热原检测及其消除方式讨论.docx

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热原检测及其消除方式讨论

热原检测方法及其消除方式讨论

[摘要]本文较深入探讨了热原的本质及其作用机理，由此对多种检测方法和消除方式进行分析。

其中，检测方法有家兔法、细菌内毒素检测法、单核细胞激活实验法、白细胞系法和体外人全血法；消除方式包括蒸馏法 、高温法 、活性炭吸附法 和超滤法。

新老方法并存，每一项检测方法和消除方式都有其自身的优势和缺陷。

随着科技的发展，未来热原的种类和作用机理将被研究清楚，而对应的检测方法和消除方式也将得到更新和升级。

[关键词]热原；检测；消除

100多年前,即研发了注射剂之后，非肠道医用制品中的热原对人体的危害即热原反应已经人所共知;临床上主要表现为如下症状有:

发热,寒颤,恶心,呕吐,头痛等症状。

并且，热原能够导致机体发热、腰及关节痛、肤色灰白、白细胞下降、血管通透性增强，严重者造成昏迷甚至休克、死亡。

为此，凡非肠道使用制品包括药品、生物制品（包括基因工程产品和基因治疗相关产品）和医疗器械装置（体内使用者）都应进行热原检查。

总之，为了达到药品的安全效果，对于药品的热原检测和消除是及其重要和必要。

热原及其本质

定义

热原（pyrogen）系指由微生物产生的能引起恒温动物异常升高的致热性物质。

目前,对于热原国内外仍未有完全统一的认识,但从国内外文献报道中普遍认为:

它是指细菌内毒素的脂多糖。

欧洲药典委员会副主席JVanNoordwijk提出:

“严格地讲,不是每一种热原都具有脂多糖的结构,但所有已知的细菌内毒素脂多糖都有热原活性”。

在药品生产质量管理规范（GMP）条件下，药品生产的质量控制一般可以接受的观点是:

不存在细菌内毒素意味着不存在热原。

本质

人体发热的物质有内源性和外源性两大类。

热原检测主要是对外源性的热原进行总量控制,使其对机体不产生危害的影响。

研究较多、较深人的外源性热原物质主要有2类:

即革兰氏阴性菌的内毒素和革兰氏阳性菌的脂磷壁酸。

这也是产品中常见的热原物质。

内毒素主要是革兰氏阴性菌细胞壁外表层结构成分,即多糖、脂质和蛋白组成的复合体。

其发热部位主要是脂多糖中由脂化的葡萄糖胺二糖为单位,通过焦磷酸醋键组成的一种独特的糖脂化合物，即脂质A。

革兰氏阳性菌内致热物质在最近几年才有了深人的认识。

由于一段时间内,人们虽然发现革兰氏阳性菌造成发热,但在提取后,其致热性减弱或消失阁,故一直无法确定主要是何种物质引起的发热。

2001年,经过改进提取方法困和随后的结构拆分测定,终于确认革兰氏阳性菌中与革兰氏阴性菌内毒素相对应的发热物质是脂磷壁酸。

不同革兰氏阳性菌中的脂磷壁酸结构不同,其致热活性也有很大差异图;这与不同阴性菌的内毒素致热活性不同相类似。

Dieninger等人根据金葡菌的UrA结构构建了D一Ala-IJA分子结构,其分子有6个磷酸聚甘油单位组成的骨架和龙胆二糖与酞基碳链组成的附着臂组成,相对分子质量为2248.90。

该结构中的龙胆二糖（核心）对LTA的活性影响不大;磷酸聚甘油骨架只有在D一丙氨酸存在时,可以加强脂附着端的作用;N一乙酞氨基葡萄糖基团可以忽略其作用;用L一丙氨酸取代D一丙氨酸可使其活性降低至少10倍,说明有立体异构选择性。

LTA的附着臂结构也对LTA的致热性有影响,具有2个酞基的LTA比仅有一个酞基的LTA的致热性强。

此外,随着基因工程产品和基因治疗相关产品的增多,人们也开始关注病毒类物质的致热作用,并且证明多聚核昔酸类物质确有致热活性图,但因检测方法的限制等原因,至今研究还未透彻。

二、热原发热的机理

其实，几乎所有的外源性发热物质均通过刺激免疫细胞分泌细胞因子而最终导致机体发热。

首先是外源性热原进人机体后刺激免疫细胞产生内源性热原如IL一6,NTaF、IL一1等细胞因子,这些因子通过终板血管器们直接或间接进人下丘脑视前区等中枢系统后,一方面通过升温介质和神经整合作用使体温上升（正调节）,另一方面又通过内源性解热物质作用于腹中隔（vSA）和中杏仁核（MAN）等体温负调节中枢限制体温升高（负调节）,这两方面相互作用的结果决定了调定点上移（或下移）的水平、发热幅度和时程,传统上把体温调节中枢仅局限于下丘脑视前区（PO/AH）的观点应予以修正闭。

在这些因子中,IL一6和中枢内的PG一2E被认为是介导发热的下游和终端介质。

至于一些细胞因子最终是否能通过血脑屏障直接作用于体温调节中枢,还没有确切定论。

图2显示了热原物质致发热的机理和临床表现症状。

三、热原的检测方法

1.家兔法

注射制品诞生后不久,人们就发现热原反应现象,并开始探讨、研究其检测控制的方法。

第二次世界大战中,因静脉注射输液需求量增大,客观上要求药典规定热原试验,以保证其安全性。

经过FDA、NIH和14个药厂协作研究,在1942年USP12版开始收载了家兔法。

其基本概念是每千克体重的家兔静脉注射10mL,在10而n之内,家兔不应有发热反应,亦相当于人的致热最低闭值。

当时的USP规定:

3只家兔有1只体温升高）0.6℃或3只总和>1.4℃,则重复取5只家兔试验,8只家兔中体温升高0.6℃以上的家兔不多于3只,8只兔升温总和不超过3,7℃,认为合格。

1900年美国药典委员会、美国FDA生物评价进行了一次协作研究和评价,并进而对家兔热原法提出如下修订建议:

（l）在注射药品后1一3h之间,每隔30min记录一次体温,以便能记录到最高升温点。

（2）家兔体重不影响内毒素剂量对体温的反应,故建议继续按家兔每千克体重给药计算给药剂量（在此之前,美国药典论坛曾提出,按人体每千克体重计算给药剂量）。

（3）应重新评价家兔接受了热原制品后休息14d重复使用的规定,应增加休息时间或不允许重复使用。

（4）根据人体的致热闽值5.0Eu·kg将体温升高由0.6℃降至0.5℃。

1993年UsP22版第八增补本和以后各版本均根据这一协作研究的结论,对该方法进行了较大的修订,如将家兔最高升温0.6℃的限度降为0.5℃;复试后的8只家兔升温总和不得超过3.5℃降为不得超过3.3℃度等。

其后对该检测方法及判定标准几乎没有大的变动。

因此，直到现在家兔热原检查法各国药典用于控制药品热原含量的方法，被称为“黄金法则”。

这是由于，家兔发热机制可能与人体发热机制相似:

即外致热原（如细菌、病毒、真菌等）进入人体后能刺激免疫细胞分泌内致热原（主要为细胞因子:

如IL－1β莲、IL－6TNF－α），这些炎性因子可对人体体温调定点产生直接或间接的作用，引起体温升高。

但家兔法存在固有的缺陷。

其中最大的缺陷是家兔法不能定量，结果重复性差，费用高及使用活体动物进行体内实验而产生的伦理道德问题等。

2.细菌内毒素检测法

由于家兔法仍具有检测时间长、影响因素对、成本高等局限性,所以一直以来,人们都在寻找检测热原的更为简便有效的方法。

1956年Bang发现细菌悬液与赏血细胞溶解产物会产生凝集。

1968年,uven和Bang以此为原理,建立起盆试验法,即后来人们所称的内毒素检查法。

该法当时可检测到血浆内的0.5gn/mL内毒素浓度,其灵敏度明显高于家兔法,对于检测大输液中的内毒素非常重要。

1977年FDA制备赏试剂参考品,正式开展LAL试验。

到1980年,USP20版正式收载该方法。

BET法是以节肢动物赏的血细胞溶解物与微量细菌内毒素产生凝集反应为基础的。

该法快速、简便、可定量、可标准化、费用较低、易于推广普及,对内毒素的检测比家兔法灵敏10一100倍。

在最近的25年中被许多国家的药典收载并应用,在美国已经取代了大约50%的家兔试验。

但它的缺点在应用中也逐步显露出来,主要是

（1）该方法所用机理不能完全反映哺乳动物对热原的反应,研究发现,来自不同细菌的内毒素对哺乳动物致热活性差别很大,从没有致热性到很强致热性[,这种差异与其凝集活性的差异没有相关性,故BET法实际能够检测到的仅仅是内毒素对堂血细胞的凝集活性,而不是内毒素对人体的发热活性或化学概念上的含量。

（2）该方法对一些酶抑制剂、钙镁离子鳌合剂和内毒素以外的热原物质很难进行检测。

（3）现代研究也发现,某些制品,尤其是生物制品和抗生素，与内毒素之间还存在协同作用，而这种协同作用是内毒素法无法检测到的。

但随着国际间的协作、协调研究的进行,现在细菌内毒素测试法已经基本协调统一了。

并且因内毒素在自然界普遍存在,在注射液中比其他热原物质往往更容易存在,毒性更大而且稳定,所以该检测方法至今被广泛使用。

因此，细菌内毒素法则只能特异性地检测出革兰氏阴性菌来源的细菌内毒素，不适用于检测其他种类（如革兰氏阳性菌、真菌来源）的热原物质;对成分复杂的品种（如蛋白、疫苗、中药注射液等）应用范围有限;鲎资源的日趋贫乏。

3.单核细胞激活实验法（检测疫苗类生物制品）

目前，《英国药典》、《欧洲药典》均已收录了单核细胞激活实验，用于热原检测。

其中对热原敏感的HL-60单核细胞进行激活实验，可以实现HL-60单核细胞激活实验与《中国药典》收载的内毒素检测方法测定结果一致。

该方法适用于流感疫苗、冻干甲型肝炎减毒活疫苗、冻干人用狂犬病疫苗、麻腮风联合减毒活疫苗、麻疹腮腺炎联合减毒活疫苗、双价肾综合征出血热灭活疫苗和A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗这7类疫苗热原的检测。

该方法作为家兔法和细菌内毒素法两种经典热原检测方法的补充方法，不仅检测热原的种类多，而且该方法灵敏度高，可以对热原进行定量检测。

但该方法仍存在检测成本较高，对细胞的要求较高等不足之处。

4.白细胞系法

（1）THP一1细胞法

THP一l细胞是一种人源单核细胞系,来源于急性白血病病人的外周血中。

用该细胞检测热原物质具有灵敏度高、可定量、能检测出的热原种类多、应用范围比较广、不涉及使用实验动物的优点。

（2）MonoaM一6细胞法

Mon0MaC一6（简写为MM6）细胞与其他单核细胞相比是一种更加成熟的细胞}，并且是唯一能表达功能和表型特征的成熟单核细胞,来源于单核细胞性自血病病人的外周血中。

研究发现MM6细胞也可用于热原检测,该方法具有灵敏度高、可用于检测的热原种类多、应用范围广、可定量、方法稳定性高的优点。

从已有研究结果来看,它比THP一1细胞法有更好的可靠性。

MonoaM一6细胞法作为热原检测替代方法,该方法已得到国际上的论证和推荐。

（3）28SC细胞法

28SC细胞为人源单核细胞系,该细胞用于热原检测的特点为灵敏度高,能检测出的热原种类多,最重要的是它也能比较好地模拟人体对热原的反应。

5.体外人全血法

体外人全血法热原检测方法是近年来国内外正在研究的一种热原检测新方法，具有检测范围广泛，灵敏度高，不同个体学业的结果差异小等优点。

以体外人全血热原检测方法能检测出细菌内毒素和非内毒素两大类致热物质。

家兔法存在不易标准化、不易定量、重复性和灵敏度差、受某些药品本身的药理活性及理化性质的影响较大等缺点。

鲎实验法只能检测出细菌内毒素,对某些产品进行检查时会得出假阴性结果,此外鲎资源也非常有限。

因此研究新的热原检测方法是一种趋势。

同时研究替代家兔法和盆实验法的体外方法符合国际上提倡的“3R”（减少、优化、替代）原则〕。

该项研究工作在国内仅是一个开端,还有很多工作需要进一步深人研究。

人全血法能检测出来源于革兰阳性菌如金黄色葡萄球菌的脂磷壁酸而鲎实验却不能。

相信在不久的将来,该方法有可能作为法定的检测方法用于药品、生物制品和医疗器械的热原检查之中。

四、热原消除方式

1.蒸馏法去除热原

热原虽能溶于水中不挥发，但有些可随水蒸气的雾滴进入注射用水中，因此制备注射用水时，原水中的热原可经蒸馏除去，但需多次蒸馏，并加有隔膜装置，单次蒸馏往往效果不理想。

2.离子交换法除去热原

溶液中的热原也可以被离子交换树脂所吸附。

用离子交换树脂吸附可除去水中的热原，并用于大生产。

离子交换树脂除去热原的原理，是因为热原物质大分子上有磷酸根与羧酸根，带有负电荷，故易被强碱性阴离子交换树脂所交换吸附。

3.酸碱处理法除热原

热原可被强酸或强碱所破坏，所以中药注射剂生产所用容器具可用酸液或碱液处理，如以重铬酸钾－硫酸清洁液浸泡或稀氢氧化钠处理，破坏热原。

4高温法

热原的耐热性能良好，60℃加热1h不被分解破坏，100℃不降解，在通常使用的高压蒸汽灭菌条件不足以破坏热原。

但180℃3～4h、200℃60min或25030～45min可热原彻底破坏。

因此耐热物品如玻璃制品、生产过程中所用的容器和其它用具以及注射时使用的注射器等，可用此法破坏热原。

5.活性炭吸附法

活性炭的多孔结构提供了大量的表面积，从而吸附杂质。

就象磁力一样，所有的分子之力，从而达到将介质中的热原吸引到孔径中，达到药液与热原的分离目的。

间都具有相互引力。

正因为如此，活性炭孔壁上的大量的分子可以产生强大的引

6.超滤法

由于脂多糖的终端结构类脂A具有较小的相对分子质量，因此需选用切割相对分子质量小于5000相对分子质量的超滤膜，才能达到分离热原药理的效果。

五、结论

截止现在，国内外热原的物质种类、结构及其对应的作用机理都未研究透彻。

因此，对应的检测方法也对应存在局限性。

其中，检测方法中的家兔法为传统方法、细菌内毒素检测法灵敏但检测的物质有局限性。

单核细胞激活实验法、白细胞系法和体外人全血法作为新的检测方法，虽然相比家兔法和鲎试剂法优势多，但是目前也仍然还在研究阶段，还未得到大的推广；消除方式的蒸馏法 、高温法 、活性炭吸附法 和超滤法多种方法联用，更能加大热原的消除率。