第一链cDNA合成试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit中文说明书.docx
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第一链cDNA合成试剂盒TranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit中文说明书
第一链cDNA合成试剂盒TranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit中文说明书
2013-12-0713:
20:
16
TranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit试剂盒包装与含量小瓶/瓶盖标签适用于a）04379012001b）04896866001c）04897030001
1
红色
Transcriptor
Reverse
Transcriptase（逆转录酶）
a）1瓶，25μl（20U/μl）
b）1瓶，50μl（20U/μl）
c）2瓶，各50μl（20U/μl）
储存缓冲液：
200mM磷酸钾，2mM二硫苏糖醇，0.2%TritonX-100（v/v），50%甘油（v/v），pH约为7.2
2
无色
TranscriptorRT
ReactionBuffer（5×）
（逆转录缓冲液）
a）1瓶，1ml
b）1瓶，1ml
c）2瓶，各1ml
5×浓度：
250mMTris/HCl，150mMKCl，40mMMgCl2，pH约为8.5（25°C）
3
无色
Protector
RNaseInhibitor
（RNase抑制剂）
a）1瓶，50μl（40U/μl）
b）1瓶，100μl（40U/μl）
c）2瓶，各100μl（40U/μl）
储存缓冲液：
20mMHepes-KOH，50mMKCl，8mM二硫苏糖醇，50%甘油（v/v），pH约为7.6（4°C）
4
黄色/
紫色
Deoxynuc-leo-tide
Mix
（dNTP）
a）1瓶，100μl（黄色瓶盖）
b）1瓶，200μl（紫色瓶盖）
c）2瓶，各200μl（紫色瓶盖）
dATP,dCTP,dGTP,dTTP各10mM
5
蓝色
Anchored-oligo（dT）18
Primer
（锚定oligo（dT）18引物）
a）1瓶，100μl（50μM）
b）1瓶，200μl（50μM）
c）2瓶，各200μl（50μM）
6
RandomHexamer
a）1瓶，100μl（600μM）
蓝色
Primer（随机引物）
b）1瓶，200μl（600μM）
c）2瓶，各200μl（600μM）
7
绿色
ControlRNA
（对照RNA）
a）1瓶，20μl（50ng/μl）
包含提取于永生细胞系（K562）的总RNA片段稳定溶液
8
绿色
ControlPrimerMixPBGD
（对照基因引物）
a）1瓶，40μl
5μM人类PBGD特异性正向与反向引物
9（b和c为瓶7）
无色
Water,PCR-grade
a）1瓶，1ml
b）2瓶，各1ml
c）3瓶，各1ml
注意：
货号为04896866001和04897030001的产品不含有control试剂（瓶7和瓶8），因此瓶7即为Water,PCR-grade。
储存条件及其稳定性
请将该产品存放于-15~-25°C条件中，并于产品标签上的有效期之前使用。
注意：
ControlRNA（货号04379012001的瓶7）应储存于-70°C条件。
请避免将产品反复冻融！
2产品使用方法
2.1实验前准备
样本材料
RNA模板：
分离的总RNA，mRNA，病毒RNA或体外转录的RNA。
注意：
想要得到较好的RT结果，使用高质量完整的RNA（不含基因组DNA残留、RNA酶、抑制剂）是必要的。
请根据以下预防措施进行操作，避免使RNA在分离过程中受到RNA酶的污染（从细胞裂解开始）：
-使用RNA酶抑制剂（如ProtectorRNaseInhibitor）或在使RNA酶失活的分离条件下进行操作。
-如果有必要，用凝胶电泳分析过程中不同步骤（裂解、分离）以确保样本中不含有RNA酶。
-请记住RNA酶也可能出现在受到污染的玻璃容器中。
为了准备总RNA或mRNA，我们建议您使用罗氏应用科学部的试剂。
为了筛选出能够产生高质量的适用于RT-PCR的完整RNA模板，请参考第3部分。
补充信息：
想了解订货信息或查看相关核酸分离纯化指南，请访问www.roche-applied-想了解关于使用MagNAPureLCSystem或MagNAPureCompactSystem进行核酸自动分离的更多信息，请访问.
引物
六聚物随机引物
在常规的RT反应中，使用5μg的总RNA模板，可采用60μM的随机引物终浓度。
使用5μg总RNA并增加随机引物浓度，将增加短片段PCR产物（的产率，但是相应地，长片段PCR产物及全长转录子的产率会降低。
在非特异引物的反转录方法中，随机引物法是最多使用的一种方法，其特异性的扩增产物只能通过后续的PCR反应中使用特异的PCR引物获得。
锚定oligo（dT）18引物
锚定oligo（dT）18引物特异性地结合在带有poly（A）+的RNA片段上，这类片段通常只占总RNA的1-2%，因此用锚定oligo（dT）18引物进行反转录所获得的cDNA产率大大低于随机引物方法。
如果实验是为了获得新mRNA的RT-PCR产物，则推荐使用锚定oligo（dT）18引物。
使用该方法获得的RT-PCR产物具有较强的一致性。
特异性序列引物
使用特异性序列引物，其终浓度推荐为2μM。
但是请注意，即使这些引物在以DNA作为模板的PCR反应中成功获得扩增产物，相同的引物序列却可能难以定位在cDNA片段上。
如果遇到此类情况，请使用锚定oligo（dT）18引物重新进行第一链合成反应。
2.2实验流程
标准RT-PCR流程
在此提供两种不同的操作流程：
A：
反转录使用锚定oligo（dT）18引物或六聚物随机引物或特异性序列引物。
在大多数情况下，只选择其中的一种引物进行cDNA合成。
B：
反转录使用oligo（dT）18引物和六聚物随机引物的混合物。
这种方法可提高反应敏感度，但与使用单一oligo（dT）18引物比起来反应特异性会降低。
注意：
根据您使用的引物类型，参考以下给出的流程A与B。
流程A：
使用锚定oligo（dT）18引物或六聚物随机引物或特异性序列引物合成cDNA。
以下描述的条件适用于两步法RT-PCR的第一链cDNA合成。
图1为单一反应和多重反应中cDNA合成流程概述。
单一反应
多重反应
RNA+引物+水
可选：
变性
10min65°C
冰上配置多重RT反应混合液（除RNA模板）并分装到各反应管
添加模板RNA到每个反应管中
置于冰上，添加缓冲液，RNaseInhibitor，dNTPs，TranscriptorRT
锚定oligo（dT）18引物/特异性序列引物
30min55°C或1h50°C
六聚物随机引物
10min25°C
30min55°C或1h50°C
85°C失活5min
添加1-5μl至PCR体系或RT-PCR体系
准备
cDNA合成
图1：
单一反应和多重反应中cDNA合成流程概述
①
使用前先将所有冷冻试剂解冻。
开始实验前将所有试剂轻度离心。
实验开始后保持将所有试剂置于冰上。
②
将无菌、无核酸酶、薄管壁的PCR管置于冰上，以20μl反应体系为例，按照以下组分准备模板-引物混合物。
注意：
进行与RNA相关的操作时请保持配戴手套。
模板-引物混合物（1次反应）成分体积最终浓度
总RNA或
poly（A）+mRNA
1μg总RNA或
10ngpoly（A）+mRNA
引物-以下任选其一：
Anchored-oligo（dT）18Primer,50pmol/μl（瓶5）
1μl
2.5μM或RandomHexamerPrimer,600pmol/μl（瓶6）
2μl
60μM
或Sequence-SpecificPrimer
可变
0.5-2.5μM
Water,PCR-grade（瓶7或9）
可变
使总体积为13μl
总体积
13μl
以上为初实验的建议浓度。
为了得到合适的模板浓度，需要使总RNA的量在10ng到5μg之间，使mRNA的量在1ng到100ng之间。
注意：
当RNA样本浓度较低（<10μg/ml）时，添加10μg/mlMS2RNA*以使RNA模板稳定。
③
可选步骤：
在65°C条件下加热反应管10min使模板-引物混合物变性。
此步骤可确保RNA二级结构变性。
立即将反应管置于冰上冷却。
④
在含有模板-引物混合物的反应管中加入下表中其余的RT反应液组分。
成分体积最终浓度
TranscriptorReverseTranscriptaseReactionBuffer,5×（瓶2）
4μl
1×
（8mMMgCl2）
ProtectorRNaseInhibitor,
40U/μl（瓶3）
0.5μl
20U
DeoxynucleotideMix,
每种dNTP各10mM（瓶4）
2μl
每种dNTP各1mM
TranscriptorReverseTranscriptase,
20U/μl（瓶1）
0.5μl
10U
最终体积
20μl
⑤
在反应管中将试剂小心混匀。
注意：
不要旋涡！
将反应管轻度离心使样本收集于反应管底部。
反应时使用带热盖的加热模块，防止反应管中的液体挥发。
⑥
根据您所使用的引物以及目标mRNA的长度，RT反应孵育时间参考下表：
使用的引物目标mRNA的长度RT反应孵育时间
Anchored-oligo（dT）18Primer,50pmol/μl或Sequence-SpecificPrimer
不超过4kb
55°C下30min
超过4kb
50°C下60min
RandomHexamerPrimer,600pmol/μl
不超过4kb
25°C下10min，
之后55°C下30min
超过4kb
25°C下10min，
之后50°C下60min
⑦
加热至85°C维持5min使TranscriptorReverseTranscriptase失活。
将反应管置于冰上以终止反应。
反应管在+2~+8°C下可保存1-2小时，在-15~-25°C下可保存更长时间。
⑧
此cDNA产物无需经过纯化即可用于PCR反应。
一般来说，使用1-5μl第一链cDNA作为模板加入PCR体系中。
若是最初的实验，可尝试在50μlPCR体系中使用2μlcDNA作为模板。
如果在LightCyclerSystem上进行PCR，在20μl的反应体系中使用2-5μlcDNA或cDNA稀释液。
注意：
逆转录反应工作液中MgCl2的最终浓度为8mM，因此PCR反应混合液中每μl的cDNA反应液模板带入了8nmolMgCl2,根据实际需要优化反应液中的MgCl2浓度。
TranscriptorReverseTranscriptase具有RNaseH活性。
在cDNA合成结束后RNaseH可除去RNA模板，这使得PCR引物更容易与cDNA结合，在某些情况下，这会提高PCR反应的灵敏度。
流程B：
使用锚定oligo（dT）18引物和六聚物随机引物合成cDNA。
以下描述的条件适用于两步法RT-PCR的第一链cDNA合成。
①
使用前先将所有冷冻试剂解冻。
开始实验前将所有试剂轻度离心。
实验开始后保持将所有试剂置于冰上。
②
将无菌、无核酸酶、薄管壁的PCR管置于冰上，以20μl反应体系为例，按照以下组分准备模板-引物混合物。
注意：
进行与RNA相关的操作时请保持配戴手套。
模板-引物混合物（1次反应）成分体积最终浓度
总RNA或
poly（A）+mRNA
1μg总RNA或
10ngpoly（A）+mRNA
Anchored-oligo（dT）18Primer,
50pmol/μl（瓶5）
1μl
2.5μM和RandomHexamerPrimer,
2μl
60μM
600pmol/μl（瓶6）
Water,PCR-grade（瓶7或9）
可变
使总体积为13μl
总体积
13μl
以上为初实验的建议浓度。
为了得到合适的模板浓度，需要使总RNA的量在10ng到5μg之间，使mRNA的量在1ng到100ng之间。
注意：
当RNA样本浓度较低（<10μg/ml）时，添加10μg/mlMS2RNA*以使RNA模板稳定。
③
可选步骤：
在65°C条件下加热反应管10min使模板-引物混合物变性。
此步骤可确保RNA二级结构变性。
立即将反应管置于冰上冷却。
④
在含有模板-引物混合物的试管中加入下表中其余的RT反应液组分：
成分体积最终浓度
TranscriptorReverseTranscriptaseReactionBuffer,5×（瓶2）
4μl
1×
（8mMMgCl2）
ProtectorRNaseInhibitor,
40U/μl（瓶3）
0.5μl
20U
DeoxynucleotideMix,
每种dNTP各10mM（瓶4）
2μl
每种dNTP各1mM/
TranscriptorRerverseTranscriptase,
20U/μl（瓶1）
0.5μl
10U
最终体积
20μl
⑤
在反应管中将试剂小心混匀。
注意：
不要旋涡！
将试管轻度离心使样本收集于反应管底部。
反应时使用带热盖的加热模块，防止反应管中的液体挥发。
⑥
根据您所使用的引物以及目标mRNA的长度，RT反应孵育时间参考下表：
使用的引物目标mRNA的长度RT反应孵育时间
Anchored-oligo（dT）18Primer,
50pmol/μl和RandomHexamerPrimer,600pmol/μl
不超过4kb
25°C下10min，
之后55°C下30min
超过4kb
25°C下10min，
之后50°C下60min
⑦
加热至85°C维持5min使逆转录酶失活。
将反应管置于冰上以终止反应。
反应管在+2~+8°C下可保存1-2小时，在-15~-25°C下可保存更长时间。
⑧
此cDNA产物无需经过纯化即可加入用于PCR反应。
一般来说，使用1-5μl第一链cDNA作为模板加入PCR体系中。
若是最初的实验，可尝试在50μlPCR体系中使用2μlcDNA作为模板。
如果在LightCyclerSystem上进行PCR，在20μl的反应体系中使用2-5μlcDNA或cDNA稀释液。
注意：
逆转录反应工作液中MgCl2的最终浓度为8mM。
因此PCR反应混合液中每μl的cDNA反应液模板带入了8nmolMgCl2,根据实际需要优化反应液中的MgCl2浓度。
TranscriptorReverseTranscriptase具有RNaseH活性。
在cDNA合成结束后RNaseH可除去RNA模板，这使得PCR引物更容易与cDNA结合，在某些情况下，这会提高PCR反应的灵敏度。
2.3对照反应
cDNA合成
目录号为04379012001的产品提供的对照反应包括ControlRNA的逆转录，以及后续的在常规热循环仪或LightCycler仪器上进行的扩增检测151bp的PBGD片段的PCR反应。
以下为两步法RT-PCR对照实验中第一链cDNA合成的条件。
注意：
实验开始前应将热循环仪预热至RT反应的温度（步骤4）。
①
使用前先将所有冷冻试剂解冻。
开始实验前将所有试剂轻度离心。
实验开始后保持将所有反应剂置于冰上。
②
将无菌、无核酸酶、薄管壁的PCR管置于冰上，按照以下成分准备含模板-引物混合物的20μl反应体系。
注意：
进行与RNA相关的操作时请保持配戴手套。
模板-引物混合物（1次反应）成分体积最终浓度
ControlRNA
2μl
100ng
Anchored-oligo（dT）18Primer,
50pmol/μl（瓶5）
1μl
2.5μM
Water,PCR-grade
10μl
使总体积为13μl
总体积
13μl
③
添加以下成分成分体积最终浓度
TranscriptorReverseTranscriptaseReactionBuffer,5×（瓶2）
4μl
1×
（8mMMgCl2）
ProtectorRNaseInhibitor,
40U/μl（瓶3）
0.5μl
20U
DeoxynucleotideMix,
每种dNTP各10mM（瓶4）
2μl
每种dNTP各1mM
TranscriptorReverseTranscriptase
20U/μl（瓶1）
0.5μl
10U
最终体积
20μl
吹打混匀。
用微量离心机轻度离心。
④
55°C下孵育30min
⑤
加热至85°C维持5min使逆转录酶失活。
将反应管置于冰上以终止反应。
⑥
反应管在+2~+8°C下可储存1-2小时，在-15~-25°C下可储存更长时间。
PBGDPCR
实验得到的单链cDNA可利用提供的PBGD特异性引物通过聚合酶链式反应进行扩增。
这个过程可以利用常规热循环仪或LightCycler仪器完成。
在PCR反应体系为50μl的常规热循环反应（使用FastStartTaqDNAPolymerase*）中加入5μlcDNA反应液。
采用LightCycler1.5System或LightCycler2.0System进行的反应总体积为20μl的real-timePCR（使用LightCyclerFastStartDNAMasterSYBRGreenI*）中加入2μlcDNA反应液。
采用LightCycler480System进行的反应总体积为20μl的real-timePCR（使用LightCycler480SYBRGreenIMaster*）中加入2μlcDNA反应液。
想要了解更多PCR或real-timePCR的更多具体信息，请阅读FastStartTaqDNAPolymerase*、LightCyclerFastStartDNAMasterSYBRGreen*、LightCycler480SYBRGreenIMaster*相关使用说明。
常规热循环仪PCR
根据以下流程准备50μl标准反应体系。
在做RT对照反应管之余，以水替代cDNA模板加入反应体系作为阴性对照。
①
使用前先将所有冷冻试剂解冻。
开始实验前将所有试剂轻度离心。
实验开始后保持将所有试剂置于冰上。
②
将薄管壁的PCR管置于冰上，配置50μl的PCR反应体系,在同一反应管中依次加入下表中各个组分。
成分体积最终浓度
含20mMMgCl2的FastStartBuffer（10×）
5μl
1×
PCRNucleotideMix*（10mM）
1μl
0.2mM
ControlPrimerMIXPBGD（5μM）
2μl
0.2μM
cDNAfromControlRTReaction
5μl
FastStartTaqDNAPolymerase*（5U/μl）
0.4μl
2U
Water,PCR-grade
36.6μl
总体积
50μl
③
在带有热盖的热循环系统中进行PCR或在反应体系上覆盖30μl矿物油（如果热循环系统不带热盖）：
1个循环
预变性
94°C
5min
35个循环
变性
退火
94°C
50°C
10s
20s
延长
72°C
30s
1个循环
最终延长
冷却
72°C
4°C
7min
④
取15μl于3%琼脂糖凝胶上进行电泳。
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