木瓜蛋白酶在啤酒中的应用.docx
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木瓜蛋白酶在啤酒中的应用
木瓜蛋白酶在啤酒澄清中的应用
学号姓名
专业、班级2011级生物技术专业班组
学院生命科学与工程学院
实验课程名称《酶工程实验》
开课学期2013至2014学年二学期
填写时间2014年06月02日
木瓜蛋白酶在啤酒澄清中的应用
一、实验目的
1、理解蛋白酶澄清啤酒的原理。
2、学会蛋白酶澄清啤酒的关键技术。
3、能够发现影响啤酒澄清的主要问题（因素），找出解决的途径，确定最佳的澄清工艺。
二、实验原理
①啤酒是以大麦为主料，以大米等淀粉质原料为辅料，麦芽及辅料经糖化发酵而成的酒精饮料。
啤酒生产时，淀粉质原料不能直接被微生物利用，需水解成可发酵性的小分子。
②啤酒在贮存过程中，由于环境条件的作用，如光照、氧气、震动等，会产生浑浊、沉淀等现象。
此类浑浊的形成，和啤酒中残留的蛋白质关系密切，严重影响啤酒的质量和在市场上的竞争力。
添加蛋白酶可分解啤酒中的大分子蛋白质，可有效去除啤酒中的沉淀物。
另外，麦芽汁中的蛋白质组分，可被蛋白酶水解，提供啤酒酵母发酵过程中需要的氮源。
在啤酒澄清过程中，主要用到木瓜蛋白酶、生姜蛋白酶。
本实验采用木瓜蛋白酶消除啤酒浑浊。
③木瓜蛋白酶是从双子叶植物番木瓜（CaricapapayaL.）的果乳中提取出来的植物蛋白酶,具有耐高温、活性强、稳定性好、对pH变化和金属离子不敏感的特性;它的作用底物包括各种蛋白质,如明胶、谷蛋白、酪蛋白、弹性蛋白、球蛋白和肌纤维蛋白,且该酶是100%纯天然产物。
因此,将其用于对冷冻贮存过程中的啤酒进行处理,能水解啤酒内的蛋白质,而且还能部分水解一些已形成的复合物,产生更多的多肽或氨基酸,保证啤酒在冷冻贮存过程中的高清晰度;同时,也能改善啤酒的口感及原有多肽和氨基酸的组成和比例,从而有效地改良啤酒的品质。
④木瓜蛋白酶可水解啤酒中的各种蛋白质。
将其用于处于冷冻贮存过程的啤酒中，能水解啤酒中的蛋白质，生成更多的多肽或氨基酸，保证啤酒在冷冻贮存过程中的高澄清度，增加啤酒的泡沫，也能改善啤酒的口感，提高了啤酒泡沫覆盖度，氨基酸含量均有不同程度的增加，从而提高了啤酒的营养价值。
⑤啤酒澄清度即啤酒蛋白含量与其透光度有一定的关系，在660nm波长可由分光光度计测定其透光度T的变化来反映啤酒蛋白含量的变化，从而反映出木瓜蛋白酶对啤酒中蛋白质水解的情况。
三、实验设备及材料
木瓜蛋白酶，啤酒，无菌水，酒精，具塞试管10支，试管架，10ml移液管1支，吸耳球，200ml三角瓶1个，50ml容量瓶，烧杯，滴管，酒精灯，移液枪，天平，分光光度计，超净工作台，水浴锅。
木瓜蛋白酶溶液的配制：
称取.0.05g木瓜蛋白酶用蒸馏水定容50ml。
四、实验方法及步骤
（1）木瓜蛋白酶用量对啤酒澄清效果的探究
取六个具塞试管，分别编号0、1、2、3、4、5，准确量取10mL同一发酵罐啤酒到六个试管中。
60℃水浴24h，测T值，T值最低的为此实验中最佳投加酶量m
编号
0
1
2
3
4
5
加料
10mL啤酒
10ml啤酒
20ｕL蛋白酶液
10mL啤酒+30ｕL蛋白酶液
10mL啤酒+40ｕL蛋白酶液
10mL啤酒+50ｕL蛋白酶液
10mL啤酒+60ｕL蛋白酶液
T值
（2）不同反应时间下木瓜蛋白酶对啤酒澄清效果的探究
根据步骤
（1）中的最适酶量加入到下表试管中，依据表中所示进行后续试验
编号
0
1
2
3
4
5
加料
10mL啤酒+40ul蛋白酶液
10ml啤酒
40ul蛋白酶液
10mL啤酒+40ul蛋白酶液
10mL啤酒+40ul蛋白酶液
10mL啤酒+40ul蛋白酶液
10mL啤酒+40ul蛋白酶液
温度（℃）
600
60
60
60
60
60
反应时间
16h
20h
24h
28h
32h
36h
T值
五、实验结果及分析
1、实验现象、数据及结果
溶液
T值
蒸馏水
100
酶液
27.8
原啤酒
66.9
0
66.9
1
68.6
2
69
3
71.1
4
64.3
5
63.3
时间
T值
16
67.1
20
70.6
24
71.7
28
75.3
32
81
36
81.5
2、对实验现象、实验结果的分析及其结论
（加酶量与澄清度T的关系图）
实验现象：
由于使用啤酒本身澄清度较高，故经过酶处理后澄清度用肉眼很难看到明显的变化，主要借助于T值得变化来分析实验。
由图中可以得出结论：
随着木瓜蛋白酶的加入量增多，啤酒的澄清度升高。
但超过一定量后其澄清度反而下降，可以得出加入的酶量过多影响了啤酒的澄清度。
（酶处理时间与澄清度关系图）
此图为酶处理时间对啤酒澄清度的影响，由实验数据得出上图，当加入的酶量为5ul/ml时，在32h之前T值处于上升趋势，超过32h后，T值处于平缓状态，故得出最佳处理时间为32h。
实验结论：
本实验所用啤酒澄清处理最佳工艺为：
酶加量4g/m3（10万U/g），最佳时间为32h。
本实验啤酒澄清最佳的工艺流程
3、实验总结
（1）成功之处：
本实验成功之处在于实验方案的设计思路较好，没有较大纰漏，能够较好地完成实验任务，并且对实际生产的指导意义较大（相对于测定最佳PH而言认为在实际应用中不可能去调节啤酒的PH值）。
（2）不足之处：
实验的不足之处在于实验条件并非实验室能够完全满足（某些试剂不全等），不得已使用澄清度才用了较为粗放的测定法，
（3）个人的自我评价：
在试验中主要参与设计实验和协调督促成员完成实验，对本实验能有较为全面的了解，但发现某些方面由于各种原因（主要是时间）会出现偶尔的懈怠，由于实验时间较长，会感到不耐烦或不认真做实验，使某些实验条件发生一些改变从而影响到实验的严谨性等。
（4）个人收获：
由于实验完全由组员合作设计，这锻炼了个人处理问题的能力，本实验对实际应用有较好地指导意义，在试验中也能较好的协调成员之间的协作。
六、思考题
1、影响木瓜蛋白酶活性的因素有哪些，如何提高木瓜蛋白酶的催化效率？
木瓜蛋白酶本身是一种蛋白质，凡是能够影响蛋白质活性的因素都可能是影响木瓜蛋白酶活性的因素，比如：
温度，PH值，重金属离子，溶剂等等因素。
为了提高酶的效率可以探究酶的最佳催化温度，用量及PH。
本实验中若探究PH值，如果最佳PH不是啤酒的自然PH，则需要调节PH，待反应结束后，即使恢复其啤酒的自然PH，也相当于向啤酒中加入了某种盐，对啤酒的口味会产生影响，故PH值只能在啤酒的自然PH值下催化。
另外为了提高酶的效率可以通过设计温度梯度和酶用量梯度探究酶的最佳催化参数。
除此之外还可以考虑采用固定化酶来提高酶的催化效率。
总之要在成本和效率之间权衡考虑。
2、除本实验用到的酶解法消除啤酒的浑浊外，生产中还有什么方法可消除啤酒中的浑浊？
啤酒浑浊的成因有很多，比如蛋白质引起浑浊，多酚引起的浑浊等等因素。
生产中可以采用微孔过滤，配合硅胶单宁对蛋白的吸附等方法。
七、参考文献
[1]许彦,张平.酶制剂在啤酒生产中的应用及原理[J].安徽农学通报,2013,19（09）:
42～43
[2]乙引,陈平,王茜,王明勇,柯波.木瓜蛋白酶改良啤酒品质的研究[J].贵州农业科学,2000,28（4）:
14～16.
[3]李海芹，李娜，刘毅等.啤酒混浊问题如何解决[J].中外食品,2006,7:
54～58.
[4]陈飞,吴生文,张志刚 蛋白酶在酒类生产中的应用现状[J]2010.37（6）9-11
一：
名词解释
现代发酵工程
种子的扩大培养
露点
底物亲和常数KS
比生长速率
代谢控制发酵
临界稀释率
二简答
发酵工业的发展历程
工业微生物育种的基本方法
空气除菌的方法及流程
发酵工业菌种应具备的条件
种子的扩大培养及影响种子质量的因素
发酵工业消除泡沫的方法
发酵生产中如何调节pH
发酵过程中溶解氧的控制方法及意义
谷氨酸发酵产量的影响因素及调控机制
从土壤中筛选一株高产淀粉酶的细菌，设计方案，重要操作步骤、鉴定思路
发酵工业污染的原因及防治策略
发酵工业培养基的基本要求，设计优化的一般过程
发酵工业菌种分离筛选、选育的步骤
温度、pH、溶解氧、泡沫等对发酵的影响及控制
钙调蛋白基因cDNA克隆及序列分析
一摘要
钙调蛋自是生物细胞内一种重要的调控蛋自，通过其与靶酶的相互作用，控制细胞正常的生长和发育。
从小麦叶片中提取总RNA,以OligoaT（lsbp）为引子合成cDNA第一链，以水稻钙调蛋白墓因两端的寡聚核替骏为引物，用PCR方法可以扩增小麦钙调蛋白基因。
酶切分析和测定DNA全序列，将该序列与几种植物的钙调蛋白基因作比较，同源性高达81.900-95.3%。
钙调蛋白基因的分离、克隆对于阐明钙调蛋白的作用机制和从分子水平上阐明植物对环境反应及其它重要生理过程的机制均有十分重要的意义，因而受到人们广泛重视。
迄今，已在甘蔗、水稻、玉米、马铃薯、碗豆、拟南芥等作物（植物）上克隆钙调蛋白基因或cDNA，[1]本实验以番茄为实验材料通过反转录来构建北方小麦cDNA文库，并扩增出小麦的钙调蛋白基因。
2、研究背景及意义
钙调蛋白（CaM）作为一种多功能的调节蛋白引起人们广泛的兴趣，对它的结构及功能表达的研究仍方兴未艾。
在人口激增的现时代，人们对粮食的需求量也剧增，钙调蛋白的研究对揭示钙调蛋白的结构和调节植物的功能代谢具有重大意义。
通过科学家近年不断的努力钙调蛋白的研究取得了重大进展，主要集中在1.CaM的三维结构2.CaM活化靶酶的分子模型
3.CaM调节的体系4.CaM拮抗剂研究5.CaZ+,CaM与疾病5大领域上。
三、可行性分析
1、由基因bank数据库中可以查找到某些部分的钙调蛋白基因序列，并且很大一部分的植物的钙调蛋白的基因同源性高达90%，[2]这给该基因的cDNA文库的构建提供了便利。
但是由于物种的不同，其核苷酸的微小差别都可能使引物出现错误而导致实验失败。
2、由于水稻的钙调蛋白基因的克隆已有报道，并且基因测序也已经完成，本实验选取了和水稻亲缘关系较近的小麦为实验材料通过PCR克隆出小麦的钙调蛋白基因并分析序列。
3、技术路线
小麦叶片全RNA的提取
逆转录cDNA第一链的合成
cDNA双链的合成
PCR扩增目的基因
（北方小麦钙调蛋白基因）
基因的序列分析
4实验方案
小麦叶片RNA的提取[3]
用异硫氰酸胍法提取。
剪碎一70℃保存的小麦叶片，加液氮研磨成粉状，加异硫氰酸孤溶液匀浆，水饱和酚，氯仿/异戊醇抽提，上清液用异丙醇沉淀，再用异硫氰酸胍溶液溶解，异丙醇沉淀，溶于无RNase的水中，65℃保温l0min后，乙醇沉淀，抽干，溶于DEPC处理过的水中，-70℃保存。
取15μl作RNA的甲醛变性电泳检查。
逆转录合成第一链cDNA
:
参考北京康为世纪公司cDNA第一链合成试剂盒上的方法，以小麦全RNA为模板，OligodT为引物，在逆转录酶的作用下合成cDNA的第一条链，一20℃保存备用。
步骤：
a将RNA模板、引物、dNTPMix.DTT.RTBuffer.HiFi-MMLV和RNase-FreeWater溶解并置于冰上备用。
b根据以下表格配制反应体系，总体积为20μl。
c涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
d420C孵育30-50分钟，850C孵育5分钟。
反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
e逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，或置于一20℃长期保存。
用PCR方法扩增小麦钙调蛋白基因:
参考已发表的水稻钙调蛋白基因序列（或者在NCBI搜索水稻钙调蛋白基因符号：
OsMSR2登录号：
Os01g0955100查询其基因序列，并利用primer3设计引物来扩增小麦钙调蛋白cDNA），人工合成两段分别含有26个和24个核普酸的寡聚核普酸作为引物，序列分别为:
5'端引物，5'--GGCATGGCGGATCCGCTCACCGACGA--3',3'端引物，5'--TCCCTAGGCCATCATGACCTTGAC-3'。
[4]以合成的cDNA第一条链为模板，加TaqDNAPolymerase合成。
反应为93℃变性30s,45C退火1min30s,700C延伸2min，共30个循环。
4℃保存。
（具体步骤可参考北京康为世纪公司的PCR试剂盒）
具体步骤如下：
反应体系的构建
PCR反应条件的控制
④目的基因的检测（凝胶电泳法检测）
参考文献
[1]张成,王喆之.丹参钙调蛋白cDNA的克隆及其反义表达载体的构建.分子植物育种[J],2006,4（3）:
339-344.
[2]岳海林,孟海军,邓秀新,彭抒昂.柑橘钙调蛋白cDNA的克隆及序列分析.园艺学报[J],200633（5）:
1075-1078.
[3]何水林,赖钟雄,官德义,郑金贵.辣椒钙调蛋白cDNA克隆.农业生物技术学报.2000,8
（2）:
151-154.
[4]刘芝华,吴相枉,潘乃徒,陈章良.水稻钙调蛋白基因的克隆及结构分析.生物工程学报,19939
（4）:
309-313.
[5]龚洁敏,金志强,孔德蓦,郑学勤.香蕉钙调蛋白基因的克隆及序列分析.1994.315
（1）65-71.
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