微生物检查方法验证管理程序.docx

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微生物检查方法验证管理程序

微生物检查方法验证管理程序

ManagementProcedureofMethodValidationforMicrobiologicalMethod

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1目的

参照CP2010版附录，以及现行版USP和EP要求，建立微生物检查方法的验证，以确保在实际检验条件下，该微生物检测方法的适用性。

2适用范围

在确定新产品的微生物学检验时或开发新的微生物检测方法（微生物限度检查法，无菌检查法和控制菌检查法，或当产品的组分、或试验条件（包括培养条件）发生变更时，或实验室出于各种原因如成本，生产量，快速简便及提高药品质量等需要而采用非药典规定的检验方法（即替代方法）时，都必须对新方法加以验证，以确保在实际检验条件下，药品微生物检测方法的准确性、有效性和重现性。

3定义和术语

3.1药品微生物检验方法类型：

主要分定性试验和定量试验。

定性试验就是测定样品中是否存在活的微生物，如控制菌检查及控制菌检查。

定量试验就是测定样品中存在的微生物数量，如菌落计数试验等。

3.2微生物限度检查法：

检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。

检查项目包括细菌数（TAMC），霉菌及酵母菌数（TYMC）和控制菌检查。

3.3无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品，医疗器具，原料，辅料及其他品种是否无菌的一种方法。

3.4抗生素微生物检定法，系指在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。

该方法包括管碟法和浊度法。

4责任

APIQC：

确保根据此程序对建立产品的微生物限度检查法，无菌检查法，微生物效价检查法。

5EHS要求

在操作过程中，分析员必须严格遵守既定的实验室和实验人员防止传染的安全防护措施规程，采取有效的预防措施进行自我保护。

为防止污染和交叉污染，所有的意外情况，如菌种泄漏或人员受伤，分析员都必须立即向微生物室主管或上级领导报告以便得到及时解决。

实验完成后应消毒实验进行的区域，所有接触过阳性菌的器具或物品必须经121℃，30min灭菌处理后方可清洗或弃去。

6程序

6.1Ch.P.细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证

6.1.1方法验证的要求：

验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。

对各试验菌的回收率应逐一进行验证。

并描述检测的试验条件包括试验用设施、设备、器具和材料、样品的预处理方式、试验操作程序、培养条件等。

6.1.2培养基使用前，应进行适用性检查见H3-AM-10006“Ch.P.微生物限度检查法”。

6.1.3供试液的制备见H3-AM-10006“Ch.P.微生物限度检查法”。

6.1.4细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证见H3-AM-10006“Ch.P.微生物限度检查法”。

6.2Ch.P.控制菌检查方法的验证

6.2.1方法验证的要求：

验证时，依各品种项下微生物限度标准中规定的控制菌选择相应验证的菌株，验证大肠菌群检查法时，采用大肠埃希菌作为验证菌株。

验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定和下列要求进行。

并描述检测的试验条件包括试验用设施、设备、器具和材料、样品的预处理方式、试验操作程序、培养条件等。

6.2.2培养基使用前，应进行适用性检查见H3-AM-10007“Ch.P.控制菌检查法”。

6.2.3控制菌检查方法的验证见H3-AM-10007“Ch.P.控制菌检查法”。

6.2.4验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。

6.3USP/EP细菌、霉菌及酵母菌计数（TAMC、TYMC）方法验证

6.3.1方法验证的要求

该方法用于在产品存在的情况下，能检测出微生物的方法，必须通过方法验证实验建立。

当测试方法或产品变更时，应重新建立方法的适用性。

并描述检测的试验条件包括试验用设施、设备、器具和材料、样品的预处理方式、试验操作程序、培养条件等。

使用培养基前，应先检查其灵敏性和无菌性。

6.3.2实验菌悬液的制备

用标准稳定的试验菌株悬浮液或按下述方法制备：

将微生物接种至一新鲜培养物上，每萌发一次即为一代。

因此，当原始菌种复溶并转至一培养基内生长，即认为已传代一次。

菌种的传代次数不得超过5代，以保证试验菌株的生物特性，试验菌株保存时，应采用适宜的保存技术，防止试验菌株发生变异。

按下表1的方法培养细菌和真菌。

用 pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液溶液制备菌悬液（或孢子悬液），在制备黑曲霉芽孢菌悬液时，可在缓冲液中加入0.05%聚山梨酯80。

菌悬液应在2小时内使用或2～8℃保藏24小时内使用。

对于具有稳定的孢子形态的黑曲霉和枯草芽孢杆菌，可以替代新鲜培养物稀释液，可使用孢子混悬液，孢子混悬液可在2～8℃保藏的经过验证的有效时间内使用。

表1

微生物

试验菌株制备

样品存在的情况下计数方法的适应性

总需氧菌数

总霉菌和酵母菌数

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）

例如：

CMCC26003

或

ATCC6538

NCIMB9518

CIP4.83

NBRC13276

大豆酪蛋白琼脂或大豆酪蛋白肉汤

30～35℃

18～24h

大豆酪蛋白琼脂/MPN大豆蛋白肉汤

≤100CFU

30～35℃

≤3天

-

铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）

例如：

CMCC10104

或

ATCC9027

NCIMB8626

CIP82.118

NBRC13275

大豆酪蛋白琼脂或大豆酪蛋白肉汤

30～35℃

18～24h

大豆酪蛋白琼脂/MPN大豆酪蛋白肉汤

≤100CFU

30～35℃

≤3天

-

枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）

例如：

CMCC63501或

ATCC6633

NCIMB8054

CIP52.62

NBRC3134

大豆酪蛋白琼脂或大豆酪蛋白肉汤

30～35℃

18～24h

大豆酪蛋白琼脂/MPN大豆酪蛋白肉汤

≤100CFU

30～35℃

≤3天

-

白色念珠菌（Candidaalbicans）

例如：

CMCC98001

或

ATCC10231

NCPF3179

IP48.72

NBRC1594

沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤

20～25℃

2～3天

大豆酪蛋白琼脂

≤100CFU

30～35℃

≤5天

MPN：

不适用

沙氏葡萄糖琼脂

≤100CFU

20～25℃

≤5天

黑曲霉（Aspergillusniger）

例如：

CMCC98003

或

ATCC16404

IMI149007

IP1431.83

NBRC9455

沙氏葡萄糖琼脂20～25℃

5～7天或直到孢子大量形成

大豆酪蛋白琼脂

≤100CFU

30～35℃

≤5天

MPN：

不适用

沙氏葡萄糖琼脂

≤100CFU

20～25℃

≤5天

6.3.4培养基的促生长试验

见H3-AM-10008“USP/EP微生物限度检查法”。

6.3.5实验过程

验证试验至少应进行3次独立的平行试验（1批做3次或3批各1次），选择1批或3批样品，样品含菌量尽可能低，以避免本底干扰，对于表1中列举的每一种微生物，分别进行试验。

1）试验组

平皿法计数时，取试验用稀释级的供试液1ml和≤100CFU试验菌，分别注入平皿中，立即倾注大豆酪蛋白琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

薄膜过滤法计数时，取规定量试验用稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入≤100CFU试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。

如当产品采用中和方法时，在处理后加入≤100CFU试验菌。

2）菌液组

测定所加的试验菌数。

如当产品采用中和方法时，即指加入接种物，不接触中和剂。

3）供试品对照组

取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。

4）稀释剂对照组

若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊方法处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。

试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml供试液含≤100CFU，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。

6.3.6结果判断

在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌数回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均在50%~200%之间。

若试验组的菌数回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均在50%~200%之间，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率不在50%~200%之间，否则产品就有抑菌性，影响回收率，应变更其方法。

变更的方法包括：

1）增加稀释剂或培养基的量；2）稀释剂中加入中和剂；3）采用膜过滤法；4）综合上述3种方法。

另外若试验需要用两种试剂，如乳化剂和灭活剂或中和剂，还需证明两者混合后能相容并达到使用目的。

通过比较即可判断该浓度的中和剂或灭活剂是否适用。

常用中和剂和抑菌剂见H3-AM-10008“USP/EP微生物限度检查法”。

如果没有找到合适的中和方法，微生物达不到回收率，那么说明该产品不太可能被上述的微生物污染。

但是，也有可能样品仅对某些特定微生物具有抑制作用，而不抑制其他不包括试验菌株或其它非典型的微生物。

所以，应采用微生物能生长的更高稀释级进行试验，并执行特定的可被接受的标准。

试验组和稀释剂对照组的回收结果相似证明了中和剂的有效性，稀释剂对照组和菌液组的回收结果相似证明了中和剂无毒性。

验证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。

6.4USP/EP控制菌检查方法验证

6.4.1方法验证的要求

验证时，依各品种项下微生物限度标准中规定的控制菌选择相应验证的菌株，验证大肠菌群检查法时，采用大肠埃希菌作为验证菌株。

验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定和下列要求进行。

并描述检测的试验条件包括试验用设施、设备、器具和材料、样品的预处理方式、试验操作程序、培养条件等。

使用培养基前，应先检查其灵敏性和无菌性。

6.4.2菌液的制备见H3-AM-10009“USP/EP控制菌检查法”。

6.4.3培养基的促生长试验见H3-AM-10009“USP/EP控制菌检查法”。

6.4.4验证方法

取规定量供试液及≤100CFU试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。

当采用薄膜过滤法时，取规定量的供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。

1）试验组

取规定量供试液及≤100CFU试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。

当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。

按规定的培养温度及最短的时间培养。

2）阴性对照试验

取稀释剂10ml照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。

按规定的培养温度及最长的时间培养，阴性对照应无菌生长。

3）供试品组

除不加试验菌外，其他方法同试验组。

6.4.5各控制菌的检查法见H3-AM-10009“USP/EP控制菌检查法”。

6.5替代方法不同微生物检验类型验证

6.5.1定性试验的参数：

专属性，检测限，耐用性，重现性。

6.5.2定量试验的参数：

准确度，精密度，专属性，定量限，线性，范围，耐用性，重现性。

尽管替代方法的验证参数与药品质量标准分析方法验证参数有相似之处，但是其具体的内容是依据微生物检验特点而设立的。

替代方法验证的实验结果需进行统计分析，当替代方法属于定性检验时，一般采取非参数的统计技术；当替代方法属于定量检验时，需要采用参数统计技术进行微生物替代方法的验证时，若替代方法只是针对药典方法中的某一环节进行技术修改，此时验证的对象仅是该项替代技术而不是整个检验方法。

如无菌试验若改为使用含培养基的过滤器，然后通过适宜的技术确认活的微生物存在，那么验证时仅需验证所用的微生物回收系统而不是整个无菌试验方法。

6.5.3替代方法验证的一般要求

在开展替代方法对样品检验的适用性验证前，有必要对替代方法有一个全面的了解。

首先，所选用的替代方法应具备必要的方法适用性证据，表明在不含一样品的情况下，替代方法在不同类型的微生物检验中所具有的专属性，精密度和检测限等参数。

使用者在基本确认方法的适用性后，应采用样品按表规定的参数逐一进行验证，以确定替代方法可用于该样品的检验。

验证至少使用2个批号的样品，每批样品应平行进行至少3次独立实验。

在参数验证时，涉及到的菌种除应包括微生物限度检查法和无菌检查法中培养基适用性检查规定的菌株外，还应根据替代方法及样品的特点增加相应的菌株。

各菌种应分别验证。

6.5.4样品中微生物定性检验方法的验证

6.5.4.1专属性

微生物定性检验的专属性是指检测样品中可能存在的特定微生物种类的能力。

当替代方法以微生物生长为判断微生物是否存在时，其专属性验证时应确认所用培养基的促生长试验，还应考虑样品的存在对检验结果的影响。

当替代方法不是以微生物生长作为判断指标时，其专属性验证应确认检测中的外来成分不得不干扰试验而影响结果，如确认样品的存在不会对检验结果造成影响。

采用替代方法进行控制菌的检验，还应选择与控制菌具有类似的菌株作为验证对象。

6.5.4.2检测限

微生物定性检验的检测限是指在替代方法设定的检验条件下，样品中能被检出的微生物的最低数量。

由于微生物所具有的特殊性质，检测限是指稀释或培养之前初始样品所含的微生物数量，而不是指检验过程中某一环节的供试液中所含的微生物数量。

例如，微生物限度检查中规定不得检出沙门菌，对检测限而言，是指每10g样品中能被检出的沙门菌的最低数量。

检测限确定的方法是在样品中接种较低浓度的试验菌（每单位不超过5cfu），然后分别采用药典方法和替代方法对该试验菌进行检验，以检出与否比较两种方法的差异。

试验菌的接种量须根据试验而定，以接种后采用药典的方法50%的样品可检出该试验菌为宜。

检测限验证至少应重复进行5次。

对于同一种试验菌，可采用卡方检验（X2）来评价两种方法的检测限存在的差异。

6.5.4.3重现性

微生物定性检验的重现性是指相同的样品在正常的实验条件（如实验地点，实验人员，仪器，试剂的批次等）发生变化时，所得检验结果的精密度。

重现性可视为微生物检验方法在检验结果上抵抗环境变化的能力。

方法使用者应优先测定该验证参数。

在样品中接种一定数量的实验菌（接种量应在检测限以上）。

采用药典方法和替代方法，分别由不同人员，不同时间，不同的试剂（或仪器）进行检验，采用卡方检验（X2）来评价两种方法的重现性存在的差异。

验证过程中应关注样品的一致性。

6.5.4.4耐用性

耐用性定性检验是指当方法参数有小的刻意变化时，检验结果不受影响的能力，为方法正常使用时的可靠性提供依据。

方法使用者应优先测定该验证参数。

与药典方法比较，若替代方法检验条件较为苛刻，则应在方法中加以说明。

替代方法与药典方法的耐用性比较不是必须的，但应单独对替代方法的耐用性进行评价，以便使用者了解方法的关键操作点。

6.5.5样品中微生物定量检验方法的验证

微生物定量检验一般都涉及菌落计数。

对计数结果进行数据处理时通常需要使用统计的方法。

由于菌落计数服从泊松分布，因此采用泊松分布的统计方法对菌落计数的数据处理优于采用正态分布的统计方法。

检验者往往采用正态分布的统计方法，因此也可以采用对数的转换和平方根加1的方法将原始数据转换为正态分布数据后在进行统计分析。

两种方法都适用于微生物数据的统计分析。

6.5.5.1准确度

微生物定量检验的准确度是指替代方法的检验结果与药典检验结果一致的程度。

准确度的确认应在检测的范围内，通常用微生物的回收率来表示。

检测范围内的准确度都应符合要求，准确度验证的方法是：

制备试验菌的菌悬液，菌悬液的浓度为应能准确计数的最高浓度，然后系列稀释至较低浓度（如小于10cfu/ml）。

例如，菌落计数平皿法的替代方法，在制备高浓度的菌悬液时，其浓度可以是103cfu/ml，并系列稀释至100cfu/ml。

每个试验菌应至少选择5个菌浓度进行菌浓度准确度确认，替代方法的体验结果不得少于药典检验方结果的70%，也可以采用合适的统计学方法表明替代方法的回收率至少与药典方法一致。

当替代方法的回收率高于药典时，有必要结合专属性项下的有关内容对准确度进行评价。

6.5.5.2精密度

微生物定量检验的精密度是指在检测范围内，对同一均匀的样品多次重复采样，测定其结果的一致程度，通常采用标准偏差或相对标准偏差来表示，也可以采用其他适宜的方式。

精密度验证方法：

制备试验菌的菌悬液，菌悬液的浓度为应能准确计数的最高浓度，然后系列稀释至较低浓度（如小于10cfu/ml）。

每个试验菌应至少选择5个菌浓度进行检验。

每一个浓度至少进行10次重复检验，以便能够采用统计分析方法得到标准偏差或相对标准偏差。

一般情况下，可接受的相对标准偏差的不大于35%。

不考虑特殊的检验结果，替代方法的相对标准偏差应不大于药典方法。

例如菌落接受平皿法其可接受的相对标准偏差与含菌量的关系见下表：

Cfu/皿

预期RSD

＜10

＜35%

10~30

＜25%

30~300

＜15%

6.5.5.3专属性

微生物定量检验的专属性是指通过检测适宜的试验菌，以证明检验方法与设定目的相适应的能力。

例如，菌落计数法其设定目的在于检出一定数量的微生物，则其专属性验证应证明当样品中存在一定数量的试验菌时，通过平皿法检验，能够检出试验菌。

专属性验证时，应能够设计出可能使替代方法出现假阳性的实验模型来挑战替代方法，从而确认替代方法的适用性。

当替代方法不依赖微生物生长出菌落或出现浑浊就可以定量时（如不需要增菌或在1~50cfu范围内就可直接测定菌数的定量方法），以上验证方式就显得更为重要。

6.5.5.4定量限

微生物定量检验的定量限是指样品中能被准确定量测定的微生物最低数量。

由于无法得到含有已知微生物数量的实验样品，因此，在定量限验证时，应选择在检验范围内至少5个菌浓度，每个浓度重复取样测定不少于5次，替代方法的定量限不得大于药典方法。

需要注意，由于细菌计数和菌落数服从泊松分布，可能存在计数结果的误差，因此替代方法的定量限仅需证实在相近低限度下其灵敏度至少相当于药典方法。

定量限验证的方法是，在检测范围的低限制备5份不同含菌浓度的菌悬液，每份菌悬液分别用药典的方法和替代方法进行不少于5次检验，采用统计方法比较替代方法的检验结果与药典方法结果的差异，从而评价替代方法的定量限。

6.5.5.5线性

微生物定量检验的线性是指在一定范围内，检验结果与样品中微生物数量成比例关系的程度。

线性验证时必须覆盖能够准确测定的所有浓度范围。

每株实验菌应选择至少5个浓度，每个浓度至少测定5次。

根据以上实验数据，以检验结果为应变量，以样品中微生物的预期数量为自变量进行线性回归分析，计算相关系数r。

当相关系数不能准确评估线性时，只能确定简单大约的关系值。

替代方法的相关系数不得低于0.95。

6.5.5.6范围

微生物定量检验的范围是指能够达到一定的准确度，精密度和线性，检验方法适用的高低限浓度或数量的区间。

6.5.5.7重现性

微生物定量检验的重现性是指相同的样品在正常的实验室条件（如实验地点，实验人员，仪器，试剂的批次等）发生变化时，所得检验结果的精密度。

重现性可视为微生物检验方法在检验结果上抵抗操作和环境变化的能力。

方法使用者应优先测定验证参数。

在样品中接种一定数量的试验菌（接种量应在定量限上），采用药典方法和替代方法，分布由不同人员，不同试剂，使用不同试剂或仪器进行检验，对检验结果进行统计分析，以相对标准偏差RSD来评价两种方法的重现性差异。

验证过程中，应关注样品的一致性。

6.5.5.8耐用性

微生物定量检验的耐用性是指当方法参数有小的刻意变化时，检验结果不受影响的能力，为方法正确使用时的可靠性提供依据。

方法使用者应优先测定验证参数。

与药典方法比较，若替代方法检验条件较为苛刻，则应在方法中加以说明。

替代方法和药典方法的耐用性比较不是必须的，但应单独对替代方法的耐用性进行评估，以便使用者了解方法的关键操作点。

6.6无菌方法验证

6.6.1验证要求

当建立产品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查。

若该产品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。

验证时，按H3-AM-10017“无菌检查法（CH.P/CVP）”和H3-AM-10018“USP/EP/JP无菌检查法”中供试品无菌检查的规定要求进行操作。

对每一试验菌应逐一进行验证。

6.6.2菌种及菌液制备按H3-AM-10017“无菌检查法（CH.P/CVP）”和H3-AM-10018“USP/EP/JP无菌检查法”中的规定要求进行操作。

6.6.3培养基的促生长试验见H3-AM-10048“培养基配制及适用性检查方法”。

6.6.4薄膜过滤法

取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，过滤。

取出滤膜接种至相应的培养基中，或将培养基加至滤筒内。

另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。

置规定温度培养3~5天。

各试验菌同法操作。

6.6.5直接接种法

6.6.5.1CP方法：

取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管；取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2管；分别接入每支培养基规定的供试品接种量，另1管作为对照，置规定的温度培养3~5天。

6.6.5.2USP/EP/JP方法：

取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基6管，分别接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2管；取符合直接接种法培养基用量要求的大豆酪蛋白消化物培养基6管，分别接入小于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管；分别接入每支培养基规定的供试品接种量，另1管作为对照，置规定的温度培养3~5天。

6.6.6结果判断

与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检验方法和检查条件进行供试品的无菌检查。

如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，应采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证试验。

方法验证试验也可与供试品的无菌检查同时进行。

6.7验证管理

6.7.1验证前首先应进行方法的优化工作，基本上确定分析方法后再进行验证。

6.7.2实验人员需经受相关培训（