农业 兽医生物制品实验书.docx

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农业兽医生物制品实验书

佛山科学技术学院

《兽医生物制品学》

实验指导书

主编：

黄淑坚

佛山科学技术学院动物医学系

2000年10月17日

简要说明

在生物科学日新月异的今天，随着对生物制品作用机制的深入研究和揭示以及技术方法的不断完善，生物制品学已成为一门有着广阔发展前景的独立学科，新的技术方法出现，精制及新型产品的不断问世，生物制品的应用不仅仅限于流行病方面，还逐渐应用到诸如对癌症那样死神的防治以及抗衰老等方面，并已显示了它不可替代的特有功效。

在兽医科学领域，生物制品仍是当前有效预防、治疗及诊断动物流行病的最有力武器而在被广泛研究和应用。

为适应及进一步促进兽医生物制科学发展，保证对兽医生物制品的正确使用及有效防治（制）动物流行病的需要，我们编写了《兽医生物制品学实验指导书》一书。

由于本门课学时的限制，因此只编入了三个实验。

在编写过程中，尽管总结了各方面的实验经验，也参阅了一些技术资料，但由于水平和经验所限，加上时间仓促，定有不少缺点、错误，希望各方面的读者多加批评指正。

编者

目录

简要说明…………………………………………………………………………………………

实验一鸡传染性法氏囊病高免卵黄液的生产及应用………………………………..

实验二猪大肠杆菌病自家灭活疫苗的生产及应用…………………………………………..

实验三鸡新城疫油乳剂灭活疫苗的生产及应用……………………………………………..

主要参考文献……………………………………………………………………………………

实验一鸡传染性法氏囊病高免卵黄液的生产及应用

一、实验目的：

掌握治疗性兽医生物制品的生产原理、生产过程及应用。

二、实验内容：

1．母鸡群的免疫程序。

2．蛋的收集及清洗。

3．卵黄的提取。

4．卵黄液的配制。

5．卵黄液的菌检。

6．卵黄液的安检。

7．卵黄液的效检。

三、实验仪器、设备及材料

1．鸡传染性法氏囊病高免蛋：

6个/组。

2．抗生素：

青霉素（80万/瓶）、链霉素（100万/瓶），1瓶/组。

3．生理盐水：

1000毫升/瓶，1瓶/组。

4．镊子、捞罩、酒精灯、玻棒等：

1套/组。

5．鲜血琼脂斜面，3支/组。

6．1月龄鸡传染性法氏囊病非免疫鸡只，3只/组。

四、实验原理：

1．高免卵黄液是以特异的抗原免疫后所获得的含有特异性抗体的治疗性生物制品。

2．高免卵黄液的作用机制的实质是抗体的免疫效应。

主要有：

（1）中和作用；

（2）对病原体的生长抑制作用；（3）溶菌或杀菌作用；（4）调理吞噬作用；（5）抗体依赖细胞介导细胞毒作用等作用而起治疗作用。

五、实验步骤

1．免疫

（1）采取健康的临产蛋用型母鸡，隔离饲养，喂以蛋鸡全价饲料。

（2）免疫程序：

基础免疫：

在开产前1个月进行，鸡传染性法氏囊病油乳剂灭活苗肌注，1.5毫升/只。

加强免疫：

在基础免疫后15-20天，肌注鸡传染性法氏囊病油乳剂灭活苗，2毫升/只。

（3）收集产蛋：

加强免疫后7天，检测卵黄AGP效价达到1：

8以上，合格者收集蛋只，用于卵黄液的生产。

不合格蛋只不用于高免卵黄液的生产，其母鸡群尚需进一步进行加强免疫，2毫升/只，直至卵黄的AGP效价达1：

8以上才集蛋只作为高免卵黄液生产用。

2．卵黄抗体的制备：

卵黄抗体的AGP效价达1：

8以上者可选用。

将收集的高免蛋只用清水洗净后，再用1：

1000倍稀释的新洁而灭清洗蛋壳，然后以无菌手续收取卵黄液，去除蛋白部分和卵黄囊膜，用灭菌生理盐水作1：

3稀释，加入青、链霉素，每毫升各含2000单位，充分混匀，分装入瓶，冰冻保存。

3．质量检验：

（1）物理性状：

蛋液应为质悬液，不板结，无腐自腐臭味。

（2）无菌检验：

每瓶均应进行细菌检验，应无菌生长。

（3）安全检验：

肌肉注射1月龄以下的鸡只，2毫升/只，观察5天，应无明显反应。

（4）效检：

对鸡传染性法氏囊病初发病鸡群应有明显的控制效果。

4．使用：

对发病初期或紧急预防鸡传染性法氏囊病，有良好效果，视鸡体大小，肌注1-3毫升/只，必要时可隔天重复一次。

注意：

（1）卵黄液要彻底解冻后才注射，以减少应激；

（2）卵黄抗体注射后有效期一般5-7天，在控制疫情后应及时追加免疫。

六、实验报告要求：

每位同学写一份实验报告。

七、实验注意事项

1．高免卵黄液制备好，应用AGP实验进行其效价的检测。

八、思考题

1．为什么高免卵黄液的制备需用本体动物来制备？

2．高免卵黄液有哪些优缺点？

3．使用高免卵黄液应注意那些问题？

实验二猪大肠杆菌病自家灭活疫苗生产及应用

一、实验目的：

掌握预防性细菌性灭活自家疫苗的生产原理、生产过程及应用。

二、实验内容

1．细菌分离、纯化及鉴定。

2．细菌的增菌培养。

3．培养菌液的灭活。

4．配苗。

5．灭活疫苗菌检。

6．灭活疫苗的安检。

7．灭活疫苗的效检。

三、实验仪器、设备及材料

1．猪大肠杆菌病患猪：

一头。

2．麦康凯琼脂平板：

6块/组。

3．营养肉汤：

250毫升/瓶，6瓶/组。

4．甲醛溶液：

1瓶/组。

5．氢氧化铝胶：

500毫升/瓶，1瓶/组。

6．接种环、酒精灯等：

1套/组。

7．鲜血琼脂斜面，3支/组。

8．实验小白鼠，3只/组。

9．健康小猪，3只/组。

四、实验原理

灭活疫苗（Inactivatedvaccine）又称死疫苗，以含有细菌、病毒或其它微生物等材料，利用物理的（热、射线）、化学的（甲醛、染料、烷化剂）等方法处理，使其灭活、丧失感染力或毒性而保持有良好的免疫原性，接种动物后能产生人工主动免疫，达到预防疾病的目的。

灭活疫苗分为组织灭活疫苗（如兔病毒性出血症组织灭活疫苗）和培养物灭活疫苗（如鸡新城疫油乳剂灭活疫苗），其特点是：

无毒安全，易于保存和运输，疫苗稳定，便于制备多价或多联疫苗，但使用剂量大，接种次数多和不产生局部免疫力。

为提高免疫效果，通常都在灭活疫苗中加入佐剂（明矾、氢氧化铝、矿物油等）。

猪大肠杆菌病包括仔猪黄痢、仔猪白痢和仔猪大肠杆菌水肿病。

猪大肠杆菌病在我国日益严重，尤其是黄痢和水肿病，在集约化猪场中愈见普遍，发病率和致死率有逐步上升的趋势，对养猪业造成较大的危害。

在免疫预防和猪大肠杆菌病方面，由于大肠杆菌血清型非常之多，且经常发生变异，各个猪场的大肠杆菌血清型不尽相同，因而现时推广的大肠杆菌弱毒苗的适用范围受到限制。

为了解决这一问题，对大肠杆菌危害严重的猪场，应用自家灭活疫苗进行免疫是行之有效的控制方法。

五、实验步骤

1．病原的分离

（1）选择发病典型的濒死期病猪，并且未用过抗菌素和其它免疫方法进行预防和治疗，否则影响病原的分离。

分离黄痢病原最好选择5天龄以内下痢严重的濒死仔猪；分离水肿病病原最好选择出神经症状、眼睑水肿明显的濒死期仔猪。

（2）以无菌操作法，取病猪的肠系膜淋巴结，接种、麦康凯培养基，37℃培养24小时，选取单个粉红色菌落，移植于鲜血琼脂斜面上，作菌种保存。

3．病原鉴定

（1）大肠杆菌鉴定：

在麦康凯培养基上长出的粉红色菌落可初步认为大肠杆菌，还需作形态特性和生化特性等方面的鉴定，才能最后确证大肠杆菌。

（2）致病性鉴定：

所分离的大肠杆菌是否该场的病原菌，还需作致病性试验。

①溶血性试验：

致病性大肠杆菌一般都有溶血性，鲜血琼脂平板37℃24小时培养，可见β溶血。

②小白鼠致病性试验：

仔猪黄痢和仔猪水肿病的病原，对小白鼠都有一定的致病性。

菌种经普通肉汤连续继代两次，皮下接种小白鼠3只，0.2毫升/只，一般在10小时左右出现毛松、精神沉郁、步态拘谨等症状，严重的24小时内死亡。

③易感仔猪人工发病试验：

仔猪黄痢病原可选择5天龄以内的易感仔猪，口服肉汤培养物，2毫升/只，一般在10-15小时即出现明显的下痢，粪便呈黄水样。

仔猪水肿病病原可选择30天龄左右的易感仔猪，耳静脉接种肉汤培养物上清液，3毫升/只，一般在10小时之内出现神经症状、眼睑水肿，1-2天内死亡。

（3）血清型鉴定：

在一个猪场中往往分离得多株致病性大肠杆菌，有条件的话，可用大肠杆菌分型血清进行血清型鉴定，如果多数菌株的血清型是相同的话，可选一代表株制苗，如血清型不同，应酌情选用不同的菌株制多价菌苗。

如没有分型条件的话，则视情况而制备多价菌苗。

4．培养基：

大肠杆菌自家苗的制造，可选用以牛肉汁为基础的牛肉汤，在此基础上添加1%牛血清和1%葡萄糖，有助提高细菌的浓度。

5．菌苗的制造：

（1）一级种子液培养：

取分离鉴定后保存的菌种，接种到加有1%牛血清和1%葡萄糖的缓冲肉汤中，37℃培养18-24小时，细菌呈旺盛生长，经纯粹检验后不应含杂菌。

（2）二级种子液培养：

取一级种子液接种到上述肉汤培养基中，37℃培养5-10小时，细菌旺盛生长，并整齐划一，经纯粹检验不应含杂菌。

（3）菌液的培养：

营养缓冲液应预温至37℃，有助于细菌迅速生长。

按5%的量接种二级种子液，37℃培养24-36小时，此时细菌的总菌数已达最高含量，经纯粹检验不应含杂菌。

大肠杆菌为兼性厌氧菌，在有氧环境下生长更为旺盛，自家灭活苗一般只是小批量生产，常通过摇震培养增加氧气含量，促进细菌生长。

6．灭活：

培养结束后，对细菌进行灭活。

常用甲醛溶液，加入0.4%福尔马林（以36-40%甲醛溶液计算），充分混匀，37℃作用24小时，再加入过量焦亚硫酸钠终止过残余的甲醛。

7．配苗：

细菌性灭活苗常加氢氧化铝胶作为佐剂，加入量为20%，吸附24小时。

、

8．检验：

（1）细菌总数的检验：

用细菌比浊管比浊法测定细菌总数，在灭活后配苗前进行，大肠杆蓖总数通常达50亿/毫升以上。

（2）无菌检验：

细菌灭活后，接种鲜血琼脂斜面37℃培养24小时，观察灭活效果，应无细菌生长。

（3）安全试验：

配苗后进行。

小白鼠皮下接种0.2毫升/只，3只；家兔皮下接种1毫升/只，2只；或断奶后仔猪皮下注射3毫升/只，2只，观察5天，不应出现明显的临床症状。

9．保存与使用：

4-8℃保存1年，沉淀物摇起后能均匀分散，不应出现结块和粒团。

仔猪黄痢应免疫母猪，基础免疫3毫升/只，再次免疫在产前15-20天，4毫升/只。

仔猪水肿病应直接免疫仔猪，免疫时机应视发病情况而定，应在发病高峰期的前20天进行，如40天龄为发病高峰期，则应在20-30天龄时进行免疫，剂量为1-1.5毫升/只。

免疫效果受多方面因素影响，如致病菌株的分离、细菌浓度和疫苗剂量、免疫时机等。

六、实验报告要求：

每位同学写一份实验报告。

七、实验注意事项

1．防止其它细菌的污染，细菌的接种应在无菌罩中进行。

2．避免细菌散毒，使用过的任何器械及物品均需无害化处理。

八、思考题

1．制作自家苗的菌种为什么要进行致病性检验？

猪大肠杆菌菌种的致病性如何鉴定？

2．菌种一般如何保存？

3．培养菌液灭活后如何进行活菌检查？

实验三鸡新城疫油乳剂灭活疫苗的生产及应用

一、实验目的：

掌握预防性病毒性灭活疫苗的生产原理、生产过程及应用。

二、实验内容

1．照胚及定位。

2．鸡胚的清洗。

3．鸡胚的接种。

4．病毒胚液的收集。

5．病毒胚液的灭活。

6．水相、油相的制备。

7．油水相乳化。

8．疫苗的安检。

9．疫苗的效检。

三、实验仪器、设备及材料

（一）实验仪器、设备

1．高速搅拌器，1个/组。

2．量筒、烧杯、漏斗等，1套/组。

3．照蛋器，1个/组。

4．注射器，1套/组。

5．电炉，1个/组。

6．灭菌干燥盐水瓶，3个/组。

（二）实验材料

1．9-11天龄的鸡胚，10个/组。

2．新城疫IV系疫苗，1瓶/组。

3．生理盐水（100毫升），1瓶/组。

4．吐温-80，1瓶/组。

5．司本-80，1瓶/组。

6．硬脂酸铝，1瓶/组。

7．10号白矿油1瓶/组。

8．鲜血琼脂斜面，3支/组。

9．敏感实验鸡，2只/组。

四、实验原理

灭活疫苗（Inactivatedvaccine）又称死疫苗，以含有细菌、病毒或其它微生物等材料，利用物理的（热、射线）、化学的（甲醛、染料、烷化剂）等方法处理，使其灭活、丧失感染力或毒性而保持有良好的免疫原性，接种动物后能产生人工主动免疫，达到预防疾病的目的。

灭活疫苗分为组织灭活疫苗（如兔病毒性出血症组织灭活疫苗）和培养物灭活疫苗（如鸡新城疫油乳剂灭活疫苗），其特点是：

无毒安全，易于保存和运输，疫苗稳定，便于制备多价或多联疫苗，但使用剂量大，接种次数多和不产生局部免疫力。

为提高免疫效果，通常都在灭活疫苗中加入佐剂（明矾、氢氧化铝、矿物油等）。

鸡胚是繁殖鸡新城疫病毒的良好材料，病毒接种后24-72小时出现死亡。

五、实验步骤

1．毒种：

弱毒种毒和强毒种毒都可以使用，但各毒株的抗原性不一致，一般来说，弱毒株在鸡胚内繁殖的毒价比较高，又无散毒的危险，但抗原性则强毒株较强，在生产上两者都有应用，但要视生产环境条件而定。

强毒株用中监所的标准强毒株，弱毒株常用I系、IV系或克隆30。

毒种在使用前应先复壮，接种鸡胚或接种鸡胚成纤维单层细胞，符合新城疫病毒的生物学特性者可选用。

2．病毒的培养：

多用鸡胚培养，较方便易行。

选用9-10天龄发育正常的鸡胚，最好是新城疫非免疫母鸡所产，蛋壳经消毒后，经绒毛尿囊腔接种10-100培稀释的种毒，每胚0.1毫升。

于37℃、50-60%相对温度中继续孵化，24小时照胚，去除死胚，收集24-48小时死亡胚只的羊水和尿囊液，经无菌检验合格。

3．灭活：

于含毒胚液中加入0.1福尔马林，混匀，37℃灭活16小时，亦可用1/500的β-丙内酯（BPL），充分混匀，37℃作用1.5小时，其间摇动3-5次。

作灭活效果检验，灭活胚液尿囊腔接种9-11天龄鸡胚，0.1毫升/只，5-10只，胚只不应死亡。

4．油相配制：

用96%10白矿油加6%司本-80和2%硬脂酸铝，加热使硬脂酸铝充分溶解后经15磅20分钟灭菌。

5．疫苗配制：

灭活的胚液加2-4%吐温-80充分混匀后作为水相，按2：

3（或1：

1）比例将水相缓慢加入油相中，边加边高速搅拌，使之成为油包水，滴落水中油滴不分散，且4℃中保存半年至1年油水不分层。

6．检验：

（1）无菌检验：

按常规法进行。

（2）安全检验：

取1月龄鸡10只，肌肉注射1毫升/只，观察10天，无不良反应或反应轻微，注射部位只出现细小的硬结，为合格。

（3）效力检验：

取4周龄10只，肌肉免疫0.5毫升/只，14天后用新城疫强毒攻击，观察14天，保护率在90%以上者为合格，应设非免疫对照组。

六、实验报告要求：

每位同学写一份实验报告。

七、实验注意事项

1．新城疫病毒能引起人的结膜炎，因此，在实验过程，要注意自身的保护。

2．死亡胚在4℃冰箱内放置过夜后要收集胚液，否则，鸡胚会随着存放的时间延长而逐渐腐败。

八、思考题

1．禽胚为什么要选用新城疫非免疫鸡胚？

2．为什么一般要弃去24小时内死亡胚？

3．如何进行灭活病毒液的活毒检查？

教材与教学参考书

一、教材：

刘宝全等主编的《兽医生物制品学》，中国农业出版社。

二、教学参考书：

（1）徐贵卿等主编的《兽医生物制品学》，河南科学技术出版社。

（2）张振兴等主编的《实用兽医生物制品技术》，中国农业科技出版社。

（3）叶润全等主编的《兽医生物制品技术》（校内教材）。