世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版.docx
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世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版
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世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版
世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版[精华]
序言：
国内外关于原代培养有很多文献，不幸的是，没有一篇是详细的，没有一篇解答过why.
为了让大家少走弯路，根据我杀过3000只老鼠的经验，我把我这几年摸索的经验和大家分享，请求多投几票得几个叮当。
相信你follow我的这篇文章一定会做的很好。
我的标题说的很像吹牛，但是我是严肃认真的说的，Iearnit.
note:
这篇文章全是我个人的经验，99。
9%原创，经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养法，除了最后那一副图是来自下面第2行那篇文献，所以我才说是99.9%原创。
1.材料选择。
一定要严格按照国际上，NCBI数据库，其他文献的材料一致。
胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。
因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，比如NMDA受体。
和文献不同会导致错误结论，甚至困惑。
很多人写信问我新生鼠的培养问题，我回答用新生鼠的实验很少，八成是你自己搞错了实验对象，请确认国际上的相关研究文献所用老鼠，再来问我下面的问题。
2，培养基选择（neurbasal/neurobasal-a,invitrogenCo.ltd）。
我强烈不建议用血清培养。
原因是：
首先，血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，最后非常影响神经元产量；
其次，为了抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。
严重的毒性会影响许多灵敏实验；
再次，最重要的，血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。
Invitrogen/GIBCO无血清培养基neurobasal（neurbasal-A）被认为是最标准，最好的培养基。
需要的添加剂为B27和谷氨酰胺。
培养出的细胞状态均一，胶质细胞几乎不分裂。
其中，neurobasal是胎鼠培养基，而-A为新生鼠培养基。
不过根据笔者实验，没什么太大区别，都能很轻松培养成功，但是，切忌中途换培养基，要从一而终。
很多实验室是不加抗生素的，也有的实验室加。
由于很多初学者操作不熟练，不注意，很多人会污染，所以我还是建议加双抗。
注意！
由于无血清培养基添加剂不是血清，而是人工合成的B27（也有用N2的，但是推荐B27，只差10美金），血清有复杂的解毒作用而B27没有，双抗对细胞的干扰，无血清培养基要大的多。
所以，如果你在neurobasal里添加抗生素，记得用量只要标准量的一半。
另一个添加成分谷氨酰胺溶液不稳定，所以每次用时候要现配现加。
大概是0.5-2mmol/l大部分人用0.5mmol/l.虽然笔者试过，没加这个也正常生长，但是几乎所有文献都添加，wejustsimplyfollow.
3.解剖过程一定要全程在冰上预冷。
这就意味着，从你处死母鼠后，胎鼠的大脑的温度要最快的降低到0度。
另外，在解剖过程中，胎鼠直到皮层或海马被剪碎的过程，有时候可能需要2小时，如果样品多。
一定要注意多准备冰袋子。
确保你的任何过程都在冰浴的培养液中进行（消化步骤除外）。
这样可以大大提高存活率。
在解剖大脑时候，有人用hank's，在其中解剖。
根据我的经验，即使是0度，神经元还是在进行着很大程度代谢。
所以，hanks的无糖环境很不利。
我个人建议，用DMEM-高糖或DMEM-F12+马血清来浸泡解剖过程中的大脑，来供给大脑的代谢，血清可以抑制神经凋亡。
这其中还有一个问题，就是DMEM培养液会在空气中变碱性。
国外有的实验室用L-15培养液来浸泡解剖过程中的脑，因为L-15不会再空气中变碱性。
没有L-15的（国内几乎没有），可以全程用DMEM-HG或者DMEM-F12+血清浸泡解剖过程中的脑。
注意注意：
一切操作都在冰浴的液体中，所以要多准备冰袋。
（中途冰袋没了的是猪头）
4.关于培养皿的问题。
一般来说，6孔板是最佳选择。
神经元让人苦恼的问题是，神经元发育的情况和密度相关。
大于6孔板（比如6CMDISH）会使得中间很难和周围的细胞密度一样，造成板中间和边缘成熟度不一样，而这会给实验带来很大干扰。
而太小的话（96孔或128孔）细胞会倾向于向中间集中也会照成发育不均匀。
所以笔者经验是6孔板是最佳选择。
神经原代培养一定是要包被，用POLY-LYS或者胶原。
关于POLY-LYS包被，我们是包被30分钟，吸干晾过夜，然后洗两次，或者只洗一次但是要30分钟接着晾干。
由于neurobasal培养法相当成熟，所以没必要用难固定的胶原。
5.处死母鼠并把胎鼠解剖时候，一定要注意母鼠状态，是否有死胎，胎儿胎盘是不是正常，有多少胎，母鼠是多少天的（一般是E16-E18）这些信息也要严格记录。
处死孕鼠后，要立即取出子宫放入冰冷培养液中。
注意孕鼠处死后要短暂的浸泡酒精消毒，防止污染。
一般来说，冰袋笔者选择一面蓝一面白的。
蓝的朝上，可以很清晰看到海马结构。
而去除血管膜的时候，白的那面朝上，这样可以很清楚看到血管膜。
从处死老鼠到大脑被剥离出这段是人就会做，我就不多说了。
不过有一点要注意，不管你是用皮层还是海马，不要取一个分离一个，而是要快速把所有胎鼠大脑都迅速取出放到冰预冷的培养液中。
我建议胎鼠取出来的时候胎鼠就放在冰冷的缓冲液中。
就是说，处死后要迅速把大脑的温度降到0.
6：
最影响原代培养的成败因素之一：
这小段请大家一定注意看。
无论皮层还是海马，上面都是有一层血管膜。
注意：
一定要尽可能的去掉所有的血管和血管膜。
可以用解剖显微镜。
胎鼠很好剥离，而新生鼠则比较难。
这里千万不能粗心大意！
！
血管膜没剥离干净的后果是：
1吹打时候很难吹打下来神经元，被迫多次吹打，造成神经元大量死亡；2血管膜一部分细胞会混入原代培养中，这些细胞往往会分裂，导致你的培养成果根本不能用。
可以说，剥离的不好不干净，实验就是失败的，不可能得到高质量的神经元。
注意的事情二：
如果是要的是皮层的神经元原代培养，而皮层的细胞很多，切忌不要放太多皮层消化吹打！
过多的细胞反而会导致神经元大量死亡。
另外，请仔细注意文献中要的是皮层哪一部位。
没有详细要求的话一般是取顶端
。
从大脑到单个海马的剥离我不细说了。
我现在以海马神经元为例。
在所有海马都成功剥离后，请仔细的去除血管膜，原因上面说过。
最后，请再仔细检查一下是不是都去掉了。
确认后，海马片段被移入一个小烧杯里，加少量培养液，用剪刀剪成0.5-1立方毫米的小块，放置冰上准备消化，
7：
实验成败的关键之二：
消化。
一般来说，我看很多人都用0.125%的胰酶消化。
实话说，胰酶消化非常的难以掌握速度，而且消化效果真的是--很烂！
稍微不注意，就会消化过头，细胞都消化光了。
而胰酶消化的快，还会出现细胞快速破裂释放出DNA，和其他蛋白缠结成絮状包裹在组织块外面，使得块里面的不到应有的消化。
所以我个人不推荐胰酶。
想做一个完美成功的消化，我强烈推荐木瓜酶+DNA酶。
木瓜酶是消化过后，存活率最高的酶（见附图）。
笔者是配成2mg/ml的木瓜酶。
另外要用的是DNA酶。
DNA酶的作用是，消化掉破裂细胞的DNA，避免了释放的DNA和蛋白缠结在组织块表面而阻碍进一步消化。
DNA酶由于各个公司的活性不一样，很难有标准浓度，需要摸条件，不过不是很严格，只要能防止DNA缠结就好。
木瓜酶的特点是不会消化过头，非常温和。
缺点是一定要现配（请直接用无血清的培养液配来保证神经元的营养代谢，而且一定要现用现配。
消化的技巧：
消化时候，很多人有不良习惯，喜欢用个50ml试管装着所有东西。
结果是组织都沉底，下面消化不足，上面消化的没细胞。
笔者的技巧是，用一个6或10CM培养皿来消化。
这样消化液在培养皿里形成浅而广阔的一层，均匀分布着组织块，从而彻底解决了上述问题。
消化酶是2mg/ml木瓜蛋白酶+适量DNA酶。
木瓜蛋白酶很便宜请放心。
消化过程是20-30分钟。
由于木瓜蛋白酶温和，因此不会消化过头，使得你的实验消化的很稳定。
消化时候请在37度温箱里，每5分钟稍微摇动一下。
注意：
1）木瓜酶不要用巯基化合物激活，激活后消化好很多但是成活率坏很多；2）尽量用不含血清的培养液来配置木瓜酶而不是用hanks，使得神经元保持营养；3）木瓜酶一定要现用现配。
再次重申：
除了消化过程中要37度，其余任何时刻都是要浸泡在0度（冰浴）的液体中。
消化过后可以用1ml血清终止反应（我是用马血清，便宜，但是切忌不要用国产血清，污染几率很大）。
把消化用的培养皿放在冰上冷却，然后垫高一面使得液体集中在另外一面便于吹打。
整个体系静止2-3分钟，然后仔细的去掉上层的液体，保留消化过的组织块
8.实验成败最关键最关键的：
吹打。
笔者经验是，没有必要用巴斯德管。
对于胎鼠和10天之内的新生鼠，一般的1ml蓝枪头就可以达到满意的效果。
在一边被垫高的皿里面，加入1-1.5ml新鲜培养基和少量DNA酶，吹打10次。
吹打时候要注意，切忌过快，要缓慢吹打。
吸入时候要很缓慢，吹出的时候可以略快，但是也要缓慢。
轻柔吹打是细胞成活关键！
要用进口枪头，国产的有时候会过细。
我们采用的是最合理的分步吹打法。
每个10次吹打过后，静止2分钟。
这时候游离的单细胞在上面，而团块会沉到下面去。
上面的那层就是你要的单个悬浮细胞，把它们挪到指定容器里（一样要冷在冰上）。
下面沉淀下去的细胞团块不要丢弃，再加1-1.5ml新鲜培养液，重复刚才的步骤，轻柔吹打，再静止2分钟，转移上层的单细胞到刚才指定容器里，一共这样分步吹打3次。
3次之后如果还有团块在下面，请果断丢弃。
造成这个的原因就是刚才的血管膜没剥好。
这个分步吹打的过程保证了每一个单细胞都避免了过度吹打，而分布吹打又保证了尽可能多的收获单细胞。
重申一下，为了保证最大程度收获活细胞，每次吹打之前，可以加入少量DNA酶。
这招可以更容易收获大量高质量细胞，尤其是实验材料不足时候。
消化和吹打非常忌讳操作的细胞过多，这样反而会使大量细胞死亡。
实验者如果是用的皮层这种原材料充足的话，切忌不要放入过多皮层。
9（可选可不选，但是我建议全选）神经元进一步纯化。
一般来说，收获的细胞悬液已经是很纯的神经细胞了。
但是，由于实验者等个人或者客观原因，血管膜可能不会被完全剥离；杂细胞可能也被吹入了细胞悬液；操作者手法不熟练，造成死细胞过多，影响种板等等原因，还是会影响到培养的神经元的质量。
为了克服这些，笔者查了一些文献，经过反复测试采用了nycoprep低转速密度-梯度离心。
现在这个梯度溶液已经被公司升级为optiprep.稀释时候，NycoPrep?
1.077推荐稀释成60%，就用刚才悬浮细胞的培养液来配置。
注意：
1.077被广泛应用于血液中分离血细胞，如果你拿到的nycoprep（optiprep）不是1.077，那么请换算一下稀释度）值得注意的是，皮层和海马可能需要的稀释度稍微有不同。
一般来说，一个10ml梯度离心管中，2-4ml稀释过的梯度液体就够用，取决于你收获的细胞量多少。
把你收获的细胞悬液小心的加到稀释好的梯度剂的上面一层，经过1500转（不是15000请注意）5-8分钟，神经元被高度压缩到梯度面和上面的培养液分界面那一层。
而最下面的梯度剂下的沉淀则是细胞团块，血细胞，杂细胞，以及部分小胶质细胞。
而最上层最浮头，则是细胞碎片。
这样，你就得到了最大限度去除了杂细胞，和细胞碎片，并去掉了一定的胶质细胞的最干净最纯粹的神经元。
如果实验者技术精湛，也可以不用这步，但是用这步会效果更好。
注意：
母液稀释到60%只是参考，具体实验室不同可能略微有差别，要摸条件而不是死记硬背。
另外皮层和海马浓度也稍微有差别。
有些文献曾经报道，在梯度一定的情况下，一些特定梯度可以分开神经元和少突和其他胶质细胞，但是笔者从来没成功过。
10.种板。
这一步没有那么非常重要，但是如果没认真弄，浓度的不均一也会使得整个实验失败。
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