基因家族分析套路.docx
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基因家族分析套路
基因家族分析套路
（一）
近年来，测序价格的下降，导致越来越多的基因组完成了测序，在数据库中形成了大量的可用资源。
如何利用这些资源呢？
今天小编带你认识一下不测序也能发文章的思路--全基因组基因家族成员鉴定与分析（现在这一领域可是很热奥）；
一、基本分析容
⏹数据库检索与成员鉴定
⏹进化树构建
⏹保守domain和motif分析.
⏹基因结构分析.
⏹转录组或荧光定量表达分析.
二、数据库检索与成员鉴定
1、数据库检索
1）首先了解数据库用法，学会下载你要分析物种的基因组相关数据。
一般也就是下面这些数据库了
⏹Brachypodiumdb:
.brachypodium.org/
⏹TAIR:
.arabidopsis.org/
⏹Rice Genome Annotation Project ：
rice.plantbiology.msu.edu/.
⏹Phytozome:
⏹Ensemble:
ensembl.gramene.org/genome_browser/index.html
⏹NCBI基因组数据库：
.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/?
term=
2）已鉴定的家族成员获取。
如何获得其他物种已发表某个基因家族的所有成员呢，最简单的就是下载该物种蛋白序列文件（可以从上述数据库中下载），然后按照文章中的ID，找到对应成员。
对于没有全基因组鉴定的，可以下列数据库中找：
a. NCBI:
nucleotide and protein db.
b. EBI:
.ebi.ac.uk/.
c. UniProtKB:
.uniprot.org/uniprot/
2、比对工具。
一般使用blast和hmmer，具体使用命令如下：
⏹Local BLAST
formatdb–i db.fas–p F/T；
blastall–p blastp（orelse） –i known.fas–d db.fas–m 8 –b 2（or else） e 1e-5 –o alignresult.txt.
-b:
output two different members in subject sequences （db）.
⏹Hmmer （hidden Markov Model） search. Thesame as PSI-BLAST in function. It has a higher sensitivity, but the speed islower.
Command:
hmmbuild--informatafaknown.hmmalignknown.fa;
hmmsearchknown.hmmdb.fas>align.out.
3、过滤。
⏹Identity:
至少50%.
⏹Cover region:
也要超过50%或者蛋白结构域的长度.
⏹domain:
必须要有完整的该蛋白家族的。
工具pfamdb （pfam.sanger.ac.uk/） 和NCBI Batch CD- search. （.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）.
⏹EST 支持
⏹ Blast and Hmmer同时检测到
4、通过上述操作获得某家族的所有成员
基因家族分析套路
（二）
本次主要讲解在基因家族分析类文章中，进化部分分析的容。
主要是进化树的构建与分析。
一、构建进化树的基本步骤
１、多序列比对. Muscle program.
２、Model 选择. 分别针对蛋白序列和核酸序列的模型选择程序。
ProtTest program for protein and ModelTest or Jmodetlest for DNA（user.qzone.qq./58001704/blog）.
３、算法选择。
三种. NJ, ML and BI.
４、软件选择。
MEGA （bootstrap least 1000 replicates）, phyML and Mrbayes （user.qzone.qq./58001704/main）.
５、进化树修饰. MEGA:
view->options and subtree-> draw options. Also can be decorated in word （user.qzone.qq./58001704/main）
二、具体步骤
2.1 多序列比对。
一般采用muscle。
因为 MUSCLE is one of the best-performing multiple alignment programs according to published benchmark tests, with accuracy and speed that are consistently better than CLUSTALW.
2.2 模型选择。
对于用蛋白序列构建进化树的可以采用下面命令：
java -Xmx250m -classpath path/ProtTest.jar prottest.ProtTest -i alignmfile.phy.
运行结果如下图
注意：
1）“.Phy” format. Only allow ten charaters.注意名字不能重复相同。
2）AIC:
Akaike Information Criterion framework.
3）Gamma distribution parameter （G）:
gamma shape.
3）proportion of invariable sites:
I.
2.3构建进化树
2.3.1 意义：
a聚类分析。
如亚家族分类。
像MAPKKK基因家族通过进化树可以清楚分为 MEKK, Raf and ZIK三个亚家族.
b亲缘关系鉴定。
在进化树上位于同一支的往往暗示这亲缘关系很近
c 基因家族复制分析。
研究基因家族复制事件（duplication events），两种复制事件类型常采用的标准：
Tandem duplication:
Identity and cover region more than 70% and tightly linked （Holub, 2001）.
Chromosomal segment duplication:
Plant Genome Duplication Database （PGDD:
chibba.agtec.uga.edu/duplication/）
2.3.2 进化树。
一般ML树比较准确，但应结合方法，如NJ树，相互验证。
2.3.3 进化部分分析：
KaKs计算
2.3.3.1 简单的方法. 可以使用下面的网页PAL2NAL（.bork.embl.de/pal2nal/）
2.3.3.2 标准方法：
.
a. ParaAT:
ParaAT.pl-h test.homologs -n test.cds -a test.pep -p proc –f axt –k -o output
b. KaKs_Calculator –m NG（or else） -i test.axt -o test.axt.kaks
c.分歧时间计算：
Divergenttime（T） calculation.
T=Ks/2λ. λ :
mean 5.1-7.1×10-9 .
d.Ka/Ks意义：
Ka/Ks=1.中性进化。
.
Ka/Ks<>
Ka/Ks>1.正选择。
Positively selected genes and produce fitness advantagemutations to evolve new functions.
基因家族分析套路（三）
本节主要讲基因结构分析套路
1、Motif分析
使用软件MEME，命令如下：
meme sample.fa -dna –revcomp -nmotifs 10 -mod zoops -minw 6-maxw 50>meme_htmlFormat.html
2、基因结构分布图
可以使用在线GSDS2.0：
website:
用法如下：
结果展示
3、基因结构常见统计信息：
自己excel或写程序统计
a. The number of intron andexon.
b. The splicing intronpattern inculding 0,1,2 phase.
c. The marked region. Forexample kinase domain.
d. sequence length.
e. UTR.
4、启动子分析。
：
主要做植物的：
bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/
注意事项：
a. IE brower.
b. Only one sequence for oncesearch and the length was limited in 1000 bp.
c. DNA sequence origin:
1000 or1500 bp upstream of ATG of one gene.
分析结果：
基因家族分析套路（四）
一、转录组及芯片原始数据下载
1、 GEO datesets/profile（.ncbi.nlm.nih.gov/gds ）.。
用法见下图。
GEO数据ID命名规则：
GPL->GSE->GSM.
GPL:
platform
GSE:
multiple series.
GSM:
multiple samples.
GDS ≈ GSE. Thedifference concentrated on the data labeled GDS can be analyzed for one geneonline. It is simple and easily.
The data in the sameGPL can be used to compare inexperiment
下面是在线分析转录组数据的用法：
2、EBI ArrayExpress（.ebi.ac.uk/arrayexpress/）
该数据库下载数据用法如下：
3、PLEXdb（.plexdb.org/）.
该数据库下载数据用法如下，注意用户名和密码！
4、SRA db（.ncbi.nlm.nih.gov/sra/）
5、DRA db（trace.ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/）
二、数据处理
拿到原始数据，要进行处理，才能进行后续数据分析。
1、芯片数据。
原始数据格式“.cel”格式。
以AffyMicroarray数据处理为例讲述主要的命令如下：
> library（affy）;
>library（makecdfenv）;
>library……
> barleyGenome = make.cdf.env（“barleyGenome.cdf"）
>mydata <- ReadAffy（） ##choose “.cel “ file analyzed.
>eset <- rma（mydata）;
>write.exprs（eset,file="mydata.txt"）
>design <- model.matrix（~-1+factor（c（1,1,2,2,3,3））） # Createsappropriate design matrix.
>colnames（design） <-c（"group1", "group2", "group3"） # Assigns column names.
>fit <- lmFit（eset, design） # Fits a linear model for each gene based onthe given series of arrays.
>contrast.matrix <- makeContrasts（group2-group1,group3-group2, group3-group1, levels=design） # Creates appropriate contrast matrix toperform all pairwise comparisons.
>fit2 <- contrasts.fit（fit, contrast.matrix）# Computes estimatedcoefficients and standard errors for a given set of contrasts.
>fit2 <- eBayes（fit2） # Computes moderated t-statistics and log-oddsof differential expression by empirical Bayes
>topTable（fit2, coef=1,adjust="fdr", sort.by="B", number=10） # Generates list of top 10 （'number=10'）differentially expressed genes sorted by B-values （'sort.by=B'） for firstcomparison group.
>write.table（topTable（fit2, coef=1,adjust="fdr", sort.by="B", number=500）,file="limma_complete.xls", row.names=F, sep="\t"） # Exports complete limma statistics table forfirst comparison group.
>results <- decideTests（fit2,p.value=0.05）; vennDiagram（results）
2、转录组数据处理。
原始数据格式为sra或fastq格式。
Sra可以转换为fastq然后运用下面的命令进行处理。
1）获得cleandata；
fastx_clipper :
clip adapter.
fastq_quality_filter:
base quality control.
fastq_quality_trimmer:
trim 5’ low quality bases.
2）计算RPKM.
bowtie2-buildpath/db.seq path/db
tophat db read.fastq
bam_filter path/accepted_hits.bam
samtools view -h -o output-uniq.sam output_uniq.bam
excel for calculation（low frequencyreads ≤5 were omitted ）.
3）差异表达的基因。
寻找存在差异表达的家族成员，推测其可能的功能。
有下面两种分析策略，均可采用。
a.倍数法。
对于基因家族分析，可以采用倍数法，以2倍为标准，得到上调和小的基因
b.CV值。
计算某个成员在不同处理下的基因表达变化。
CV =SD/mean.Used in differenttissues or organs anlysis.
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