生物化学与分子生物学技术实践.docx

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生物化学与分子生物学技术实践

【本讲教育信息】

一、教学内容

选修1 生物化学与分子生物学技术实践

【重点导学】

蛋白质的分离与纯化   从生物材料中提取某些特定成分  分子生物学进展与PCR技术

【全面突破】

知识点1 蛋白质的分离与纯化

1、蛋白质的分离

2、蛋白质的纯化方法

①透析法

蛋白质分子不能通过半透膜（肠衣、玻璃纸、动物膀胱膜等）的特性，可将待纯化的蛋白质溶液装入半透膜制成的透析袋内，再将透析袋放入透析液（缓冲液）中进行透析。

②离心沉淀法

控制离心速率，使得分子大小、密度不同的蛋白质发生沉降分层，从而达到分离出不同蛋白质的目的。

③凝胶色谱法

又叫分配色谱法。

是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。

所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体。

这些小球体大多数是由多糖类化合物（葡聚糖或琼脂等）构成的。

④电泳法：

带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。

支持物电泳是目前纯化蛋白质的一种较为普遍的方法。

支持物可以是滤纸、可以是醋酸纤维薄膜、大分子凝胶等。

采用醋酸纤维薄膜作为支持物具有方法简单、快速、分离清晰、灵敏度高、样品用量少、没有吸附、点样后区带界限清晰等优点，广泛应用于科学实验、临床化验和生化产品的分析（血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白等的分离与鉴定）等方面。

醋酸纤维薄膜点样的操作流程：

几点说明：

1）膜的预处理：

必须于电泳前将膜片浸泡于缓冲液中，浸透后，取出膜片并用滤纸吸去多余的缓冲液，不可吸得过干。

2）加样：

样品用量依样品浓度、本身性质、染色方法及检测方法等因素决定。

对血清蛋白质的常规电泳分析，每厘米加样线不超过2～3μL，相当于60～80μg的蛋白质。

3）电泳：

可在室温下进行。

电压为25V／cm，电流为0.4～0.8mA／cm。

4）染色：

一般蛋白质染色常使用氨基黑和丽春红，血浆蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸-Schiff试剂，脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色。

5）脱色与透明：

对水溶性染料应用最普遍的脱色剂是5％醋酸水溶液。

为了长期保存或进行光吸收扫描测定，可浸入冰醋酸：

无水乙醇=3：

7的透明液中。

【典型例题】

例1、回答有关蛋白质分离和纯化的问题

（1）要获得血清蛋白的粗制品，必须将含有柠檬酸钠的血液进行              处理，然后将                装入透析袋中除去                    。

（2）要获得血红蛋白，应如何破碎红细胞？

            。

（3）下图为血清蛋白通过醋酸纤维薄膜的电泳图谱，你认为含量最多的蛋白质是              ，含负电荷最多的球蛋白是            ，相对分子质量最大的球蛋白是                。

（4）电泳是目前应用最为普遍的          蛋白质的方法。

解析：

本题考查蛋白质分离和纯化的基础知识。

答案：

（1）离心   上清液   小分子物质   

（2）加蒸馏水使其胀破  （3）清蛋白 

-球蛋白  γ-球蛋白  （4）（分离）纯化

知识点2  从植物材料中提取某些特定成分

芳香油挥发性强、易溶于有机溶剂。

因此可以采用蒸馏法，萃取法、压榨法等进行提取。

1、蒸馏法：

植物芳香油提取的常用方法。

蒸馏法的类型

水中蒸馏

水上蒸馏

水汽蒸馏

特点

原料放在蒸馏容器的水中，水要完全浸没

原料

容器中水的上方有筛板，水量以沸腾时不浸润原料为宜

蒸馏容器下方有一个通气孔。

连接外源蒸汽，上方有筛板，上

面放有原料

玫瑰精油的提取流程：

2、萃取法

植物芳香油可以溶于有机溶剂（石油醚、酒精、乙醚、戊烷等）中，对于不适于蒸馏的原料可以采用萃取法。

大致方法是将干燥的植物粉碎，用有机溶剂浸泡后，芳香油就会溶解在溶剂中，然后蒸发掉有机溶剂就可以获得植物芳香油了。

胡萝卜素的提取操作流程

注意事项：

使用较高沸点的水不溶性有机溶剂作为萃取剂；在加热瓶口安装冷凝回流装置，防止有机溶剂加热挥发；有机溶剂要能从产品中完全除去，不会影响产品质量。

3、压榨法

对于有效成分，在用水汽蒸馏法时会发生部分水解，用水中蒸馏法会产生焦糊的植物材料，可以考虑用旋转滤膜蒸馏法或压榨法。

压榨法提取橘皮油的操作流程：

回顾与总结：

五种物质的提取方法、原理与步骤

提取物质

提取方法

提取原理

步骤

DNA

盐析法

①在不同浓度的氯化钠溶液中溶解度不同；

②不溶于酒精，但某些蛋白质则溶于酒精

①溶解在2mol/L的NaCl溶液中

②加水稀释至0.14mol/L的NaCl溶液使DNA析出、过滤

③加入冷酒精析出

血红蛋白

凝胶色谱

法

电泳法

①根据相对分子质量大小

②各种分子带电性质差异

①样品处理

②粗提取

③纯化

④纯度鉴定

玫瑰精油

水蒸气蒸

馏法

利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携

带出来

①水蒸气蒸馏

②分离油层

③除水过滤

橘皮精油

压榨法、

旋转滤膜

蒸馏法

通过机械加压、压榨出果皮中的芳香油

①石灰水浸泡、漂洗

②压榨、过滤、静置

③再次过滤

胡萝卜素

萃取法

使提取物溶解在有机溶剂中，蒸发后得到浓

缩物

①粉碎干燥

②萃取、过滤

③浓缩

【典型例题】

例2、请回答下列与实验室提取芳香油有关的问题：

（1）植物芳香油的提取可采用的方法有压榨法、_____和_____。

（2）芳香油溶解性的特点是不溶于_____，易溶于_____，因此可用_____作为提取剂来提取芳香油。

（3）橘子果实含有芳香油，通常可用_____作为材料来提取芳香油，而且提取时往往选用新鲜的材料，理由是                                   ___    __。

（4）对材料压榨后可得到糊状液体，为除去其中的固体物质获得乳状液可采用的方法是_____。

（5）得到的乳状液加入氯化钠并放置一段时间后，芳香油将分布于液体的_____层，原因是_____。

加入氯化钠的作用是_____。

（6）从乳状液中分离得到的芳香油中要加入无水硫酸钠，此试剂的作用是_____。

解析：

本题考查实验室提取芳香油的有关知识。

（1）植物芳香油的提取可采用的方法有压榨法、蒸馏法、萃取法.

（2）芳香油溶解性的特点是不溶于水，易溶于有机溶剂，因此可用有机溶剂作为提取剂来提取芳香油。

（3）一般采用新鲜的橘子皮来提取橘皮精油，因为新鲜的材料含有芳香油多（4）除去液体中的固体常用的方法是过滤。

（5）芳香油密度比水小，且不溶于水，会浮在液体的表面。

加入氯化钠会增加水层密度，使油和水分层。

（6）无水硫酸钠的作用是可以吸收芳香油中残留的水分。

答案：

（1）蒸馏法  萃取法     

（2）水   有机溶剂  有机溶剂  （3）橘子皮   芳香油含量较高 （4）过滤  （5）上    油层的密度比水层小   增加水层密度，使油和水分层  （6）吸收芳香油中残留的水分

知识点3 分子生物学技术

（一）分子生物学进展

1944年埃弗里实验验证DNA是遗传物质，1953年沃森和克里克创立DNA双螺旋结构模型，奠定了现代分子生物学的基础。

基因工程技术具有巨大的潜在价值，世界各国都十分重视该技术的发展，许多成果已经转化为生产力。

我国在生物技术方面已经取得了一系列突破性的进展，如许多诊断试剂盒的生产，以及转基因植物、转基因动物、转基因微生物的相继培育成功。

（二）PCR技术

1、PCR技术的原理及分析

（1）扩增方向：

为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基（-OH）末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端。

DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链，即DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸。

（2）热变性与退火

双链DNA在80～100℃条件下成为单链，称为变性，缓慢降温过程中能重新形成双螺旋结构，称为复性或退火，因此通过控制温度使双链DNA变性成为单链，快速降温使引物与单链结合，再迅速升高温度让子链延伸。

目前使用的PCR仪能自动控制和转换温度，并能设定循环次数。

（3）Taq聚合酶

Taq聚合酶是从一种水生嗜热菌yT1株中分离提取的。

yT1是一种嗜热真菌，能在70～75℃环境中生长，该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中发现的。

该酶的发现解决了高温使普通的DNA聚合酶失活的矛盾。

2、PCR扩增的过程

3、生物体内DNA复制与PCR反应的区别

体内DNA复制

PCR反应

解旋

解旋酶作用下，细胞提供能量，部分解开

加热至90℃，双链全部解开，不需解旋酶

引物

一小段RNA

单链DNA分子片段

合成子链

在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成

分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度72℃ 

特点

边解旋边复制，半保留复制

体外迅速扩增

Taq聚合酶

不需要 

需要

循环次数

受生物体自身控制

30多次

相同点

需要模板、四种脱氧核苷酸，且都需要在一定的缓冲溶液中进行

特别提醒：

①DNA母链的3’端对应着子链的5’端，即DNA的两条链是反向平行的。

②解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都可催化形成磷酸二酯键。

③DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3’羟基上，需要模板，而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。

④在PCR反应中，加入的四种脱氧核苷酸实际上是四种脱氧核苷三磷酸，既是原料，也是能源。

⑤在PCR反应中加入的Mg2+实际上是Taq聚合酶的激活剂。

4、PCR操作过程中的注意事项

（1）为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压灭菌。

（2）所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃下储存。

（3）在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。

（4）EB是一种致癌物，在实验过程中要做好防护工作，如戴塑料膜防护手套；在紫外灯下观察时要戴上专用护眼镜。

5、PCR技术的应用

（1）医学上用该技术分析人的精液，对细菌、病毒感染进行早期诊断

（2）对单细胞中的DNA进行扩增，用于遗传病的基因诊断，并在此基础上进一步制备无突变的DNA片段供遗传病患者基因治疗时使用。

（3）法医学用来鉴别罪犯或进行亲子鉴定

（4）古生物学用此技术分析古生物化石样品，追溯其生存年代或迁徙踪迹

（5）在农业生物技术中，可运用此技术检测目的基因是否已经成功导入目标生物等。

【典型例题】

例3、在遗传病及刑侦破案中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。

据图回答相关问题：

（1）在相应的横线上写出引物Ⅱ，并在复制这一步骤中将引物Ⅱ置于合适的位置。

（2）在相应的横线上写出循环一次后生成的DNA分子。

（3）若将作为原料的四种脱氧核苷酸用32P标记，请分析循环一次后生成的DNA分子的特点：

                                     ，循环n次后生成的DNA分子中不含放射性的单链占总单链的比例为               。

（4）PCR反应过程的前提条件是        ，PCR技术利用DNA的         原理解决了这个问题。

（5）在对样品DNA进行分析的过程中发现，DNA掺杂着一些组蛋白，要去除这些组蛋白可加入的物质是                                             。

解析：

（1）DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3’端延伸DNA链，所以引物就提供了3’端，子链延伸方向为5’→3’，引物I与b链部分碱基互补，引物Ⅱ则与a链部分碱基互补，且连接到a链的3’端，故引物Ⅱ的结构为5’—G—A—OH，复制结果为：

5’—G—G……T—C—3’

HO—A—G—5’

（2）经过一次循环后，产生的两个DNA分子分别含有引物I和引物Ⅱ。

（3）由于作为原料的四种脱氧核苷酸被32P标记，所以新合成的子链均含有放射性，一次循环后的两个DNA各有一条链含32P，若复制n次，共产生子链2n×2，其中只有DNA母链不含32P，则其所占比例为2／（2n·2）=1／2n.

（4）DNA复制是以两条母链为模板，按照碱基互补配对原则进行的。

因此，首先要解旋，使两条母链的碱基暴露出来，才能按照碱基互补配对的原则把相应的碱基一个个地连接起来。

只有解旋后，再以母链为模板合成一小段引物，引物才起作用。

DNA分子在80℃～100℃的温度范围内变性，双链解开成单链，当温度慢慢降低时，又能重新结合形成双链。

（5）本题考查了DNA中杂质蛋白质的去除，利用酶的专一性，应加入蛋白酶。

答案：

（1）5’—G—A—OH

HO—A—G—5’

（3）每个DNA分子各有一条链含32P   1／2n

（4）DNA解旋   热变性

（5）蛋白酶

本讲小结：

超前思维

下一讲我们将复习必修1——细胞的化学组成

（一）元素及其化合物。

请大家做必要的预习。

【重点导学】

1、地球上存在的天然元素有     多种，各种元素的比例各不相同。

不同生物体内含有的元素           ，但是每种元素在生物体内的                却不同。

在组成生物体的元素中，                                 等元素占全部元素的98%。

2、如何理解生物界与非生物界的统一性与差异性？

3、组成细胞的化合物分为                  和                    两类。

4、水在不同生物体内及同一生物体的不同组织中的含量不同。

水在细胞内以   和   两种形式存在。

5、自由水的最重要的功能是                          ，另外还具有的功能是    

                                                                       。

6、结合水通过                  与                                  等物质结合在一起。

7、细胞内的结合水与自由水的比例越高，抵御不良环境的能力                    。

8、无机盐在细胞中大多以                 形式存在，少数以             形式存在。

9、细胞中的有机化合物包括                                           等。

有机物的基本骨架是       骨架，包括           、分支链状或环状结构。

10、糖类的组成元素是        ；糖类包括           、            、  ______

              等。

11、两个六碳单糖分子通过缩合，失去一分子水，形成的化合物叫             ，包括

              、               、                   。

12、蔗糖和淀粉遇碘液变蓝的是                ；蔗糖、淀粉、麦芽糖中，能与斐林试剂水浴加热条件下出现砖红色沉淀的是                    。

13、所有的单糖、除蔗糖外的二糖都是                。

14、鉴定还原糖的植物材料中，苹果、梨、葡萄可用于还原糖鉴定，而西红柿、甘蔗、甜菜根却不行，原因是什么？

15、脂质的组成元素主要是                  三种，部分脂质还包括             等元素。

16、脂质包括             、               、                 等，它们的共同特性是                        。

17、三种脂质的功能分别是什么？

【模拟试题】（答题时间：

20分钟）

*1、如图为一种核酸分析方法，请据图分析回答有关问题。

（1）被分析的材料应属于一条          链。

如果它存在另一条互补链，该互补链的碱基序列是                                。

（2）如果选择性断开的位置是碱基G，那么随机出现的被标记片段应有       种，在电泳带上被分离的显示位置应有     处，在泳动方向的最前端的片段是       序列段，与图示泳动位置相比，在同样电泳条件下该片段应位于①的       （填“上方”或“下方”）。

（3）应用上述原理分析了某种未知序列核酸的一条单链，结果如图所示，此结果说明，该核酸的此单链含     个核苷酸，其A：

T：

G：

C=            ，同时也可推断其碱基序列是：

                                 。

*2、阅读以下材料，完成相关问题：

从玫瑰花中提取出的玫瑰精油称为“液体黄金”，是世界香料工业不可取代的原料，多用于制造高级香水、化妆品等。

提取出的玫瑰精油不含有任何添加剂或化学原料，是纯天然的护肤品，具有极好的抗衰老和止痒作用，能够促进细胞再生、防止肌肤老化、抚平肌肤细纹，还具有使人放松、愉悦心情的功效。

玫瑰精油的化学性质稳定，难溶于水，易溶于有机溶剂，挥发性较强。

（1）根据材料中介绍的玫瑰精油的性质，要提取玫瑰精油可以用水中蒸馏法和     法提取，但一般采用水中蒸馏的方法，其原因是该法具有               的优点。

（2）某同学在实验中设计了如图所示装置提取玫瑰精油，指出该装置中的两个错误，并予以改正。

①错误1：

改正：

②错误2：

改正：

（3）对用上述装置接收到的乳浊液进行如下处理：

玫瑰油与水的混合物

分层

油层

无水玫瑰精油

较纯净的玫瑰精油。

试剂A是            ，试剂C是            ，装置B是            ，试剂C的作用是                    。

3.PCR技术是把某一DNA片段在实验条件下，合成许许多多相同片段的一种方法，利用这种技术能快速而特异的扩增任何要求的目的基因或DNA分子片外，“人类基因组计划”的研究中常用到这种技术。

请结合有关知识，回答有关此技术的一些问题：

⑴PCR技术能把某一DNA片段进行扩增，依据的原理是：

⑵在实验条件下，DNA分子进行扩增，除了所要扩增的DNA片段外，还需要           、和          、          等条件。

⑶某DNA片段有160个碱基，其中有腺嘌呤35个，若让该DNA分子扩增三次（即复制三次）至少需要腺嘌呤脱氧核苷酸和鸟嘌呤脱氧核苷酸的数目分别是         个和   

   个。

4、近十年来，PCR技术（多聚酶链式反应）成为分子生物学实验室里的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制（如图），在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。

（1）加热使DNA双链打开，这一步是打开      键，称为       ，在细胞中是在

        的作用下使此键断裂。

（2）当温度降低时，引物与模板            端结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最终合成2个DNA分子，此过程中加入四种脱氧核苷三磷酸的目的是          ，遵循的原则是           。

（3）PCR技术的必要条件，除了模板、原料、ATP、酶以外，至少还需要三个条件.即：

液体环境、适宜的                 和                      。

（4）PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可分为         、        、      三个步骤。

【试题答案】

1、

（1）DNA单 AGCATGCGTTCAAGTGCA

（2）4  4   TG   下方

（3）18   5：

4：

5：

4 AACGTAGGGTTACCCTGA

2、

（1）萃取 设备简单、成本低、易操作

（2）①温度计位置过低 温度计的液泡与蒸馏烧瓶的支管口下沿保持水平

②冷凝管进水口、出水口接错 冷凝管进水口在下，出水口在上，与蒸汽流向相反

（3）NaCl 无水Na2SO4 分液漏斗   吸去油层中的少量水分

3、⑴DNA分子具有双螺旋结构和DNA分子中碱基的互补配对

⑵四种脱氧核苷酸、能量、酶   ⑶245、315

4、

（1）氢   解旋   解旋酶   

（2）3’ 既是原料，又能提供能量  碱基互补配对原则

（3）温度   酸碱度（4）变性、退火和延伸