复型技术。

如果将冷冻断裂的样品的温度稍微升高，让样品中的冰在真空中升华，而在表面上浮雕出细胞膜的超微结构。

当大量的冰升华之后，对浮雕表面进行铂一碳复型，并在腐蚀性溶液中除去生物材料，复型经重蒸水多次清洗后，捞在载网上作电镜观察。

该技术是研究膜与膜蛋白的理想实验方法。

2、X射线晶体学

X射线晶体学是一门利用X射线来研究晶体中原子排列的学科。

更准确地说，利用电子对X射线的散射作用，X射线晶体学可以获得晶体中电子密度的分布情况，再从中分析获得原子的位置信息，即晶体结构。

（以下论述以高分子材料的X射线晶体学为主）由于所有的原子都含有电子，并且X射线的波长范围为0.001－10纳米（即0.01－100埃），其波长与成键原子之间的距离（1－2埃附近）可比，因此X射线可用于研究各类分子的结构。

但是，到目前为止还不能用X射线对单个的分子成像，因为没有X射线透镜可以聚焦X射线，而且X射线对单个分子的衍射能力非常弱，无法被探测。

而晶体（一般为单晶）中含有数量巨大的方位相同的分子，X射线对这些分子的衍射叠加在一起就能够产生足以被探测的信号。

从这个意义上说，晶体就是一个X射线的信号放大器。

X射线晶体学将X射线与晶体学联系在一起，从而可以对各类晶体结构进行研究，特别是蛋白质晶体结构。

3、OpticalTweezer

是一种通过激光束移动微小透明物体的装置。

其中把持物体的区域也称为光阱（opticaltrap），相应的技术称作光学捕捉（opticaltrapping）。

这种技术可以用于移动细胞或病毒颗粒，把细胞捏成各种形状，或者冷却原子。

4、倒置显微镜

倒置显微镜（invertedmicroscope）组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。

六、放射性射线技术

1、核磁共振技术

原子核有自旋运动，在恒定的磁场中，自旋的原子核将绕外加磁场作回旋转动，叫进动（precession）。

进动有一定的频率，它与所加磁场的强度成正比。

如在此基础上再加一个固定频率的电磁波，并调节外加磁场的强度，使进动频率与电磁波频率相同。

这时原子核进动与电磁波产生共振，叫核磁共振。

核磁共振时，原子核吸收电磁波的能量，记录下的吸收曲线就是核磁共振谱（NMR-spectrum）。

由于不同分子中原子核的化学环境不同，将会有不同的共振频率，产生不同的共振谱。

记录这种波谱即可判断该原子在分子中所处的位置及相对数目，用以进行定量分析及分子量的测定，并对有机化合物进行结构分析。

2、放射自显影技术

放射自显影的原理是利用放射性同位素所发射出来的带电离子（α或β粒子）作用于感光材料的卤化银晶体，从而产生潜影，这种潜影可用显影液显示，成为可见的"像"，因此，它是利用卤化银乳胶显像检查和测量放射性的一种方法。

放射性核素的原子不断衰变，当衰变掉一半时所需要的时间称为半衰期。

各种放射性核素的半衰期长短不同（表），在自显影实验中多选用半衰期较长者。

对于半衰期较短的核素，应选用较快的样品制备方法，所用剂量也应加大。

七、分子生物学技术

1、生物信息学技术

生物信息学（Bioinformatics）是在生命科学的研究中，以计算机为工具对生物信息进行储存、检索和分析的科学。

它是当今生命科学和自然科学的重大前沿领域之一，同时也将是21世纪自然科学的核心领域之一。

其研究重点主要体现在基因组学（Genomics）和蛋白质组学（Proteomics）两方面，具体说就是从核酸和蛋白质序列出发，分析序列中表达的结构功能的生物信息。

2、DNA杂交

分类学上不同物种的DNA分子之间可以进行分子杂交，但是，远缘物种的DNA分子之间进行杂交分子的可能性远比近缘物种的要小得多。

例如，细菌与真核细胞DNA分子之间形成杂交分子的可能性很小；不同细菌的DNA分子之间杂交时，能形成某些互补片段；人的DNA分子与小鼠的DNA分子之间杂交时，只有少量的人DNA单链和小鼠DNA单链能形成杂交分子，而且只是部分碱基配对。

但是，人与鼠之间的DNA杂交分子的形成，比人与酵母之间DNA杂交分子的形成要容易。

在生物进化过程中，DNA中的碱基序列也发生了变化。

两种生物的DNA单链之间互补程度越高，通过分子杂交形成双螺旋片段的程度也就越高，二者的亲缘关系就越近；反之，亲缘关系就越远。

所以，可以通过DNA分子杂交技术来鉴定物种之间亲缘关系的远近。

3、生物芯片技术

生物芯片技术是通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。

2.你认为哪些设备、技术和方法比较有用？

哪些是比较新的或者是你比较感兴趣的？

答：

我认为一些比较传统的技术，比如普通光学显微镜，相差显微镜，普通的荧光技术我们都已经可以很好地进行应用，但是对于一些比较尖端的生命科学领域的研究来说，这些传统的技术已经不能够得到满足。

生命科学在观察领域的发展一直在往微观与动态观察努力，对于我们来说，最好的情况是可以看清生命的动态运动，那么会为生命科学带来很多的发展。

比如在以上表格中的第五大类的特殊显微技术都是比较新的技术，这些技术的特点都是深入到单分子的层次，与电子显微镜不同的是，他们有希望发展成为新一代地可以让学者直接观察分子层次生命活动的可能。

再比如说，超高分辨率成像技术中的STORM技术是一种超分辨率数字显微镜系统的新技术，该技术将“随机光学重构显微术”（哈弗大学授权）与尼康的EclipseTi研究级倒置显微镜结合在了一起。

N-STORM能够显著提高分辨率可达到传统光学显微镜分辨率的十倍或者更多，N-STORM可采集纳米级的二维或三维多光谱图像，横向分辨率接近20nm轴向分辨率也接近50nm。

N-STORM将光学显微镜的分辨能力延伸到了前所未有的分子水平。

远大于传统光学显微镜的分辨率;通过重叠单分子图像构建超分辨率的影像;以超高的分辨率获取三维信息;独特的多色彩技术;甚至可以进行动态观察。

总之，这些新型的显微技术为生命科学的发展带来了新的曙光。

3.记录并向老师和同学推荐你认为比较好的参考书或网站。

答：

本文很多内容来自网络，比如维基百科、XX百科。

这些百科类网站可以为我们提供最方便的途径来了解一种技术的最基本信息。

我推荐两个网站：

NCKI知网空间，

生物秀网站和中国生物技术信息网。

这三个网站中对于生命科学领域的大部分基本问题都有较为详细的介绍。

还有几篇文献关于以上几种特殊技术的文献和书：

FLONA:

AhmetYildizetal.Science.MyosinVWalksHand-Over-Hand:

SingleFluorophoreImagingwith1.5-nmLocalization

PALM:

EricBetziget.al.Science.ImagingIntracellularFluorescentProteinatNanometerResolution.

STORM:

MarkBatesetal.Science.Multicolorsuper-resolutionimagingwithphoto-switchablefluorescentprobes.

Opticaltweezer:

SophieDumontetal.Nature.RNAtranslocationandunwindingmechanismof

HCVNS3helicaseanditscoordinationbyATP

《生物信息学应用技术》，主编王禄山，高培基等。

课后作业B

1.简述普通超薄切片的样品制备过程及注意事项。

答：

超薄切片的步骤包括：

（1）取材和固定；

（2）脱水和渗透；（3）包埋和聚合；（4）定位与修块；（5）切片；（6）染色；（7）观察。

注意事项：

（1）取材时要做到四个字，即准、快、轻、优。

准：

准确窃取所有部分的横切面和纵切面，为切片打好基础。

快：

取材操作要迅速，尽快投入固定过程，以免材料变质。

轻：

取材操作要轻切、轻压、轻捏，刀片要锋利而且清洁，减少损伤和污染。

优：

选取优质材料，使用新鲜、优质的固定液和取材工具。

所取组织的体积要小，一般不超过1mm×1mm×1mm。

也可将组织修成1mm×1mm×2mm大小长条形。

因为固定剂的渗透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的固定。

（2）双重固定的操作：

取材—前固定—洗涤—后固定—洗涤—脱水。

洗涤是必须的过程，前固定后的洗涤目的是洗去还原性的前固定剂，以免减弱后固定剂的效力；后固定剂后的洗涤是为了防止后固定剂使洗脱剂氧化变黑，从而影响固定效果。

（3）选用不同固定剂需要注意的事项

戊二醛：

一般以磷酸缓冲液配制。

戊二醛是还原剂，不能与锇酸等氧化剂混用，也不能用醋酸巴比妥缓冲液配制。

最好在临用前配制，用棕色瓶盛，4℃冰箱中保存，固定12h以上可能出现赝像。

甲醛：

使用前新配，不宜久放。

一般使用2-4%的浓度，固定时间在30min到几小时内，固定温度以4℃为佳。

锇酸：

对于碳水化合物和核酸的固定能力不强。

因此常与醛类固定剂做双重固定，一般作后固定剂。

锇酸是剧毒品，连续吸入其蒸气0.5ug即可永久丧失嗅觉，对皮肤和黏膜都用刺激作用。

配制时需格外小心，戴好口罩、防护眼镜，在通风处配制，废液要密封后集中处置，不能乱倒。

（4）脱水时是将脱水剂配成不同的梯度浓度，逐级脱水。

系列脱水剂用蒸馏水或重蒸水配制即可，不需要再用缓冲液。

常用脱水剂：

乙醇和丙酮，甲醇、乙二醇、叔丁醇、聚乙二醇、环氧丙烷等也常使用。

（5）将未聚合的包埋剂完全引入浸润材料后，一高温或紫外线照射等条件处理，使之聚合硬化，制成能够营业进行切片的包埋块

（6）制备超薄切片要使用特制超薄切片机（大多是根据精密机械推进或金属热膨胀推进原理制成）和特殊的切片刀（用断裂的玻璃板制成的玻璃刀或用天然金刚石研磨而成的金刚石刀）。

先将树脂包埋块中含有生物材料的部分，用刀片在立体显微镜下修整成细小的金字塔形，再用超薄切片机切成厚度适中（500埃左右）的超薄片，切片应依次相互联接形成切片带。

切片带漂浮于装在切片机上的水槽中的水面上。

2.何谓超薄切片？

何谓半薄切片？

制作半薄切片有什么研究意义？

答：

超薄切片（ultrathinsection）：

用于透射电镜观察的极薄标本切片，厚约0.05μm。

通常标本用树脂包埋，用超薄切片机制备。

可用于TEM观察，进行一般超微结构、电镜细胞化学、免疫电镜、电镜放射自显影、x-射线微区元素分析等观察。

是由石蜡切片技术衍发而来，其主要技术原理和步骤都与石蜡切片的制作过程相似，只是对固定、包埋和染色药品、载片工具、切片机、刀具等进行了改进，使之达到固定相更加精细，包埋剂硬度更高、透明度更好等要求，以利于进行切片和观察。

半薄切片：

由于光镜切片可薄至0.5~2μm，故而又称半薄切片。

半薄切片（厚度0.6~0.8μm）的制备，在如今是一种常用制样手段。

由于半薄切片图像的清晰度、分辨率远优于石蜡切片，视野也大于超薄切片，所以有利于获得高质量的光镜图像。

同时，半薄切片，也是电镜超薄切片技术中一种有效的定位方法。

半薄切片被应用于各个方面，如，胚胎学，病理学，等等。

可算是应用广泛，是目前较为普遍的一种切片方式。

半薄切片制备中的一些关键技术如切片，捞片，脱脂，染色等也不同于石蜡切片和超薄切片，有其特点和难点。

3.常规电子染色有哪些主要方法、技术要点和注意事项？

电镜细胞化学染色与常规染色有什么不同？

常规电子染色方法：

电子显微镜主要是依赖散射电子成像，为了增强细胞结构的电子反差，需要对切片进行染色。

染色是依据各种细胞结构与染色剂（重金属盐）结合的选择性，而形成不同的对电子散射能力，从而产生借以区别各种结构的反差。

电子染色方法分块染色和切片染色两种：

①块染色法，在脱水剂中加入染色剂，在脱水过程中对组织块进行电子染色。

②切片染色法，最常用，即将载有切片的金属载网漂浮或浸没在染色液中染色。

也可使用有微处理机控制的染色机进行自动化染色。

一般切片染色所使用的染色剂为金属铀盐和铅盐的双重染色。

为显示某种特殊结构，则可采用与该结构有特异性结合的选择性染色剂。

负染色研究以蛋白质为主要成分的颗粒状材料的最常用方法。

以某些在电子束轰击下稳定而又不与蛋白质相结合的重金属盐类作为负染色剂，使之在支持膜上将颗粒材料包围，形成具有高电子散射能力的背景，衬托出低电子散射能力的颗粒的形态细节。

其所成的电子显微像的反差与常规电子染色相反，即暗的背景和亮的颗粒形态的所谓阴性反差。

负染色方法简便，所获得的颗粒的电子显微图像反差强，分辨率也高于超薄切片，可广泛用于研究蛋白质分子、细菌鞭毛、蛋白质结晶，以及生物膜及分离的细胞的细微结构，特别适用于蛋白质大分子及病毒颗粒结构的三维重建研究。

常用的负染色剂有醋酸铀、磷钨酸钠或磷钨酸钾、硅钨酸、铜酸铵及甲酸铀等。

用液滴法或喷雾法将颗粒材料的悬液加在载网的支持膜上，然后