Clontech抑制性削减杂交PCR中文说明书.docx

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Clontech抑制性削减杂交PCR中文说明书

抑制性削减杂交PCR

削减杂交是一强有力的使研究人员能够比较两种mRNA群和获得仅在一mRNA群表达而在另一mRNA群没有表达克隆的强有力的技术。

虽然有几种不同的方法，但削减杂交背后的基本理论却非常简单。

首先，两组mRNA均转化为cDNA：

我们将含有特异（差异表达的）转录物称为“tester”,对照cDNA称为“driver”。

Tester和DrivercDNA进行杂交，接着去除杂交序列。

结果，保留的未杂交的cDNA就代表了那些仅在tester组表达，而在driver组不表达的mRNA。

虽然传统的减法杂交方法在某些研究中已成功运用，但要求几轮的杂交且也不适合鉴定稀有信息。

CLONTECHPCR-SelectcDNA削减杂交是唯一克服了传统减法杂交的这些缺点的方法。

图1表示PCR-Select过程的简短回顾。

本方法的几个特点使其具有高效和可重复性。

方法仅要求0.5--2gpolyA0+RNA，花3—4天时间，也不用分离ss和ds分子。

而且，抑制性PCR预防了不需要的扩增而使目标分子得到富集。

图2详细地描述了发生在PCR-SelectcDNA消减杂交分子事件。

首先，cDNA从0.5--2g的polyA+RNA合成。

Tester和drivercDNA以RsaⅠ酶切，该酶为一四碱基限制性内切酶，产生平末端。

TestercDNA接着分成两部分，每一部分连一不同的cDNAadaptor。

Adaptor的末端无磷酸基团，因此仅有adaptor的一链与cDNA5’末端相连。

两adaptor具有不同的序列，这样当残留末端被补平后就能够同两个不同的PCR引物退火（AppendixB）。

接着进行两轮杂交。

首先，过量的drivercDNA加入到每一tester样品，然后热变性和退火，在每一样品产生a、b、c和d分子（图2）。

由于杂交二级动力学的原因，高丰度分子退火快，因此高和低丰度序列在a型分子中的浓度趋于均衡。

同时，与在driver中没有差异表达的分子c型ss分子明显富集。

在第二次杂交期间，两第一次杂交的样品不经变性直接混合。

现在，仅有保持平衡的和消减的sstestercDNA能够重新配对形成新的e型杂交体。

这些新杂交体成为具有不同的dsDNA分子，分别为tester1（与adaptor1相连）和tester2（分别与adaptor2相连）。

将新变性的drivercDNA加入无需再次变性的已经第一次杂交反应的两混合物，进一步富集差异表达序列e型分子。

经DNA多聚酶补平末端后，e型分子—差异表达的tester序列—在5’和3’端具有不同的退火位点。

接着整个分子群进行PCR以扩增需要的差异表达序列。

在PCR中，a和d分子无引物退火位点，因而不能被扩增。

由于抑制性PCR效应，绝大多数b型分子形成盘状结构而阻止其指数扩增（AppendixA）。

c型分子仅有一个引物结合位点而仅能被线性扩增。

仅有e型分子，有两个不同adaptor，能被指数扩增，产生均衡的差异表达序列。

进而，进行第二次PCR扩增以进一步减少背景和富集差异表达序列。

此时，差异表达的cDNA就能直接插入T/A克隆载体（例，使用CLONTECH’sAdvanTAgePCRCloningKit,#k1901-1）或任何使用RsaⅠ位点作为adaptor/cDNA连接的载体。

然后，差异表达的RNA能被测序、杂交分析鉴定。

PCR混合物也可用作杂交探针进行DNA文库筛选。

PCR-Selectdifferentialscreening

获得消减cDNA文库后，重要的是确认代表差异表达基因的的单个克隆，ThisistypicallyaccomplishedbyprobingNorthernblotswithrandomlyselected,subtractedclones。

然而这既耗时又低效，尤其是关系很近的RNApopulations相互比较——消减文库中可能包含相当数量的假阳性。

在Northern杂交分析前利用消减文库的差异筛选有助于减少假阳性，节省时间和精力。

如果你的起始材料有限，你可以用CapFinderPCRcDNASynthesisKit（#k1052-1）预先扩增你的总RNA以用于PCR-SelectKit.当总RNA用常规方法合成cDNA时，即便是使用Oligo（dT）引物，核糖体RNA也会同polyA+RNA一起被反转录。

如果这种cDNA用于PCR-SelectKit，过量的核糖体RNA和低浓度的与PolyA+RNA相对应的cDNA浓度将导致无效减法杂交。

使用CapFinderPCRcDNASynthesisKit可直接用于PCR-Select

cDNA合成

tester和driverdscDNA从待比较的mRNA合成

RsaⅠ消化

Tester和drivercDNA分别消化以获得短的平末端分子 

Adaptor连接

试验组平分成两份，分别连上不同的adaptor,但drivercDNA无adaptor

第一次杂交

杂交动力学导致均衡和富集差异表达序列

第二次杂交

以产生用于PCR扩增模板的差异表达序列

第一次PCR扩增

使用抑制性PCR，仅差异表达的序列呈指数级扩增 

第二次PCR扩增

背景减少，不同表达的序列进一步富集

图1.CLONTECHPCR-Select过程的概况，含特异转录物cDNA称tester，对照称driver

消减杂交，即便是总RNA用作起始材料（注意：

使用CapFinderPCRcDNALibraryConstructionKitAK1051-1产生的擦与PCR-SelectKit并不相容。

）一旦你确定了差异表达cDNA，那么Marathon&tradecDNAAmplificationKit（#K1802-1）MarathonReady&tradecDNA可以提供优秀的克隆相应全长的方法（Chenchiketal.1996）。

欲求更多的信息，参阅相关产物的描述。

二、试剂成分表

RNA存于-70℃，储存4杂交液于室温。

其它储存于-20℃。

本试剂盒提供的足够7次cDNA合成的试剂。

每次反应最好使用2gpolyARNA，但也可少至0.5g。

但是，如果使用低于2g的polyARNA，在消减过程中，低丰度的差异cDNA可能丢失。

7次cDNA合成相当于6次完全的消减实验和1次对照。

如果每次合成用于不同实验的tester和driver（在特殊系统鉴定上调或下调cDNA），PCR试剂足够50次primary和100次secondaryPCR反应。

参阅附录B的primer和adaptor序列。

第一链的合成

*7lAMV反转录酶（20unites/l）

10lcDNA合成引物（10M）

200l5第一链缓冲液

250mMTris-HCl（pH8.3）

40mMMgCl2

150mMKCL

5mMDithiothreitol（DTT二硫苏糖醇）

第二链合成

*28l20第二链酶混合物

（DNA多聚酶1，6u/ul，RNaseH,0.25u/l,E.coliDNA连接酶，1.2u/l）

*200l5第二链缓冲液

500mMKCl

50mMAmmoniumSulfate（硫酸氨）

25mMMgCl2

0.75mM-NAD

100mMTris-HCl（pH7.5）

0.25mg/mlBSA牛血清白蛋白

*14lT4DNA多聚酶（3u/l）

内切酶消化

*200l10Rsa1限制缓冲液

100mMBisTrisPropane-HCl（pH7.0）

100mMMgCl2

1mMDTT

*12lRsa1（10u/l）

Adaptor连接

*21lT4DNA连接酶（400u/l;含3mMATP）

*30lAdaptor1（10M）

*30lAdaptor2（10M）

*200l5DNA连接缓冲液

250mMTris-HCl（pH7.8）

50mMMgCl2

10mMDTT

0.25mg//mlBSA

杂交

*200l4杂交缓冲液

*1.4ml稀释缓冲液（pH8.3）

20mMHEPES-HCl（PH6.6）

20mMNaCl

0.2mMEDTA（pH8.0）

PCR扩增

*50lPCR引物1（10M）

*100l巢氏PCR引物1（10lM）

*100l巢氏PCR引物2R（10M）

*10l质控消减cDNA

对照实验

*5l对照polyARNA（1ug/ul,来源于人骨骼肌）

*10l对照DNA（3lg/l）

（HaeⅢ-消化的细菌噬菌体x174DNA）

*50lG3PDH5’引物（10M）

*50lG3PDH3’引物（10M）

这些引物可以扩增人、大鼠、小鼠G3PDH

一般试剂

*20ldNTP*混合物

10mMeachdATP,dCTP,dGTP,dTTP

*100l20EDTA/glycogenmix

（0.2MEDTA;1mg/mlglycogen）

*400lNH4OAc（4M）

*1ml灭菌水

三、另外所需试剂

下面的试剂是需要的，但未提供

*Hae3消化的噬菌体X174（#6310-1，2）：

凝胶上DNAMarker用

*0.5mlPCR反应管，推荐Perkin-ElmerGeneAmp

*80%和96%乙醇

*酚：

氯仿：

异戊醇（25：

24：

1）。

按下配制：

1、 重蒸酚

2、 等体积灭菌TNE缓冲液平衡（50mMTris,Ph7.5,150mMNaCl,1mMEDTA）

3、 室温下2-3小时

4、 去除上层水相

5、 加入等体积氯仿：

异戊醇（24：

1），完全混合，去除上层相

6、 储存下层酚：

氯仿：

异戊醇于4℃，最多2周

*氯仿：

异戊醇（24：

1）

*50PCR酶混合物

推荐ClonTECH’AdvantageTMKlenTaqPolymeraseMix（#8417-1）

*10PCR缓冲液

*dNTP混合物（10mMdATP,dCTP,dGTP,dTTP）

*TAE电泳缓冲液

配制50储存液：

242gTris

57.1mlHac

37.2gNa2EDTA.2H2O

加水至1升

四、ClontechPCR-SelectcDNA消减步骤

A、 一般事项

*戴手套以防RNA和cDNA样品被核酸酶降解

*本手册的循环参数已使用Perkin-ElmerDNAThermalCycle480和Perkin-ElmerGeneAmpSystems2400/9600优化。

不同的循环仪可能需要不同的循环次数、50polymerase混合物和模板

*必须使用热启动以减少非特异DNA合成。

我们推荐TaqStartAntibody或人工热启动。

本步骤已用TaqStart抗体调号（包含在Clontech’sAdvantageKlenTaqPolymeraseMix中）

*悬浮沉淀和混合反应时，轻轻上下吹打，短暂离心以将成分沉于管底。

*用旋涡振荡酚：

氯仿抽提混合物

*向混合物中最后加酶，轻轻上下吹打以将酶和混合物混匀

*不要增加酶量和反应的DNA浓度。

量和浓度已优化好了。

*虽然不是要求的，推荐使用[-32P]dCTP进行第一链合成以定量产生的cDNA，确定DNA沉淀的效率，以利解决合成cDNA的困难。

C、 cDNA第一链的合成

使用tester、driver和对照polyARNA完成本操作。

本节得到的cDNA将作为以后步骤的对照cDNA。

在下节，将通过加入少量质控cDNA（Hae3-消化的X174）到骨骼肌dsDNA以制作模拟testercDNA。

用这些骨骼肌tester和drivercDNA与自己的消减实验平行作一完整的对照消减实验。

对照消减实验可用于估计合成的cDNA的产量和大小范围。

它也是证明实验的多步骤是否有效的最好办法。

1、 对每一实验，tester,driver和对照骨骼肌polyARNA，在一消毒的0.5ml离心管中混合下列成分（不要用聚苯乙烯管）：

polyARNA（2g）2-4l*

cDNA合成引物（10M）1l

*对于对照合成，加入2l骨骼肌polyARNA

如果需要，加入2l消毒水至终体积5l，混匀成分，短暂离心。

2、 在PCR仪中，70℃温育2分钟

3、 冰上冷却2分钟4、 短暂离心

5、 每反应管加入下列成分：

5第一链缓冲液2l

dNTPMix（10mMeach）1l

消毒水*1l

MMLV反转录酶（200u/l）1l

*为了监测cDNA合成的进展，将1l[-32P]dCTP（10mCi/ml,3000Ci/mmol）以9l水稀释，代替上面的水加入以标记

6、 轻轻振荡，短暂离心

7、 42℃，空气孵箱中1.5h

注：

不要用水浴或PCR仪。

蒸发可能减少反应混合物体积，减低反应效率。

8、 反应管置冰上以终止第一链合成并立即进入D节。

D、 cDNA第二链合成

使用每一第一链tester、driver和对照骨骼肌cDNA

1、 在第一链合成管中（含10l）加入预先冰上冷却的下列成分：

消毒水48.4l

5第二链合成缓冲液16.0l

dNTPMix（10mM）1.6l

20第二链酶混合物4.0l

2、 混匀并短暂离心，终体积应为80l

3、 16℃（水浴或PCR仪）孵育2小时

4、 加入2l（6u）T4DNA多聚酶，混匀

5、 16℃孵育30分钟（水浴或PCR仪）

6、 加入4l20EDTA/glycogen混合物以终止第二链合成

7、 加入100l酚、氯仿、异戊醇混合物（25:

24:

1）

8、 混匀，14000rpm10min,RT

9、 取上清于另一清洁0.5ml离心管

10、加入100l氯仿、异戊醇混合物（24：

1）

11、重复步骤8、9

12、加入05cytokinssuchasinterleukin-1,transforminggrowthfactor0.5vol4MNH4OAc和2.5vol（总体积的）95%乙醇

13、混匀，14000rpm20min,RT14、去上清

15、 如果使用[-32P]dCTP，用Geiger计数器检测沉淀放射性

16、 沉淀中加入500l80%乙醇

17、14000rpm10min去上清

18、如果使用[-32P]dCTP，用Geiger计数器检测沉淀放射性

19、空气中晾10分钟以蒸发残留乙醇

20、 50ldH2O溶解沉淀

21、取6l加入另一新干净离心管。

储存样品于-20℃直到Rsa1消化物琼脂糖凝胶电泳以估计产量和合成的cDNA大小（见V.A节）

E、 Rsa1消化

用每一实验dstester和drivercDNA，对照骨骼肌cDNA。

这一步产生短的、平末端dscDNA片段以供消减杂交和F节与adaptor连接。

1、 在一试管中加入：

dscDNA43.5l

10Rsa1缓冲液5.0l

Rsa1（10u/l）1.5l

2、 旋振混匀并短暂离心3、 37℃孵育1.5小时

4、 用5l消化物分析Rsa1消化效率（参阅SectionV.B）

5、 加2.5l20EDTA/glycogen以终止反应

6、 加入50l酚、氯仿、异戊醇混合物（25：

24：

1）7、混匀

8、 14000rpm10min9、取上清置于一清洁0.5ml离心管

10、加50l氯仿、异戊醇（24：

1），混匀

11、14000rpm10min

12、上清移入一0.5ml清洁离心管

13、加0.5vol4MNH4OAc和2.5vol95%乙醇

14、 旋转混匀

15、 14000rpm,20min,RT

16、去上清

17、80%乙醇200l洗沉淀

18、14000rpm,5min

19、去上清，若使用[-32P]dCTP，用Geiger计数器测沉淀放射性

20、空气干燥沉淀5-10min

21、5.5ldH2O溶解沉淀，-20℃保存

准备实验drivercDNA和对照骨骼肌drivercDNA到此完成。

按SectionF完成实验和对照骨骼肌testercDNAs

F、 Adaptor连接

准备adaptor连接的testercDNA的实验计划如图3所示。

对于每一个实验组testercDNA和对照骨骼肌cDNA，需要制备一与Adaptor-1相连的tester（Tester1-1）和一与Adaptor-2相连的tester（Tester1-2）,和一连接了双adaptors的testercDNA（非杂交的testercontrol1-c）。

非杂交的tester对照用作消减杂交的阴性对照。

Adaptors提供了不同的PCR引物退火位点。

下面的步骤用于完成每个不同的实验cDNA和对照骨骼肌testercDNA。

Adaptor不能连于drivercDNA。

1、 对于每一实验testercDNA，用5l消毒dH2O稀释1ul来源于SectionE的Rsa1消化的实验cDNA。

2、 准备对照骨骼肌testercDNA

a.用无菌H2O稀释Hae3-消化的X174DNA至终浓度150ng/ml.

b.用5l稀释的X174/Hae3DNA混合1l骨骼肌testercDNA（150ng/ml）

这就是对照骨骼肌testercDNA,含0.2%Hae3-消化的X174DNA，每一片段相当于总cDNA的0.02%。

当用骨骼肌testercDNA和drivercDNA消减杂交后，在最后的PCR产生的主要条带应对应于这些对照片段。

3、 准备用于所有连接和一个额外反应的足够MasterMix，在一个0.5ml的离心管里混合3l消毒dH2O，2l5连接缓冲液和1.0lT4DNA连接酶（400u/l）。

注意：

连接所需的ATP在T4DNA连接酶里（初始为3Mm，结束时为300M）

4、对于每一实验testercDNA和对照骨骼肌testercDNA，按下表顺在一0.5ml离心管中混合下列试剂，上下吹打以完全混匀。

表1、配制连接反应

（重复实验testercDNA和对照骨骼肌cDNA）

管号

成分12

Tester1-1（l）Tester1-2（l）

稀释的实验testercDNA22

Adaptor1（10M）2-

Adaptor2（10M）-2

MasterMix66

终体积1010

5、 在一新的离心管中，混合2lTester1-1和Tester1-2，这就是非消减的testercontrol1-c。

连接后，该管的1/3的cDNA分子会在其末端带上两个不同的adaptors

6、 短暂离心，16℃过夜

7、 加入1lEDTA/glycogen混合物终止连接反应

8、 72℃，5min以灭活连接酶

9、 短暂离心。

制备实验和对照骨骼肌Adaptor连接的TestercDNA1-1和1-2就完成了。

10、从每一非消减testercontrol（1-c，2-c，3-c）取1l稀释于1mlH2O，该标本将用于PCR扩增（StepIV1.1）

11、标本储存于-20℃

完成连接效率分析（方法在SectionV.C），然后作SectionIV.G

G、 第一次杂交

重要启示：

在进行下面描述的杂交之前，我们推荐完成连接效率分析（SectionV.C,结果分析和困难指导）。

如果连接没有成功，在杂交之前应重复连接反应。

在下面的过程中，每一testercDNA均加入过量的cDNA，然后标本热变性和退火。

退火之后，高丰度和低丰度序列的ss形式被均衡，因为由于二级杂交动力学的原因，高丰度的分子退火快。

而且，留下的差异表达的sscDNAs（为第二次杂交所需）明显富集，因为tester和drivercDNA非目标cDNA形成杂合体。

重要事项：

开始杂交前，一定要使4杂交缓冲液已到室温至少15-20min。

在使用缓冲液前，要保证没有可见颗粒和沉淀。

如有必要，37℃加热10min以溶解任何沉淀。

1、对于每一实验和骨骼肌消减杂交，在一0.5ml离心管中按下表混合试剂

表2、配制第一次杂交反应

（重复每一实验testercDNA和对照骨骼肌cDNA）

杂交标本1（l）杂交标本2（l）

Tester1-1（l）Tester1-2（l）

Rsa1-消化的drivercDNA（来源于E2.1）1.51.5Adaptor-1连接的Tester1-1（来源于F.8）1.5-Adaptor-2连接的Tester1-2（来源于F.8）-1.54杂交液1.01.0总体积4.04.0

2、覆盖石蜡油并短暂离心3、 在PCR仪中，98℃，1.5min4、 68℃杂交8小时，立即进入SectionH

*标本可以杂交短至6小时，长至12小时，但勿超过12小时

H、 第二次杂交

两份来自于第一次杂交的标本混合在一起，且新变性的drivercDNA也可以进一步富集差异表达的序列。

末端具有不同adaptor的代表不同表达的cDNA新杂合体分子就形成了。

注意：

不要在此阶段变性第一次杂交的标本，也不要将杂交标本置于PCR仪外超过加入新的driver所需时间。

对于每一实验testercDNA和对照骨骼肌cDNA重复下列步骤：

1、 在一消毒管中加入下列试剂：

drivercDNA（SectionE）1l

4杂交缓冲液1l

消毒dH2O2l

2、 取1l上述混合物于0.5ml离心管并覆盖1滴矿物油

3、 在PCR仪中，98℃，1.5min

4、 从PCR仪中取出新变性的driver，采用下列步骤同时混合driver和杂交标本1和杂交标本2（SectionG中制备，见表2）。

这保证两杂交样本仅在存在driver的情况下才混合在一起。

A、 将加样枪调到15l

B、 将枪尖轻轻接触含杂交标本2