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线粒体与细胞凋亡调控

土上I」I1I比g

线粒体与细胞凋亡调控

朱玉山1,佺陈1,2*

（1南开大学生命科学学院,天津300071;2中国科学院动物研究所,

生物膜与膜生物工程国家重点实验室，北京100101

摘要:

细胞凋亡是一个受到一系列相关基因严格调控的细胞死亡过程。

线粒体是细胞凋亡调控的活动中心。

在凋亡因子的刺激下，线粒体释放出不同促凋亡因子如细胞色素C、Smac/Diablo等激活

细胞内凋亡蛋白酶Caspasa我们发现，活化后的Caspase可以反过来作用于线粒体,引发更大量线粒体细胞色素C的释放，构成细胞色素C释放的正反馈调节机制,从而导致电子传递链的中断、膜电势的丧失、胞内ROS的升高以及线粒体产生

ATP功能的完全丧失。

Bcl-2家族蛋白在细胞色素C释放和细胞凋亡调控中起关键作用。

关键词:

线粒体;细胞色素C;细胞凋亡；Caspase;Bcl-2中图分类号：

Q244;Q255文献大标题:

Mitochondriaandapoptosisregulation

ZHUYu-shan1,CHENQuan1,2*

（1CollegeofLifeSciences,NankaiUniversity,Tianjin300071,China;2NationalKeyLaboratoryofBiomembraneand

MembraneBiotechnology,InstituteofZoology,ChineseAcademyofSciences,

Beijing100101,China

Abstract:

Apoptosisisahighlyregulatedformofprogrammedcelldeath,whichplaysakeyroleinthedevelopmentandhomeostasisofmulticellularorganisms.Mitochondriaplayacentralroleintheregulationofapoptoticcelldeath.Upondeathstimuli,differentapoptogenicfactorssuchascytochromecandSmac/Diabloarereleasedduringtheearlystagesofapoptosis.Asmallamountcytochromecmaybesufficientforactivatingcaspases.Onceactivated,caspasescanpositivelyfeedbacktoattackmitochondrialeadingtoamoreprofoundlossofcytochromecandconsequentlymitochondrialdysfunction.Thiscaspase-mediatedlatestageofcyto-chromecreleasecausesthecompletedisruptionofmitochondrialelectrontransportchain,leadingtotheincreaseincellularROSandcompletelossofATPgeneration,latestageofapoptoticeventsorsecondarynecrosis.Bcl-2anditsfamilyproteinsareimportantforregulatingcytochromecreleaseandapoptoticprocesses.Keywords:

mitochondria;cytochromec;apoptosis;caspase;Bcl-2

文章编号：

1004-0374（200804-0506-08

收稿日期:

2008-07-17

基金项目：

“97项目（2006CB910102国家自然基金项目（30630038&30400098;科学院知识创新项目（KSCX2-YW-R-02

*通讯作者:

E-mail:

chenquan@

细胞凋亡（apoptosis是'程序性细胞死亡（programmedcelldeath的一种形式之一，是细胞一种生理性、主动性的细胞自杀行为”。

细胞程序化死亡最早是由

Lockshin和Wiliams在1965年提出。

随后在1972年Kerr等从形态学的角度描述了细胞的生理死亡，并将这种细胞死亡命名为凋亡（apoptosis细胞凋亡是机体在生长、发育和受到外来刺激时清除多余、衰老和受损伤的细胞以保持机体内环境平

衡和维持正常生理活动过程的一种

自我调节机制。

这种调节机制的异常与多种疾病的发生有关,如癌症的发生与细胞凋亡的抑制有关，而老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关。

目前对细胞凋亡的研究已经涉及到肿瘤生物学、发育生物

507第4期朱玉山，等:

线粒体与细胞凋亡调控

学、神经生物学、免疫生物学等方面，已经取得很多突破性的成果。

2002年诺贝尔生理学或医学奖分别授予来自英国的SydneyBrenne、来自美国的H.RobertHorvitz和来自英国的JohnE.Sulston以表彰他们发现了在器官发育和程序性细胞

死亡”过程中的基因调控。

1线粒体与细胞凋亡

细胞凋亡受到一系列相关基因严格调控。

不同的凋亡信号在细胞中引发不同

的凋亡信号转导通路。

根据凋亡信号的来源可以将细胞凋亡信号转导通路分成两

条:

外源通路（死亡受体通路和内源通路（线粒体通路。

这两条通路最后都汇集于下游的效应Caspase即凋亡蛋白酶Casapse的激活。

活化Caspase在细胞中能够切割400多种底物，如Lamins、信号分子如蛋白激酶、骨架蛋白、DNA修复酶以

及包括调控mRNA剪切、DNA复制的功能蛋白。

这些重要蛋白质的降解和核酸酶的激活最终导致细胞凋亡［1］。

线粒体是细胞的能量工厂，是真核细胞生存的基础。

越来越多的实验证据表明，线粒体是细胞凋亡调控的活动中心。

线粒体在细胞凋亡中的作用主要表现为［2］:

第一，在凋亡发生过程中，多种促进细胞凋亡的蛋白转移至线粒体，从而使线粒体膜的通透性和完整性受到破坏。

由于内膜对氢离子的通透性增加引起线粒体膜电位

消失；Bcl-2家族蛋白主要通过调节线粒体的功能来调控细胞的凋亡；第二，有多种凋

亡诱导因子从线粒体释放，如细胞色素C（cytochromecAIF（apoptosis-inducingfactor、Smac/Diablo（secondmitochondria-derivedactivatorofcaspase/directIAPbindingproteinwithlowpI和Caspase前体蛋白procaspase-2,-3,-8和-9等在凋亡发生过程中从线粒体膜间隙被释放到细胞质中，随后引起典型的凋亡变化；第三，有一

些凋亡诱导物能够诱导线粒体上的膜透过性转变孔（permeabilitytransitionpore,

PTP开放,导致线粒体膜电位消失和释放促凋亡蛋白。

由于诱变剂、化疗药物和电离辐射造成细胞内不可修复的基因组损伤会激活

凋亡的内源通路，即线粒体通路。

线粒体这种特殊的细胞器在其中起着关键性的调

控作用。

在多种形式的刺激信号作用于线粒体后,将会引起线粒体释放细胞色素C

［3］、AIF［4］、Smac/Diablo［5］和procaspase-2,-3,-8和-9［6,7］等促凋亡因子。

最新研究发现，线粒体在凋亡发生时还可能释放一种核酸内切酶endonucleaseG［8,9］Endo-nucleaseG的相对分子质量为26k,以同源二聚体形式存在并行使其功能，它能选择性地在鸟嘌呤富集区（dGn（n=9切割DNA双链。

细胞色素C从线粒体被释放出来后，与Apaf-1（apoptosisproteaseactivatingfactor-1在ATP/dATP存在下发生构像变化并形成巨大的复合体（700k/1.4M,称为

凋亡体（apoptosome同时凋亡体吸引Caspase-9前体加入该复合体，Caspase-9前体聚合后被反式催化激活。

活化的Caspase-9继而作用于下游的效应Caspase（Caspase-3,-和-7，引起细胞凋亡。

AIF是一种不依赖于Caspase的凋亡效应因子，当它从线粒体释放出来，并从细胞质移位至细胞核时，会引起染色质凝集，并将DNA降解为50Kb的大片断［6,7,10-13］。

在细胞中还存在一些抑制凋亡蛋白IAP（inhibitorofapoptosisproteins,它们可以

与细胞色素C和Apaf-1激活的Caspase-9结合，并且阻止活化的Caspase-9激活Caspase-3前体蛋白，使凋亡不能进行下去。

Smac/Diablo在凋亡发生时与细胞色素C一起被释放，它能与IAP等抑凋亡蛋白结合，释放Caspase-9,Caspase-随后激活Caspase-3使凋亡进行下去。

另外，这些IAP蛋白不但能抑制Caspase的活性，而且能介导Caspase在细胞内的降解过程,维持Caspase在细胞内的合适含量，可防止由于细胞中少量Caspase的意外激活而导致的细胞凋亡［14］。

内源和外源两条凋亡通路并不是孤立存在的，它们互相之间存在着交流（crosstalk。

细胞膜上的死亡受体与配体结合后引起Caspase-8勺激活,活化的Caspase-8能切割Bid。

Bid是Bcl-2家族中的一种促凋亡蛋白，切割后产生的羧基端片段

（tBid可以转移到线粒体，与线粒体外膜结合并随后引起线粒体释放细胞色素C等促凋亡物质，从而引发典型的凋亡反应［15,16］。

2线粒体细胞色素C释放

线粒体是调控细胞凋亡的中心，细胞色素C释放是线粒体凋亡途径的标志事件。

关于细胞色素C释放的机制，目前有不同的假说，但尚无定论。

第一种是Bax依赖的线粒体外膜通透模型。

鉴于Bax和Bak等在细胞色素C释放中的不可或缺的作用,有人提出Bax可以在线粒体膜上形成多聚体并形成大通道使细胞色素C

等促凋亡物质从线粒体内外膜之间释放［17,18］。

也有人提出，Bax和Bak等正常情况下能与抑凋亡蛋白分子Bcl-2/Bcl-xL/Mcl-1相互结

508生命科学第20卷

合。

而仅含BH3结构域的Bcl-2家族促凋亡蛋白tBid、Bim等能与Bcl-2/Bcl-xL/Mcl-1相互作用，使Bax/Bak等从抑凋亡蛋白游离，进而形成多聚体，促使线粒体膜通透,导致细胞色素C释放。

Shimizu等［19］认为Bax或Bak与VDAC结合后，可以调节线粒体的膜电位，并导致细胞色素C从Bax/Bak和VDAC共同形成的大通道释放，该小组应用电生理方法检测记录到了这样一个大通道的存在。

目前我们课题组

相关研究结果认为细胞凋亡时，Bax从胞浆转移到线粒体上，促使细胞色素C释放。

同时我们对Bax的激活机制研究发现，H

O2处理细胞后，明显观察到Bax从胞浆转移到线粒体上，同时伴随细胞核的破碎和皱缩。

同时，发现Bax的62位半胱氨酸是其转位所必需的，而126位半胱氨酸对其转位没有作用［20］。

也有研究报道发现Bid/tBid也可以在人工脂质体或平面膜上形成通道，Bid/tBid形成的通道有可能参与Bid/tBid诱导的线粒体释放细胞色素C的过程［21,22］。

尽管如此，我们还观察到，在Bax/Bak缺失的细胞中，棉酚仍能诱导细胞色素C释放，很可能是通过诱导Bcl-2构象变化来促进线粒体细胞色素C释放。

这说明Bax和Bak对线粒体细胞色素C释放不是绝对必需的。

第二种模型

认为,PTP参与的外膜破裂,PTP开放使线粒体肿胀，外膜破裂,引起内外膜间细胞色素C释放。

3Bcl-2家族蛋白与细胞凋亡

在细胞凋亡过程中,Bcl-2家族蛋白起着至关重要的调节作用。

对于Bcl-2家族蛋白的研究是细胞凋亡研究领域中最为热门的课题之一。

Bcl-2、Bcl-xL等细胞凋亡负调因子在许多类型的细胞受到外界刺激时能保护细胞免于凋亡。

它们主要定位在核膜的胞质面、内质网及线粒体外膜上。

其疏水

性C末端定位于细胞内膜系统上，而N末端朝向细胞质。

与膜的结合对于其发挥功能是极其重要的。

实验表明，失去膜定位能力的Bcl-2蛋白的抗凋亡能力减弱了许多［23,24］。

BH4结构域是Bcl-2等抗凋亡蛋白所特有的（Bcl-Xs除外。

虽然BH4不是形成二聚体所必需的区域，但它的缺失或使蛋白质丧失功能，或产生一个促凋亡而不是抗凋亡的突变体［25］。

这说明BH4对于Bcl-2或Bcl-xL发挥其抗凋亡功能是必需的。

线粒体膜上的Bcl-2至少在三个水平上发挥功能来抑制凋亡:

（1主要通过与Bax/Bak相互作用来抑制细胞凋亡；Bax是一种可溶性的蛋白分子，主要位于细胞质中，但当凋亡发生时，它能从胞浆转移到线粒体并与线粒体膜相结合［26］。

实验证明,位于线粒体膜上的Bcl-2能与Bax相互作用，而后者也必须在线粒体上才能发挥其诱导凋亡的作用。

同时把微量的重组Bax加入到分离的线粒体中能够诱导细胞色

素C的释放和Caspase激活，而只含有Bax的BH3结构域的多肽则没有这种功能。

Bax与Bcl-2相反,能促进PTP开放,并促进线粒体促凋亡因子的释放，Bax的促凋亡作用能被Bcl-2所抑制。

并且，只有定位于线粒体上的Bcl-2和Bcl-xL才能拮抗Bax蛋白和阻止细胞色素C释放、Caspase激活和凋亡，Bcl-2?

TM则无此功能［27］;（2Bcl-2能改变线粒体巯基的氧化还原状态来调控线粒体膜电位从而调控细胞

凋亡。

在细胞凋亡过程中，线粒体的巯基可能组成了胞内氧化还原电位的传感器，Bcl-2可能是通过抑制谷胱甘肽（GSH的外泄，降低胞内的氧化还原电位来抑制细胞凋亡的；（3Bcl-2能通过抑制PTP开放来抑制促凋亡蛋白从线粒体中释放，从而保护细胞免于凋亡；有证据显示,Bcl-2还能将凋亡蛋白前体Apaf-1等定位至线粒体膜上，使其不能发挥促凋亡作用。

通过质膜研究发现Bax能够在脂质双层形成孔道,促进脂质体包埋的荧光素释放,同时这一过程被Bcl-2所抑制。

Narita发现在分离的线粒体体系下，Bax和Bak与PTP的组分VADC结合而促进细胞色素C释放，细胞色素C释放会引起如膜电势的丧失、细胞器的肿大等典型的PTP改变。

上述过程都是线粒体依赖的和能够被CsA和Bongkrekicacid所抑制，抗VADC抗体也能够抑制Bax诱导的细胞色素C的释放和膜电势的丧失。

也有研究发现与以上结果相反通过镁离子促进介导细

胞色素C的释放。

以上研究说明体内存在至少有两种不同的细胞色素C释放机制：

一种是钙离子介导的并被CsA抑制的途径，另一种是Bax依赖和镁离子介导而非CsA所抑制的途径［28］。

许多实验结果证明,Bax在凋亡信号诱导下可以发生构像变化（conformationalchange从而能够直接结合到线粒体上形成Bax寡聚体孔道，诱导细胞色素C释放［29-31］。

据报道，全长的Bid和经Caspase-8切割形成的tBid能够诱导Bax发生构像变化,而Bcl-2则能够通过与Bax竞争结合形成异源二聚体抑制细胞凋亡。

Bax和Bcl-2之间尽管存在着竞争,它们也可能独立地调控细胞凋亡。

4Caspase的活化与线粒体结构蛋白

最近的研究表明，活化的Caspase-3可以反过

509第4期朱玉山，等:

线粒体与细胞凋亡调控

来作用于线粒体，引发线粒体细胞色素C的释放，细胞色素C经Caspase级联反应又可以激活Caspase-3构成细胞色素C释放的正反馈调节机制［32,33］。

我们最近发现线粒体复合物III的一个亚基能够被活化的Caspase-3特异性切割介导细胞色素C的释放。

线粒体细胞色素C释放会促进相应的Caspase激活，同时激活的Caspase直接攻击线粒体，进一步引发更多的促凋亡因子从线粒体释放，从而形成凋亡信号的正反馈。

线粒体在这里成为细胞凋亡信号的放大器。

我们以前的实验结果显示，在凋亡早期只有少量的细胞色素C的释放，线粒体保持氧化磷酸化功能，提供凋亡需要的能量；一旦Caspase激活后反馈攻击线粒体从而导致更多的线粒体细胞色素C释放到胞浆中，导致凋亡信号放大，细胞线粒体功能丧失和细胞死亡。

Ricci等［34］发现线粒体复合物I的一个亚基p75能够被Caspase-3切割为相对分子质量为47k和28k两个片段，进而影响细胞色素C的释放和ROS的产生。

颗粒酶A能够通过切割新线粒体复合物I的亚基-基质蛋白NDUFS3作用于线粒体,从而介导线粒体ROS的产生和膜电势的丧失，特异性表达到其突变体能够抑制颗粒酶A诱导的细胞凋亡，但是颗粒酶B却能够使之诱导凋亡［35］。

凋亡的过程是通过激活如Caspase-3,-7（executionercaspa和相应底物的切割过程。

因此,凋亡过程中的核心事件就是Caspase底物的切害叽研究主要集中在理解Caspase如何识别底物、如何切割以及如何导致凋亡表型。

目前已经知道

大约有400个蛋白被证明是Caspase的底物并被其切害叽通过正常细胞与凋亡细胞2D胶比较会发现几百个变化蛋白点。

虽然这些蛋白不能够完全证实是Caspase

的靶点，但是这种蛋白质组学的方法已经证实其中有很多是Caspase的底物［1,36］。

虽然目前很多蛋白被证明是Caspase勺底物并被切割，但是有些蛋白在凋亡过程中并不被切割或者很晚才被切割，以及不同细胞结果不同。

如f-actin只有在卵巢癌细胞才被切割，在其他细胞并没有被切割。

同时，切割位点并不是非常保守的，如CylinA在蟾蜍的卵母细胞凋亡过程被切割但是其他哺乳动物细胞并没有发生；还有些蛋白如DNase-X蛋白序列中含有一个或者多个经典切点，但是在凋亡细胞中尽管有大量的Caspase激活也不能够被切害叽而且，多数蛋白如果首先被Caspase切割，其他位点也会被其他蛋白酶切割。

例如Acinus被Caspase-3切割是非常必要但又

不足以激活DNA凝集活性，为使之全部激活需要一个附加且仍然不知道的丝氨酸蛋白酶的参与，只有把二者结合起来才能产生成熟的片段进入细胞核发生核固缩。

4.1Caspase底物与细胞形态变化许多蛋白为什么被Caspase切割原因是

不清楚的，但是有时一些蛋白水解是与细胞死亡的形态变化紧密联系的。

典型的例

子是DNase抑制子ICAD,Caspase-3切割ICAD之后激活CAD核酸酶介导凋亡的

DNA片段化，另外Acinus与Helicard（DNA螺旋酶的切割后发生染色体凝集和细胞核重塑;其他如GeIsonlin和激酶ROCK-1、PAK2的切割与典型的形态——膜出芽有关，Gelsonlin被Caspase-3切割产生一个相应活化片段使F-actin去寡聚化，而无Gelsonlin表达中性白细胞凋亡过程中表现膜出芽显著延迟，说明膜出芽需要Caspase激活Gelsonlin介导的actin识别。

Caspase也可以切割激活ROCK-1导致Myosin轻链的磷酸化而最终产生膜出芽。

Caspase可以切割破坏细胞骨架蛋白如中间纤维cytokeratin-18和Vimentin,或

者GAS2和Plectin,这些蛋白都与纤维组织有关。

这种切割会导致凋亡细胞形状改

变。

有研究报道Caspase攻击大脑皮层actin网络如Fodrin和中心黏附复合物

胞浆基质中的肌动纤维和膜蛋白。

这些中心黏附复合物有Cas和Paxillin,这些蛋

白的切割与细胞收缩、细胞吸附和极其重要的阻断抗凋亡整合蛋白信号传导密切