膜蛋白的提取与分离.docx

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膜蛋白的提取与分离

膜蛋白的提取与分离

膜蛋白的分离

一、简介：

1细胞质膜资料

1895年,Overton从研究细胞透性得出"细胞膜由连续的脂类物质组成"。

1925年Gorter&Grendel:

用脂单分子膜技术测定细胞膜中脂分子的总面积，提出：

"细胞膜是由双层脂分子组成"。

1935年Danielli&Davson：

从测定膜的表面张力得出细胞膜的"三明治结构模型"，即蛋白质－脂-蛋白质。

1959年Robertson:

用电镜观察生物膜提出"单位膜模型"，将膜的分子结构与超微机构统一起来

厚度：

2（暗）+3.5（亮）+2（暗）=7.5

细胞质膜的主要功能概括如下：

（1）为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境;

（2）选择性的物质运输，包括代谢底物的输入与代谢产物的排除，其中伴随着能量的传递；

（3）提供细胞识别位点，并完成细胞内外信息跨膜传递；

（4）为多种酶提供结合位点，使酶促反应高效而有序地进行；

（5）介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接;

质膜参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构。

2膜蛋白

虽动物细胞主要有9种膜脂，而膜蛋白的种类繁多，多数膜蛋白分子数目较少，但却赋予细胞膜非常重要的生物学功能。

根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为两大类型：

外在膜蛋白、内在膜蛋白。

（1）外在膜蛋白为水溶性蛋白，靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合，因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来，膜结构并不被破坏。

（2）内在膜蛋白与膜结合非常紧密，一般讲只有用去垢剂（detergent）使膜解后才可分离出来。

获得大量有生物学活性的质膜蛋白对我们显得非常的重要。

附注：

使用分级抽提方法获得的“膜蛋白”中只有很少一部分是具备多跨膜区的整和膜蛋白，膜蛋白，到目前为止，仍然是蛋白组学的一个瓶颈，不管采用２－Ｄ技术也好，ＩＣＡＴ乃至proeinmicroarray都还不能有效解决这一问题。

2、蛋白抽提

3、谈及蛋白分离，我们想到：

超速离心，盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法……有时这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化。

由于蛋白质种类繁多，不同的蛋白质由于结构和组成的差异，其溶解度也各不相同.根据蛋白质的溶解特性，同时可选择不同的溶剂提取，分为水溶液提取和有机溶剂提取.

4、但是针对膜蛋白的提取与细胞质蛋白，核蛋白提取不同之处在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等，最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。

膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂，一般常用的有胆酸盐，CHAPS（一种离子去污剂），Emulgen和Lubrol等表面活性剂。

5、1、分离膜蛋白的方法（原则性）：

6、1）先分离膜，然后提取；如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎，然后通过剃度离心得到含有膜蛋白的粗组分。

（例如：

michael11液氮研磨组织，加入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂。

差速离心。

蔗糖密度梯度离心。

收集37%与41%间的成分，即为质膜部分。

裂解即可收集膜蛋白）

7、2）用特殊的去污剂选择性的分离。

从膜上提取蛋白有许多困难.在多数情况下，都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来，然后将蛋白质稳定.去垢剂的选择通常是依据他对所需要蛋白质的提取效率来确定，但在某些情况下，还要考虑到以后的纯化步骤.虽然许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化，但最终仍可能需要除去去垢剂.这常常会引起蛋白质失活，但如果蛋白质是用于测序的，他将不是一个问题.如果不是用于测序的，可考虑使用能够黏附去垢剂的疏水珠.许多文献和生化试剂供应商的产品目录中，都介绍有许多种不同的可用来溶解膜蛋白的去垢剂.然而，他们并不是普遍适用的.在设计膜蛋白溶解方案时，必须考虑某一去垢剂的特殊性质.如tritonX-100在280nm处有吸收，如果某蛋白质的测试与280nm处的吸收有关，就应避免使用这类去垢剂.

8、将膜制剂与胞质蛋白及细胞核分离后，再进一步从细胞膜制剂中将所需的膜蛋白增溶下来.这种做法的好处是可以用强烈的去垢剂提取细胞骨架的相关蛋白，而无需考虑胞质蛋白、细胞核成分或染色质成分的混入.使用这种方法所获得的膜蛋白，无论在种类上还是数量上，都比酸溶解法所得到的蛋白（<5000Da）要多.一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白总量的不足0.1%，所以充分的膜蛋白的提取，无疑对于研究膜蛋白的结构和功能都是非常重要的.第二种方法简单，可靠，但有时含有其他蛋白。

一般的都是利用4度时所有的蛋白质原则上都溶于TritonX114水溶液，在温度超过20度时，此溶液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。

利用此性质可提取膜蛋白。

9、3）膜蛋白色谱（ChromatographyofMembraneProtein,CMP）CMP+分离强疏水性蛋白、多肽混合物的层析系统，一般有去垢剂（如SDS）溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。

羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团（P-端），又具有阳离子钙（C-端），与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS结合量有关。

利用原子散射法研究cAMP的分离机制发现，样品与SDS结合后在离子交换柱上存在SDS分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换，从而达到分级分离的目的。

10、层析柱提取（参步骤）

11、

12、4）顺序抽提法：

根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。

用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；把未溶解的pellet用标准液溶解提取高疏水性蛋白；最后用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后可以再次抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白。

13、5）centrifugalproteinextraction.

离心的

原理：

高渗的蛋白裂解液让细胞溶涨破裂后，超高速离心

评价：

尽管分级（胞浆和胞膜）之间有清洗的步骤,但是可溶蛋白组分和膜蛋白组分之间仍然有不少重复的点.该方法相较MOLLOYMP教授在1998年electrophoresis上发表的分级抽提法减去了第一步（用tris抽提水溶性蛋白）和最后一步（极难溶蛋白）,在操作上也作了简化,总而言之是一种不错的方法。

（codegreen）

6）detergent-based：

提取时先裂解液裂胞膜（选用不同的去污试剂是关键），梯度离心分离细胞器（ER），然后分级抽提方法。

例如，去掉细胞器之后的DEBRIS就是核膜，再裂解得到核膜蛋白。

而膜蛋白是裂胞膜时不溶的部分。

总的感受：

细胞的量要很充足。

之后的定性鉴定常用的方法有双向免疫扩散、免疫电泳及聚丙稀酰胺凝胶电泳等。

纯化蛋白质浓度的定量测定可用双缩脲法、酚试剂法或紫外光吸收法定量鉴定膜蛋白，方便迅速。

到目前为止，提取膜蛋白仍然是蛋白学的一个瓶颈。

2、分离膜蛋白的方法（操作）

1）分离细胞膜蛋白的方法：

1冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液A中，于室温与液氮罐中反复冻融2次。

25000转4度离心，驱除核及未裂解的细胞。

3取上清12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液B中。

412000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液C中提取后测蛋白浓度,SDS-PAGE电泳，分装后-20度保存备用。

bufferA:

1mMkcl,5mMNacl,3mMMgcl2,50mMHepes,1mMDTT,0.5ug/mlLeupeptin,20uMpmsf（PH=7.4）

bufferB:

1mMkcl,5mMNacl,3mMMgcl2,50mMHepes,1mMDTT,0.5ug/mlLeupeptin,20uMpmsf（PH=7.4）1mMEGTA

bufferC:

0.5ug/mlLeupeptin,20uMpmsf,50mMTris-cl（PH=7.0）,

2）分离细胞膜蛋白的方法：

1、细胞放在冰上，去除上清，用pH7。

4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次

2、加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min

3、刮下单层细胞，4度下10000g5min离心

4、溶液37度水浴10min以分离水相和去污剂相，然后37度下2000g离心5min

5、收集水相留作分析

6、用500ul冰冷的bufferC溶解去污剂相沉淀，冰浴2min后加温，在按步骤6再次离心

7、按步骤8再次抽提去污剂相，用bufferC将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积

8、用等量的bufferA分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验

试剂：

1、2%tritonX114:

2%TritonX114、50mmol/LTrisHCl（pH7。

5）、蛋白酶抑制剂

2、缓冲液A（含0。

5mol/LNaCl的RIPAbuffer）

3、bufferC

10mmol/LTrisHCl（pH7.5）

150mmol/LNaCl

5mmol/LEDTA（PH7.5）

3）分离细胞膜蛋白的方法：

7Murea

2Mthiourea

4%chaps

2.5%sb3-10

1000000个细胞，可用此buffer1ml。

冰浴匀浆。

冰上置30分钟。

4度高速低温离心30min。

取上清-20保存。

4）分离组织膜蛋白的方法：

1、取组织，加入10mlBufferA于冰上充分匀浆。

2、J6-HC离心机800rpm，4℃离心10min后，所得上清液转入超速离心管。

3、100000g，4℃离心1hr。

弃去上清，沉淀用适量的BufferB重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管，Eppendorf台式离心机10000rpm，4℃离心30min。

4、收集所得上清液即为膜组份。

BufferA：

0.32M蔗糖，5mMTris-HCl（PH7.5），120mMKCl，1mMEDTA,1mMEDTA,0.2mMPMSF,1ug/mlLeupeptin,1ug/mlPepstatinA,1ug/mlAprotinin。

冰上预冷。

BufferB：

20mMHEPES（PH7.5），10%甘油，2%TritonX-100,1mMEDTA,1mMEDTA,0.2mMPMSF,1ug/mlLeupeptin,1ug/mlPepstatinA,1ug/mlAprotinin。

冰上预冷。

5）分离组织膜蛋白的方法：

RIPA

1XPBS

1%NP40

0.5去氧胆酸钠

0.1%SDS

以下用时加入

10mg/mlPMSF异丙醇（终浓度10ul/ml）

Aprotinin（30ul/ml）

1000mMSodiumOrthovandate（10ul/ml）

冰冻组织100mg/细胞1000000个，可用RIPAbuffer1ml。

冰浴匀浆。

冰上置30分钟。

4度高速离心30min，20000转低温离心最佳。

取上清-20保存。

6）分离细菌膜蛋白的方法：

①于20ml营养肉汤中过夜培养细菌，37℃，200rpm。

②10000g、20min、4℃离心，去上清。

③20ml预冷的Tris-Mg缓冲液重悬，同样条件离心，再重悬于预冷的Tris-Mg缓冲液。

④超声波破碎细菌。

⑤3000g，10min、室温下离心去除未破碎细菌。

小心吸取上清（含有胞质成分和细菌外被成分）。

⑥超速离心I：

100,000g，60min，4℃，去除上清（胞质成分），收集细菌外被成分。

⑦用10ml含2％的SLS的Tris-Mg缓冲液重悬沉淀物，室温温育20-30min。

⑧超速离心II：

70,000g，60min，室温沉淀收集外膜蛋白，去除上清（含细胞质膜）。

重复⑦、⑧两步。

⑨充分吸除上清，并根据沉淀体积大小用0.1-0.2ml的ddH2O重悬沉淀物。

根据公式：

蛋白浓度（mg/ml）=1.450D280-0.740D260测定外膜蛋白浓度，调节蛋白浓度至40ug/ul，该蛋白质样品-70℃贮存。

试剂

①Tris-Mg缓冲液

10mMTris-Cl

5mMMgCl2

pH7.3，4℃保存

②2%（w/v）十二烷基肌氨酸钠（SLS）

7）来源于MethodsEnzymology（1974）

1.取一定量酶处理的细胞，用匀浆器破碎，操作要温和，使细胞膜保持完整。

由于水与膜的疏水部分之间有反应，因此要精确掌握分离介质中的离心强度和渗透压，以每克细胞湿重加40ml介质。

2．用Potter-Elvehiem匀浆器，杆与壁间间隙0.5～0.6μm,14.4kr/min上下匀浆4～6次，每次5S。

3．过滤匀浆液，150g离心10min，保留上清，沉淀部分加入50μl介质，用匀浆器1kr/min匀浆3次，150g离心10min，沉淀部分再加入上次匀浆的上清液。

4．合并3次上清液，2kg离心10min，弃上清，沉淀部分溶于100μl介质，离心10min，弃上清，留沉淀。

5．将沉淀部分加入70%蔗糖15份，然后分别置于三个离心管中，上面依次叠加54%、49%、45%，41%，37%蔗糖溶液各2、2、5、5、3份。

6．700kg离心90min，分离介质在1.16～1.18之间形成介面。

7．收集d为1.16～1.18g/ml之间的细胞膜，加30倍的介质以2.5kg离心10min，洗涤2次。

8．保存于2.7mmol/LTris-HClpH7.5缓冲液中，用于细胞膜的研究分析

8）常用的制备粗制质膜组分的方法：

（所有操作都在4摄氏度下进行）

1.在冰冷的匀浆缓冲液中切碎组织块，倒出血水。

用匀浆缓冲液漂洗组织碎块，并将它们置于冰上，重复上述操作，直至组织碎成1mm3大小的碎片，且无可见的血。

2.加入5倍（体积比）与组织块体积的缓冲液，再置于冰浴的Dounce氏玻璃匀浆器中，抽研10-20次，匀浆组织。

3.匀浆4摄氏度600g离心10min，上清含细胞膜、线粒体和细胞溶胶。

沉淀中有未破碎的细胞及细胞核。

弃沉淀。

4.上清4摄氏度8000g离心10min，沉淀线粒体。

弃沉淀。

5.上清4摄氏度10000g离心20min，弃上清。

6.用匀浆缓冲液重悬沉淀，继续匀浆，再次4摄氏度，10000g离心20min，弃上清。

7.用小体积的适宜缓冲液重新彻底匀浆沉淀。

8.粗制的样品可于干冰/乙醇中速冻，保存于-80摄氏度。

9）用特殊的去污剂选择性的分离。

简单，可靠，但有时含有其他蛋白。

原理：

4度时所有的蛋白质原则上都溶于TritonX114水溶液，但在37度时，此溶液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。

方案

1、放射性标记受试细胞

2、将标记的细胞放在冰上

3、去除上清，用pH7。

4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次

4、加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min

5、刮下单层细胞，4度下10000g5min离心

6、溶液37度水浴10min以分离水相和去污剂相，然后37度下2000g离心5min

7、收集水相留作分析

8、用500ul冰冷的bufferC溶解去污剂相沉淀，冰浴2min后加温，在按步骤6再次离心

9、按步骤8再次抽提去污剂相，用bufferC将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积

10、用等量的bufferA分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验

试剂：

1）2%tritonX114:

2%TritonX114、50mmol/LTrisHCl（pH7。

5）、蛋白酶抑制剂

2）缓冲液A（含0。

5mol/LNaCl的RIPAbuffer）

3）bufferC

10mmol/LTrisHCl（pH7.5）

150mmol/LNaCl

5mmol/LEDTA（PH7.5）

10）植物中：

高度纯化的质膜是质膜蛋白研究的基础，制备纯化方法也很多，植物材料中以1蔗糖密度梯度离心、2水溶性双水相法、3自由流电泳等方法为主。

前两种常用。

1的产率较高但纯度不高，2是20世纪80年代发展起来的一种分离高纯度质膜的方法，经多次双水相分配即可得到高纯度质膜，近些年此方法广泛用于植物质膜的纯化。