聚合链变酶基础知识.docx

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聚合链变酶基础知识

聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction），简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。

可看作生物体外的特殊DNA复制。

概述

PCR原理

1PCR反应体系与反应条件1.标准的PCR反应体系

12、PCR引物设计

13、模板的制备

14、PCR反应条件的控制

1PCR的循环参数1、预变性（Initialdenaturation）

12、循环中的变性步骤

13、引物退火（Primerannealing）

14、引物延伸

15、循环数

16、最后延伸

1PCR步骤1.DNA变性

12.退火

13.延伸

PCR检测

1PCR反应特点特异性强

1灵敏度高

1简便、快速

1对标本的纯度要求低

PCR仪器

PCR常见问题

1PCR实验室的建立方法1、实验室布局

12、设置标准

概述

PCR原理

1PCR反应体系与反应条件

11.标准的PCR反应体系

12、PCR引物设计

13、模板的制备

14、PCR反应条件的控制

1PCR的循环参数

11、预变性（Initialdenaturation）

12、循环中的变性步骤

13、引物退火（Primerannealing）

14、引物延伸

15、循环数

16、最后延伸

1PCR步骤

11.DNA变性

12.退火

13.延伸

PCR检测

1PCR反应特点特异性强

1灵敏度高

1简便、快速

1对标本的纯度要求低

PCR仪器

PCR常见问题

PCR实验室的建立方法

1、实验室布局

2、设置标准

概述

　　DNA聚合酶（DNApolymeraseI）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow　　fragmentofE.Coli则是于70年代的初期由Dr.H.Klenow所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性，因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。

现今所使用的酶（简称Taqpolymerase）,则是

聚合酶链式反应示意图

[1]

于1976年从温泉中的细菌（Thermusaquaticus）分离出来的。

它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。

PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由Dr.KjellKleppe提出。

他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。

而现今所发展出来的PCR则于1983由Dr.KaryB.Mullis发展出的，Dr.Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。

Dr.Mullis并于1985年与Saiki等人正式发表了第一篇相关的论文。

此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。

随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。

Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。

PCR原理

　　DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。

双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。

在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。

因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

　　但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。

　　发现耐热DNA聚合酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大

taq酶

[2]

量应用，并逐步应用于临床。

　　PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：

模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

PCR反应体系与反应条件

1.标准的PCR反应体系

10×扩增缓冲液

10μl

4种dNTP混合物

200μl

引物

10～100μl

模板DNA

0.1～2μg

TaqDNA聚合酶

2.5μl

Mg2+

1.5mmol/L

加双或三蒸水

100μl

　　PCR反应五要素：

参加PCR反应的物质主要有五种即：

　　引物（PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。

　　引物有多种设计方法，与PCR在实验中的目的决定。

但基本原则相同

PCRY

[3]

PCR所用的酶主要有两种来源：

Taq和Pfu。

分别来自两种不同的噬热菌。

其中Taq扩增效率高但易发生错配。

Pfu扩增效率弱但有纠错功能。

所以实际使用时根据需要必须做不同的选择　　模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制　　缓冲液的成分最为复杂，除水外一般包括四个有效成分：

缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；辅助成分，常见的有DMSO、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA接触缠绕结构

2、PCR引物设计

　　PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。

设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

　　引物设计的基本原则　　①引物长度：

15-30bp，常用为20bp左右。

　　②引物碱基：

G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。

ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

　　③引物内部不应出现互补序列。

　　④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3′端的互补重叠。

　　⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

　　⑥引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。

　　⑦引物的5′端可以修饰。

如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

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3、模板的制备

　　PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。

　　模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。

也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。

法医学标本有血斑、精斑、毛发等。

　　标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。

多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。

难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。

所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。

4、PCR反应条件的控制

　　①PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子

关于PCR反应条件控制

[4]

②镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L　　③底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制，20～200umol/L　　④TaqDNA聚合酶2.5U（100ul）　　⑤引物浓度一般为0.1～0.5umol/L　　⑥反应温度和循环次数　　变性温度和时间95℃，30s　　退火温度和时间低于引物Tm值5℃左右，一般在45～55℃　　延伸温度和时间72℃，1min/kb（10kb内）　　Tm值=4（G+C）+2（A+T）　　循环次数:

一般为25～30次。

循环数决定PCR扩增的产量。

模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的扩增量。

但循环数并不是可以无限增加的。

一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。

PCR的循环参数

1、预变性（Initialdenaturation）

　　模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。

2、循环中的变性步骤

　　循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间　　变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。

3、引物退火（Primerannealing）

　　退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。

然后在此次实验基础上做出预估。

　　退火温度对PCR的特异性有较大影响。

4、引物延伸

　　引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。

但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略　　延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。

5、循环数

　　大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。

6、最后延伸

　　在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。

　　（四）PCR中的污染和假阳性　　PCR中污染主要来自　　1．样品间交叉污染；　　2．先前PCR产物遗留（carry-over）

PCR步骤

　　标准的PCR过程分为三步：

1.DNA变性

　　（90℃-96℃）：

双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA

2.退火

　　（25℃-65℃）：

系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3.延伸

　　（70℃-75℃）：

在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。

　　每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。

如图所示：

　　现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

PCR检测

　　PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。

荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是最常用的检测手段。

电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。

但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。

近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。

PCR反应特点

特异性强

聚合酶链式反应

PCR反应的特异性决定因素为：

　　①引物与模板DNA特异正确的结合；　　②碱基配对原则；　　③TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；　　④靶基因的特异性与保守性。

　　其中引物与模板的正确结合是关键。

引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。

聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。

再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。

灵敏度高

　　PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=-6）水平。

能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。

简便、快速

　　PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4小时完成扩增反应。

扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。

对标本的纯度要求低

　　不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。

可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。

PCR仪器

　　pcr仪器的发展pcr温度循环至关重要，pcr扩增仪各参数必须准确。

自perk

pcr仪

[5]

in–elmercetus公司第一台pcr扩增仪问世以来，现已有几十家不同的厂家在国内外生产和销售pcr扩增仪。

在短短的几年间，扩增仪经过几代的发展，不断采用新技术，并且进一步朝方便、实用、高智能化和自动化的方向发展。

　　为了便于了解和选购适宜的pcr实验设备，现将部分国内外pcr扩增仪列表如下；这些仪器主要用变温铝块、变温水浴及变温气流的方式达到热循环的目的，各有其优缺点。

国产1109型dna扩增仪则是用恒温浴机械手移位式。

更接近于手工操作。

ptc-51a/b体积小，智能化与自动化程序高，可以兼做套式pcr，方便实用。

以上各种仪器一般都配有微电脑自动控制温度、时间及循环数，可以达到节省劳动力的目的。

在采用这些仪器作pcr试验之前，一般均应实测管内温度变化循环情况，以了解升、降温时管内因热传导造成的温度滞后情况和实际到达的最高、最低温度，用于修正设计的循环参数。

温度滞后受到所用eppendorf管材料、壁厚及形状（与铝块孔匹配程度）的影响，这对变温铝块式仪器影响更大些。

对于配用制冷机式半导体元件致冷的仪器，在使用低于室温的温度来保冷pcr反应后小管时，应注意冷凝水的问题，勿使流入仪器内浸湿半导体元件而损坏仪器。

　　国内外生产的几种dna扩增仪　　1109型　　北京新技术所与军科院联合　　机械臂　　变温水浴　　电子调温　　40×0.5ml　　16400元/台　　90a/b型　　中科院遗传所　　机械臂　　变温水浴　　电热　　14000元/台　　ptc-51a/b型　　军事医学科学院　　变温气流　　电子调兼作套式　　30×0.5ml　　12000元/台　　dnathermalcycler　　perkin–elmercetus（美）　　变温铝块　　压缩机致冷　　48×0.5ml　　us$20000.-　　thermocycler　　#60　　#00　　#180　　b..braun　　biotech　　（德）　　变温水浴98℃四档　　电热，自来水冷却　　60×1.5ml　　100×1.5ml　　180×1.5ml　　dm30000.-　　automatictemperaturecy-clersingleblocktwinblock　　ericompinc.（美）　　变温铝块25～100℃　　电热,自来水冷却　　29×1.5ml　　58×1.5ml　　us$4985.-　　us$7980.-　　grantautogen　　grantinstrumantltd（美）　　变温水浴0～99℃　　电热，自来水冷却或加冷循环器　　50×1.5ml　　or　　50×1.5ml　　us$250.–plus　　us$15.-for　　rack（x2）　　technephc-1　　phc-2　　techneltd.（英）　　变温铝块0～99℃三档　　电热500w水冷100w　　54×0.5ml　　54×0.5ml　　24×1.5ml　　￡3383.–　　￡3997.-　　biooven　　biothrmcorp（美）　　变温气流　　-150℃　　115v11a　　200’sof4×96plate　　us$2990.-　　trio-thermo-blocktb-1　　biomertra（德）半导体变温　　220v　　3×20管　　分别控温　　dm12900.-　　microcyclere　　eppendorf（美）变温铝块　　220v/100v　　3×29管　　us$3500.-

PCR常见问题

　　PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。

　　假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及溴乙锭的使用，④PCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

　　模板：

①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

⑤模板核酸变性不彻底。

在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

电泳检测

[6]

阴性。

需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

　　引物：

引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：

①选定一个好的引物合成单位。

②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。

如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

　　Mg2+浓度：

Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

　　反应体积的改变：

通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。

或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

　　物理原因：

变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。

　　靶序列变异：

如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

　　假阳性　　出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

　　引物设计不合适：

选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。

靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。

需重新设计引物。

　　靶序列或扩增产物的交叉污染：

这种污染有两种原因：

一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。

这种假阳性可用以下方法解决：

操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。

必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。

二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。

可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

　　出现非特异性扩增带　　PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

非特异性条带的出现，其原因：

一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。

二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。

其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

其对策有：

必要时重新设计引物。

减低酶量或调换另一来源的酶。

降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。

适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。

　　出现片状拖带或涂抹带　　PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。

其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。

其对策有：

减少酶量，或调换另一来源的酶。

②减少dNTP的浓度。

适当降低Mg2+浓度。

增加模板量，减少循环次数。

　　克隆PCR产物　　1）克隆PCR产物的最优条件是什么？

　　最佳插入片段：

载体比需实验确定。

1：

1（插入片段：

载体）常为最佳比，摩尔数比1：

8或8：

1也行。

应测定比值范围。

连接用5ul2X连接液，50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。

室温保温1小时，或4℃过夜。

在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。

室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4℃过夜。

　　2）PCR产物是否需要用凝胶纯化？

　　如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。

如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。

少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。

为此需在克隆前做凝胶纯化。

　　3）如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？

　　A）涂布未转化的感受态细胞。

　　如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。

　　B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。

　　例如，将1ug/ul质粒1:

100稀释，1ul用于100ul感受态细胞转化。

用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。

培养过夜，产生1000个菌落。

转化率为：

产生菌落的总数/铺板DNA的总量。

　　铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。

具体而言转化用10ngDNA，用SOC稀释到1000u后含10ngDNA，用1/10铺板，共用1ngDNA。

转化率为：

　　1000克隆X10（3次方）ng/铺板1ngDNAug=10（6次方）cfu/ug　　转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ug感受态细胞　　如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。

　　C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生>20-40蓝斑（用指定步骤1