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申报资料模板10
尼麦角林质量研究的试验资料及文献资料
1、试验用样品及对照品
尼麦角林（批号：
030310,030319,030328）；
尼麦角林对照品（批号:
030106；含量：
100.1%；水分：
0.19%；溶剂残留量：
未检出）；
以上均由本公司合成室提供。
2、性状
2.1外观三批样品检验结果均为白色结晶性粉末。
为便于生产控制，将本品的外观性状定为白色至微黄色结晶性粉末。
三批样品实际测定结果见表1。
表1尼麦角林外观性状检查结果
批号
外观性状
030310
白色结晶性粉末
030319
白色结晶性粉末
030328
白色结晶性粉末
对照品
白色结晶性粉末
2.2熔点按中国药典2000年版二部附录ⅥC熔点测定法测定，三批样品检验结果见表2。
表2尼麦角林熔点测定结果
030310
134.0～135.0℃
030319
134.5～135.5℃
030328
134.0～135.5℃
参照尼麦角林注册标准（X20000073），再结合本品的实际测定结果，将本品熔点规定为133～136℃。
2.3比旋度参照尼麦角林注册标准（X20000073）：
取本品适量，精密称定，加氯仿溶解并定量稀释制成每1ml中约含40mg的溶液，摇匀，照旋光度测定法（中国药典2000年版二部附录ⅥE）测定，按无水、无溶剂计算，具体测定结果见表3。
表3尼麦角林比旋度检查结果
批号
比旋度
030310
+21.07°
030319
+21.06°
030328
+21.07°
参照注册标准及样品实际测定结果，将本品的比旋度定为+20°～+23°。
2.4溶解度照中国药典2000年版二部凡例溶解度测定项下考察本品在不同溶剂中的溶解情况，检查结果见表4。
表4尼麦角林溶解度检查结果
称样量
溶剂
溶剂体积（ml）
溶解情况
结论
1.0121g
氯仿
0.50
未完全溶解
极易溶解
0.96
完全溶解
1.0028g
乙醇
10
未完全溶解
溶解
29
完全溶解
10.3mg
水
90
未完全溶解
几乎不溶
100
未完全溶解
由试验结果可知，本品在氯仿中极易溶解；乙醇中溶解；在水中几乎不溶。
3、鉴别参照尼麦角林注册标准（X20000073）制定。
3.1色谱鉴别本品含量测定采用高效液相色谱法，在含量测定项下记录的色谱图中，供试品主峰的保留时间与对照品峰的保留时间应一致，三批样品检验结果见表5。
图谱见附图2～5。
3.2红外鉴别本品的红外吸收图应与对照品的图谱一致（中国药典2000年版二部附录ⅣC），三批样品检验结果见表5，图谱见附图6～9。
表5尼麦角林鉴别检查结果
样品批号
色谱鉴别（保留时间：
min）
红外鉴别
对照品
7.317 7.300
-----
030310
7.282 7.337
与对照品一致
030319
7.267 7.347
与对照品一致
030328
7.270 7.358
与对照品一致
4、检查参照尼麦角林注册标准（X20000073）检查项下规定制定本品检查项。
4.1水分取本品，分别照水分测定法（中国药典2000年版二部附录ⅧM第一法），依法操作，测定结果见表6。
表6样品水分检查结果
批号
030310
030319
030328
对照品
费休氏法
0.21%
0.22%
0.21%
0.19%
根据注册标准及样品实际测定结果将本品的水分限度定为含水分不得过0.5%。
4.2炽灼残渣取本品约2.0g，照炽灼残渣检查法（中国药典2000年版二部附录Ⅷ N），依法检查。
三批样品检查结果见表7。
表7 尼麦角林炽灼残渣检查结果
批号
030310
030319
030328
对照品
残渣（%）
0.04
0.04
0.03
0.03
结果表明：
三批供试品的炽灼残渣均小于0.05%。
参照尼麦角林质量标准（X20000073）及样品实际测定结果，规定本品遗留残渣不得过0.05%。
4.3重金属取炽灼残渣项下遗留的残渣，加硝酸1ml，蒸干至氧化氮蒸气除尽，放冷。
加盐酸2ml，置水浴上蒸干后加水15ml，滴加氨试液，至对酚酞指示液显中性，再加醋酸盐缓冲液（pH3.5）4ml，微热使溶解，加水使成50ml，摇匀；分取25ml，依法检查（中国药典2000年版二部附录ⅧH第二法）。
与标准铅溶液1.0ml（百万分之十）、1.5ml（百万分之十五）、2.0ml（百万分之二十）制成的对照液比较。
三批样品的检查结果见表8。
表8 尼麦角林重金属检查结果
批号
检查结果
030310
大于百万分之十，小于百万分之十五
030319
大于百万分之十，小于百万分之十五
030328
大于百万分之十，小于百万分之十五
对照品
大于百万分之十，小于百万分之十五
结果表明：
三批样品的重金属含量均高于百万分之十，低于百万分之十五。
考虑到生产的可控性，将重金属检查定入质量标准草案中，参照尼麦角林注册标准，将限度适当放宽，将本品的重金属限度定为不得过百万分之二十。
4.4.有关物质
参照尼麦角林质量标准（X20000073），选择高效液相色谱法（中国药典2000年版二部附录VD）测定本品的有关物质及分解产物。
4.4.1仪器岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪，Anastar色谱工作站。
4.4.2检测波长参照尼麦角林标准（X20000073），含量测定及有关物质检查用波长为280nm，因而本研究也选择280nm波长作为本品有关物质检查的测定波长。
4.4.3色谱条件
色谱条件的确定参照尼麦角林注册标准色谱条件，采用辛烷基硅烷键合硅胶柱作为分离柱（4.6mm×250mm，5μm）；以乙腈-磷酸盐缓冲液（取无水磷酸氢二钾1.74g，加水900ml溶解后，加三乙胺1.0ml，用磷酸调节pH值至6.0，加水稀释至1000ml）（58：
42）为流动相，检测波长280nm。
4.4.4强制降解产物溶液和中间体溶液的制备及检测
称取本品适量，加流动相溶解并制成每1ml约含1mg的溶液，作为供试品液①。
4.4.4.1高温降解产物的制备量取供试品液①10ml，于80℃烘箱放置1小时；取出放冷，过滤，进样20µl，记录色谱图。
图谱见附图10。
4.4.4.2氧化破坏降解产物的制备量取供试品液①10ml，加0.02mol/L的高锰酸钾溶液2滴，于室温放置1小时；过滤，进样20µl，记录色谱图。
图谱见附图11。
4.4.4.3酸破坏降解产物的制备量取供试品液①10ml，加浓盐酸溶液2滴，于室温放置1小时；调节pH值至中性，过滤。
进样20µl，记录色谱图。
图谱见附图12。
4.4.4.4碱破坏降解产物的制备量取供试品液①10ml，加饱和氢氧化钠溶液2滴，于室温放置1小时；调节pH值至中性，过滤。
进样20µl，记录色谱图。
图谱见附图13。
4.4.4.5光照降解产物的制备量取供试品液①10ml，于4500LX光照箱内放置24小时后取出，进样20µl，记录色谱图。
图谱见附图14。
4.4.4.6 中间体溶液的制备称取本品中间体5-溴烟酸、光麦角醇及甲基光麦角醇适量与供试品液①20ml，加流动相使成适当浓度的溶液；进样20µl，记录色谱图。
图谱见附图15。
尼麦角林在高温、氧化、酸、碱、光照破坏条件下均易被破坏，各种分解产物峰均能与主峰完全分离；中间体峰与主峰分离完全；表明该色谱条件适合做尼麦角林的有关物质检查。
4.4.5系统适用性试验由光破坏色谱图可知，理论塔板数按尼麦角林计为13779；主峰与相邻杂质峰的分离度分别为2.192，1.846；不对称因子1.031。
因此规定理论板数以尼麦角林计应不低于3000，分离度应大于1.5。
图谱见附图14。
4.4.6最小检出量取尼麦角林对照品16.3mg，置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
取1ml置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，再取1ml置25ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
进样20µl，记录色谱图。
峰面积为1123。
计算得尼麦角林最小检出量为2.61ng（S/N=3）。
见附图16。
4.4.7有关物质测定法取含量测定项下的样品溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加流动相制成每1ml中约含尼麦角林10μg的溶液作为预试溶液。
照含量测定项下的方法进行试验，量取20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分峰高约为满量程的10%，图谱见附图1；再精密量取供试品溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2.5倍。
以面积归一化法计算，结果见表9。
表9尼麦角林有关物质检查结果
批号
030310
030319
030328
单个最大杂质（%）
0.159
0.154
0.154
杂质总量（%）
0.444
0.483
0.474
由检查结果表明，三批样品单个最大杂质的量为0.154%～0.159%，杂质总量为0.444%～0.483%。
4.5 有关物质限度 通过本品质量研究与稳定考察结果，单个最大杂质均未超过0.5%，杂质总量均未过1.5%。
因此参考注册标准及本品实际考察结果，将本品有关物质限度订为：
单个最大杂质不得过0.5%，杂质总量不得过1.5%。
5、含量测定采用高效液相色谱法（中国药典2000年版二部附录VD）作为本品的含量测定方法。
并采用有关物质检查项下的色谱条件进行测定。
5.1含量测定线性关系精密称取尼麦角林对照品62.6mg，置25ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度；分别取上述溶液1，2，4，5，6ml，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀；精密量取各溶液20µl分别进样，记录色谱图。
结果见表10。
表10尼麦角林线性关系考察结果
浓度（mg/ml）
0.250
0.500
1.001
1.251
1.501
A1
1964673
3981049
8071658
10013037
12081631
A2
1954836
3975645
8063063
10011007
12043526
A平均
1959755
3978347
8067361
10012022
12062579
以峰面积A对浓度C进行线性回归，得回归方程：
A=8.07×106C-51494 r＝1.0000
结果表明：
尼麦角林浓度在0.250mg/ml～1.501mg/ml范围内与峰面积有良好的线性关系。
5.2精密度试验取本品适量，加流动相溶解并稀释使成每1ml中约含1mg的溶液，进样20μl，连续测定6次，记录色谱图，测定数据见表11。
表11精密度试验数据
No.
1
2
3
4
5
6
峰面积
8357159
8345478
8348215
8317187
8315917
8304955
结果：
平均峰面积为8331485，RSD=0.26%，表明该方法精密度良好。
5.3稳定性试验取本品适量，加流动相溶解并稀释成每1ml约含1mg的溶液，分别在0、0.5、1、2、3、4小时进样，记录色谱图，考察杂质（面积归一化法计算）和主峰面积的变化情况，结果见表12。
表12 溶液稳定性试验数据
时间（h）
0
0.5
1
2
3
4
峰面积
8046686
8064919
8048789
8022845
8078423
8071082
有关物质％
0.519
0.557
0.566
0.590
0.656
0.692
结果：
平均峰面积8055457，RSD%为0.25%，供试液在4小时内有关物质由0.519增加到0.692，而2小时内有关物质变化不大，因此本品供试液在2小时内稳定，应临用新配。
5.4含量测定照高效液相色谱法（中国药典2000年版二部附录ⅤD）测定。
色谱条件与系统适用性试验用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-磷酸盐缓冲液（取无水磷酸氢二钾1.74g，加水900ml溶解后，加三乙胺1.0ml，用磷酸调节pH值至6.0，加水稀释至1000ml）（58：
42）为流动相，检测波长为280nm。
理论板数按尼麦角林峰计算应不低于3000，尼麦角林峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求。
测定法 取本品适量，加流动相溶解并稀释使成每1ml约含1mg的溶液，作为供试品溶液；进样20μl，记录色谱图；另取尼麦角林对照品适量，同法操作。
按外标法以峰面积计算，即得。
三批测定结果见表13。
表13尼麦角林含量测定数据
批号
030310
030319
030328
含量（%）
99.7
100.1
99.7
6残留溶剂检查
本品原料合成过程中可能残留的有机溶剂主要有乙醚、丙酮、二氯甲烷、四氢呋喃，为保证其使用的安全性，参照中国药典2000年版二部附录ⅧP有机溶剂残留量测定法及ICH指导原则，对本品中的有机溶剂残留进行了方法学考察。
6.1、仪器GC9790气相色谱仪；检测器：
FID检测器；载气：
高纯氮。
6.2、样品及试剂
6.2.1、样品尼麦角林原料三批，批号分别为：
030310，030319，030328；均由本公司提供。
6.2.2、试剂乙醚（分析纯）（上海联试化工试剂有限公司）
丙酮（分析纯）（上海联试化工试剂有限公司）
二氯甲烷（分析纯）（天津市天河化学试剂厂）
二甲基亚砜（色谱纯）（天津市科密欧化学试剂开发中心）
四氢呋喃（色谱纯）（天津市科密欧化学试剂开发中心）
1，4二氧六环（分析纯）（中国医药集团上海化学试剂公司）
6.3、方法学考察
6.3.1、内标溶液的制备取二氧六环适量，加二甲基亚砜制成每1ml含二氧六环10mg的溶液，作为内标溶液。
6.3.2、标准混合溶液精密称取丙酮240.6mg、二氯甲烷26.4mg，乙醚246.2mg,四氢呋喃30.8mg分别置于50ml容量瓶中，用内标溶液稀释至刻度，摇匀，作为丙酮，乙醚，二氯甲烷，四氢呋喃的标准贮备溶液；
精密量取丙酮，乙醚，二氯甲烷，四氢呋喃的标准贮备溶液5ml，置50ml量瓶中，加内标溶液稀释至刻度，摇匀，作为标准混合溶液。
6.3.3、检测条件DM-5大口径毛细管柱；检测器（FID）温度：
250℃；
柱温：
45℃
进样温度：
210℃
氮气流速：
30ml/min，氢气流速：
30ml/min，空气流速：
300ml/min。
6.3.4组分定性分析及系统适用性试验：
取丙酮、乙醚、二氯甲烷，四氢呋喃，二氧六环，二甲基亚砜蒸气各1μl进样，记录色谱图。
确定各组分的峰位。
色谱图见附图17～22。
取上述标准贮备液1ml置于10ml量瓶中，用内标溶液稀释至刻度，摇匀，取1μl注入气相色谱仪，记录色谱图，色谱图见附图23。
结果表明各组分之间能够达到较好的分离。
规定理论塔板数以丙酮计不小于1000，相临峰的分离度不小于1.5。
6.3.5、线性关系考察分别取上述标准混合溶液0.5ml、1ml、2ml、3ml、5ml，置于20ml量瓶中，用内标溶液稀释至刻度，摇匀，分别取1μl进样，记录色谱图。
以浓度C（μg／ml）为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行线性回归，结果见表14～17。
表14丙酮线性关系数据结果
浓度（μg／ml）
12.03
24.06
48.12
72.18
120.3
Area
6636
13738
29022
41936
68634
丙酮：
A=573.94C–167.68r=0.9997
表15乙醚线性关系数据结果
浓度（μg／ml）
12.31
24.62
49.24
73.86
123.1
Area
5855
11742
23481
35589
58897
乙醚：
A=479.43C–35.52r=0.9999
表16二氯甲烷线性关系数据结果
浓度（μg／ml）
1.32
2.64
5.28
7.92
13.2
Area
261
525
1018
1499
2583
二氯甲烷：
A=194.3C–2.5742r=0.9994
表17四氢呋喃线性关系数据结果
浓度（μg／ml）
1.54
3.08
6.16
9.24
15.4
Area
278
555
1152
1603
2729
四氢呋喃：
A=175.6C+19.441r=0.9989
线性试验结果表明丙酮在12.03μg／ml～120.3μg／ml浓度范围内，乙醚在12.31μg／ml～123.1μg／ml浓度范围内，二氯甲烷在1.32μg／ml～13.2μg／ml浓度范围内，四氢呋喃在1.54μg／ml～15.4μg／ml浓度范围内与其峰面积基本呈线性关系。
6.3.6、重复性试验取上述标准贮备液2.0ml，置于20ml量瓶中，用内标溶液稀释至刻度，摇匀，取1μl进样，记录色谱图。
连续测定6次，结果表明本法重复性较好。
测定数据见表18。
表18重复性试验测定结果
溶剂
1
2
3
4
5
6
平均
RSD%
A丙酮
21591
21445
21271
21231
21367
21366
21379
0.6
A乙醚
18324
18581
19268
18531
18329
18638
18612
1.9
A二氯甲烷
834
819
837
835
836
832
832
0.80
A四氢呋喃
902
893
909
895
908
891
900
0.87
A二氧六环
145020
142159
148957
142225
149530
142811
145117
2.3
6.3.7、检测限
精密量取重复性试验的溶液2ml，置20ml量瓶中，加内标溶液稀释至刻度，摇匀。
取1μl注入气相色谱仪，记录色谱图。
图谱见附图24。
计算各组分的检测限。
结果见表19。
表19检测限检查结果
溶剂
检测限（ng）
丙酮
4.8
乙醚
4.9
二氯甲烷
0.53
四氢呋喃
0.62
6.4、样品中有机溶剂残留量测定
标准溶液的配制精密量取上述标准贮备液1.0ml，置10ml量瓶中，加内标溶液稀释至刻度，摇匀，作为标准溶液。
供试品溶液的配制取本品约1.0g，精密称定，置100ml量瓶中，加内标溶液适量超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
取上述标准溶液和供试品溶液各1μl，注入气相色谱仪，记录色谱图，测得相应的峰面积，按内标法以峰面积计算即得。
测定结果见表20。
标准溶液和供试品溶液色谱图见附图25～28。
表20样品残留溶剂量检测结果
溶剂
030310
030319
030328
丙酮
未检出
未检出
未检出
乙醚
未检出
未检出
未检出
二氯甲烷
未检出
未检出
未检出
四氢呋喃
未检出
未检出
未检出
结论：
3批样品中均未检出残留溶媒，但由于丙酮，乙醚为三类溶剂，二氯甲烷和四氢呋喃为二类溶剂，应限制使用。
参照ICH指导原则，将丙酮的限度定为0.5%，乙醚为0.5%，二氯甲烷为0.06%，四氢呋喃为0.072%。
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