生理指标和测酶实验方案.docx

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生理指标和测酶实验方案

实验一、呼吸强度的测定（气流法）

《果蔬保鲜技术及常规测试方法》冯双庆，赵玉梅编

化学工业出版社2001.9

一、目的及原理

呼吸作用是果蔬采收后进行的重要生理活动，是影响贮运效果的重要因素。

测定呼吸强度可衡量呼吸作用强弱，了解果蔬采后生理状态，为低温和气调贮运以及呼吸热计算提供必要数据。

因此研究或处理果蔬贮藏问题时，测定呼吸强度时经常采用的手段。

测定呼吸强度的方法很多，碱吸收法、气相色谱法、红外线CO2分析法，根据具体情况灵活掌握。

碱吸收法原理：

呼吸强度的测定通常是采用一定量碱液吸收果蔬在一定时间内呼吸所释放出来的CO2，再用酸滴定剩余的碱，即可计算出呼吸所释放出的CO2量，求出其呼吸强度。

其单位为每千克每小时释放出CO2毫克数。

二、仪器设备

1、真空干燥器2、大气采样器3、天平

4、酸式滴定管5、三角瓶6、1000mL容量瓶

三、试剂

钠石灰、0.4摩尔/升NaOH、20%NaOH溶液、0.2mol·L—1草酸、饱和氯化钡溶液、酚酞指示剂、正丁醇、凡士林等

四、实验步骤

1、试剂的配制

（1）20%NaOH溶液：

称取60gNaOH，溶于240毫升蒸馏水中。

（2）0.4摩尔/升NaOH：

称取8gNaOH放入烧杯中，用蒸馏水溶解后，小心地移入500mL容量瓶中，再加蒸馏水稀释至刻度。

（3）0.2摩尔/升草酸：

称取12.607克草酸于烧杯中，用蒸馏水溶解后，小心地移入500mL容量瓶中，再加蒸馏水稀释至刻度。

（4）1%酚酞指示剂：

称取1g酚酞，溶解于100mL70%~90%乙醇中。

（5）饱和氯化钡溶液：

取氯化钡溶解于蒸馏水中，直至氯化钡不溶解即为饱和溶液。

2、气流法测定

气流法的特点是使果蔬处于气流畅通的环境中呼吸，比较接近自然状态。

可以在恒定的条件下进行较长时间的多次连续测定。

测定时使不含CO2的气流通过果蔬呼吸室，将果蔬呼吸时释放的CO2进入吸收管，被管中定量的碱液吸收，经30分钟的吸收后，取出碱液，用酸滴定，由碱量差值计算出CO2量。

（1）按图（暂时不串接吸收管）用导管连接好钠石灰瓶、20%NaOH瓶、呼吸室（干燥器）、安全瓶（空气净化瓶）和大气采样器，并在干燥器的底和盖的边缘上抹少许凡士林，使干燥器密封。

同时检查不漏气后，开动大气采样器中的空气泵，如果在装有20%NaOH溶液的净化瓶中有连续不断的气泡产生，说明整个系统气密性良好，否则应检查各接口是否漏气。

（2）用台秤称取果蔬材料1千克，放入呼吸室（干燥器），先将呼吸室与安全瓶连接，拨动开关，将空气流量调在0.4升/分；定时钟旋钮按反时针方向转到30分钟处，使呼吸室抽空平衡半小时，然后连接吸收管开始正式测定。

（3）当呼吸室抽空半小时后，立即接上吸收管，吸收管内放入0.4摩尔/升NaOH10mL，加一滴正丁醇，把定时钟重新按反时针方向转到30分钟处，调整流量保持0.4升/分。

待样品测定半小时后，取下吸收管，将碱液移入三角瓶中，加饱和氯化钡溶液5毫升和酚酞指示剂2滴，用0.2摩尔/升草酸滴定，记下草酸滴定量（V2），重复操作三次。

（粉红色消失即为终点）

（4）用同样的方法作空白滴定，只是呼吸室内不放入样品。

记下滴定量，重复两次，取平均值，即为空白滴定量（V1）。

如果两次滴定相差超过0.1毫升，必须重做一次。

（5）计算：

呼吸强度[毫克CO2/千克·小时]=

式中N——草酸的浓度（摩尔/升）；

W——样品质量（千克）；

t——测定时间（小时）；

22——CO2的毫克当量。

实验二、可滴定酸含量测定

《果蔬采后生理生化实验指导》曹建康姜微波赵玉梅编著

中国轻工业出版社2007.9

植物材料中含有丰富的有机酸，如苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、草酸等。

利用酸碱滴定法测定植物材料中的可滴定酸含量，可以从风味及营养的角度衡量果蔬的品质。

加工食品中的可滴定酸也可以用此方法进行测定。

一、原理

在一定温度下，用蒸馏水或乙醇将植物材料中的有机酸浸提出来，用碱溶液滴定浸出液，即可计算出样品的可滴定酸含量。

果实中的有机酸含量如柑橘类可换算成柠檬酸、葡萄可换算成酒石酸，苹果类可换算成苹果酸表示。

二、仪器设备

1、天平2、250mL三角瓶3、研钵

4、恒温水浴5、漏斗6、100mL容量瓶

7、碱式滴定管8、定性滤纸9、低速离心机

三、试剂

1、0.1mol·L—1NaOH标准溶液：

称取4gNaOH，溶于无CO2水中，并稀释至1L。

以邻苯二甲酸氢钾标定其浓度，方法是：

用万分之一的天平称取干燥过的邻苯二甲酸氢钾0.2500~0.3000g3份，分别置250mL三角瓶中，用80mL无CO2水溶解，加酚酞指示剂2~3滴，用所配NaOH标准溶液滴定至微红色。

依下式计算NaOH的准确浓度，求3份样品的平均值，结果保留至小数点后4位。

M=

式中M——NaOH标准溶液的浓度（mol·L—1）；

W——邻苯二甲酸氢钾的重量（g）；

V——滴定时所消耗NaOH溶液的体积（mL）；

0.2043——每毫摩尔邻苯二甲酸氢钾的重量（g）。

2、1%酚酞指示剂：

称取1g酚酞，溶解于100mL70%~90%乙醇中。

四、实验步骤

1、称取新鲜植物组织25g置研钵中迅速研成糊状（或者将果肉打浆后直接称取果汁），置于三角瓶或烧杯中，加适量蒸馏水，于80℃恒温水浴中浸提30min，冷却后4000r·min—1离心5~10min（如果没有渣子可不离心，过滤的速度过慢），上清液用蒸馏水定容到100mL。

3、取试液3份，每份20mL，分别置250mL三角瓶中，各滴入酚酞指示剂2~3滴。

用NaOH标准溶液滴定至粉红色不褪为止，记录NaOH的用量。

4、结果计算

总酸度=

*100%

式中V1——样品提取液总体积（mL）；

V2——滴定时所取滤液体积（mL）；

V——滴定时所消耗NaOH标准溶液的体积（mL）；

N——NaOH标准溶液的浓度（mol·L—1）；

K——将总酸换算为特定有机酸的系数：

苹果酸0.067、柠檬酸0.064、酒石酸0.075、乳酸0.090、草酸0.045

a——样品滴定前的稀释倍数；

W——样品鲜重（g）

【注意事项】

1、如样品中有机酸含量过高，应在滴定前适当稀释，计算时将稀释倍数带入公式。

2、如果试液颜色较深，影响滴定终点的观察，应采用电位滴定法。

实验三、可溶性固形物的测定

《果蔬保鲜技术及常规测试方法》冯双庆、赵玉梅编

化学工业出版社2001.9

一、目的及原理

可溶性固形物主要包括糖、酸等可溶性物质，果蔬可溶性固形物含量的高低，直接反映了果蔬品质及成熟度，是判断适时采收和耐藏性的一个重要指标，也是识别品种特性进行产品标准化的必要措施。

物质的折射率是物理指标，测定样品的折射率即可测定物质的可溶性固形物。

测定方法比较简单。

二、仪器及用具

1、手持折光仪2、滴管3、擦镜纸

三、操作步骤

1、仪器的校正：

校正仪器标尺的焦距和位置，打开折光仪进行检查，用滴管吸纯蒸馏水2滴于检测镜上，盖上盖，由目镜观察，转动棱镜旋钮，使视野分成明暗两部分。

旋转补偿器旋钮，使视野中除黑（或蓝）白两色外，无其他颜色。

转动棱镜旋钮，使明暗分界线在0刻度线上。

2、从果蔬中挤出汁液1~2滴，仔细滴在检测镜上，迅速关合盖板，使果汁分布于棱镜表面。

将折光仪朝向光源明亮处，调节目镜视度圈，使视野内出现明暗分界线及与之相应的读书，即果汁液在20℃下所含可溶性固形物的百分率。

3、每个样品重复测定三次，取其平均值，以百分数计算。

4、连续使用仪器测定不同式样时，在每次测完后，用清水冲洗洁净，再用干燥的镜纸擦干净，才可继续进行测试。

测试结束后，必须擦净镜身各部分。

【注意事项】

通常在20℃是测定，测得的读书即为该样品的可溶性固形物的百分含量。

若检测环境为其它温度，可按仪器侧面所附补偿温度计表示的加减数进行校正。

实验四、总糖的测定（蒽酮比色法）

《食品化学实验指导》韩雅珊主编

北京农业大学出版社1992.4

一、原理

强酸可使糖类脱水生成糠醛（或羟甲基糠醛）。

生成的糠醛与蒽酮脱水缩合，形成的衍生物程蓝绿色，在620nm波长处有最大吸收。

颜色的深浅可作为定量的标准。

这就是蒽酮比色法的原理。

二、仪器设备

1、721分光光度计2、小台称3、三角瓶（50mL）

4、试管（15mL）5、容量瓶（50mL、1000mL）6、漏斗

7、试管架8、移液管（0.5mL，1mL，2mL，5mL）

三、试剂

1、葡萄糖

2、浓硫酸

3、乙酸乙酯

4、蒽酮试剂：

称取蒽酮1g溶于50mL乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中，暗中保存备用（可保存数周）。

四、实验步骤

1、葡萄糖标准曲线的制作：

按下表数据配置一系列不同浓度的葡萄糖溶液。

准确称取葡萄糖200mg，用蒸馏水溶解后置1000mL容量瓶中定容。

取6支编号的试管，在每支试管中按表用移液管加入葡萄糖原液和蒸馏水，再在各试管中立即分别加入蒽酮试剂0.5mL和浓硫酸5mL，摇匀，于沸水浴中加热5min，用自来水冲冷至室温，在620nm波长下依次测消光值。

以标准葡萄糖浓度作横坐标，以消光值作纵坐标，画制标准曲线。

管号

1

2

3

4

5

6

葡萄糖原液（200µg/mL）量（mL）

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

蒸馏水量（mL）

2.0

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

相当于葡萄糖量（µg）

0

20

40

60

80

100

2、样品处理：

称取捣碎均匀的样品5g,置于三角瓶中，加蒸馏水10mL，在水浴中加盖煮沸15min，冷却后定容到500mL，并用蒸馏水将三角瓶冲洗数次。

（然后在容量瓶中加入2.5mL10%醋酸铅，混匀，以沉淀样品中的蛋白质。

待反应完全后，再加入0.5g草酸结晶，以除去过量的醋酸铅，定容并混匀，过滤得上清液备用。

若溶液中蛋白质含量很低，可省略此步。

）

3、测定：

取上清液2mL定容到100mL，再从100mL中取2mL放入20mL大试管中，加入0.5mL蒽酮试剂，并小心加入5mL浓硫酸，摇匀，试管置于沸水浴中加热5min，取出后自来水冲冷，静置10min，于721分光光度计620波长处测消光值，从标准曲线查出含糖量，即可计算出样品的含糖量。

重复三次，取其平均值。

（对照：

加2mL蒸馏水）

4、计算

含糖量（%）=

*稀释倍数*100%

式中A：

查标准曲线所得的含糖量（µg）；

W：

样品重（g）。

【注意事项】

1、应用此法时，查阅样品含糖量的参考值，称取适量的样品，选择适当的含糖量浓度，使含糖量在有效范围内，才能获得正确的结果。

2、此方法灵敏度高，一般在含糖量过30µg左右就能进行测定。

3、当样品中含有大量的色氨酸时，由于它同蒽酮也起反应，与糠醛发生竞争作用，因此会减少620nm波长处所产生的消光值。

4、注意控制条件：

葡萄糖显色高峰在100℃下加热10min后出现，而核糖的显色高峰在同样温度下加热3min后出现。

实验五、维生素C含量的测定（2，6—二氯靛酚滴定法）

《植物生理学实验指导》高俊凤主编

高等教育出版社2006.5

维生素C（又称抗坏血酸，VC）是植物材料中普遍存在的一类酸性、还原性物质，也是维持人类健康所必须的维生素类物质之一。

维生素C含量的多少与果蔬的品质、营养价值、抗病及抗衰老能力直接相关。

所以，研究中经常需要测定维生素C的含量。

维生素C可分为还原型和脱氢型两种。

根据其具有还原性的性质，有多种方法可以测定维生素C含量。

如2，6—二氯靛酚滴定法、荧光比色法、钼蓝比色法。

前者用于测定还原型维生素C，后两种用于测定总维生素C含量。

一、原理

还原型维生素C能还原2，6—二氯靛酚染料。

该染料在酸性条件下程红色，被还原后红色消失。

反应结束后，还原型维生素C被氧化成脱氢维生素C。

在没有杂质干扰下，一定量的样品提取液还原标准染液的量与样品中维生素C的含量成正比。

实验时，用2，6—二氯靛酚滴定含有维生素C的酸性溶液。

开始维生素C是过量的，滴下的红色2，6—二氯靛酚立即呈现无色，当维生素C被完全氧化后，继续滴入的2，6—二氯靛酚不能被还原，溶液从无色转为微红色，即为滴定终点。

二、仪器设备

1、天平（感量0.1mg）2、研钵3、50mL容量瓶

4、小漏斗5、定性滤纸6、50mL三角瓶

7、微量滴定管8、5mL、10mL移液管

三、试剂

1、草酸溶液：

配制1%、2%两种浓度。

1%草酸：

称取10g草酸，溶解，定容至500mL。

2%草酸：

称取20g草酸，溶解，定容至500mL。

2、维生素C标准溶液：

用天平准确称取维生素C20mg，溶于1%草酸溶液中，定容至

100mL，混匀，4℃保存。

使用时吸取5mL溶液,用1%草酸定容至50mL。

此标准液每mL含维生素C0.02mg。

3、2，6—二氯靛酚溶液：

称取NaHCO352mg,溶于200mL沸水中，然后称取2，6—二氯靛酚50mg，溶解在上述NaHCO3溶液中，冷却后在冰箱中放置过夜。

次日过滤，定容至250mL。

贮存于棕色瓶中，4℃保存。

至少每周标定一次。

标定方法：

取5mL已知浓度的维生素C标准溶液于50mL三角瓶中，加入1%草酸溶液5mL，摇匀，用2，6—二氯靛酚溶液滴定至呈粉红色，15s内不褪色为止。

计算：

T=

式中，T：

滴定度，指每毫升染料溶液相当于维生素C的重量（mg）；

C：

维生素C的浓度（mg·mL—1）；

V1：

维生素C标准溶液的体积（mL）；

V2：

消耗染料溶液的体积（mL）。

四、实验步骤

1、称取4.0g新鲜样品，置研钵中，加入5mL2%草酸，迅速研磨成浆。

2、将样品提取液过滤转移至50mL容量瓶中，用2%草酸反复冲洗残渣，合并滤液，最终定容至50mL。

（由于在研磨过程中是否加入草酸影响不大，所以可直接称取4.0g打浆的果汁，用2%草酸定容到50mL）。

3、吸取滤液10mL，置50mL三角瓶中，立即用2，6—二氯靛酚溶液滴定至出现粉红色，15s内不褪色为止。

记录所用2，6—二氯靛酚溶液的体积（V1）。

4、空白滴定：

取10mL2%草酸溶液，用2，6—二氯靛酚溶液滴定至终点。

记录滴定液用量（V2）。

5结果计算

维生素C含量（mg·g—1）=

式中T：

2，6—二氯靛酚溶液标定时计算出的滴定度；

V：

样品提取液的总体积（50mL）；

W：

样品鲜重（g）；

V3：

滴定时所取用的样品液体积（10mL）。

【注意事项】

1、提取液若含有过多泡沫，影响定容，可加入几滴乙醚消泡。

2、当样品液本身带有颜色，影响滴定终点判断时，可用惰性吸附剂（如白陶土、活性炭等）吸附色素；也可加入2~3mL二氯乙烷。

到滴定终点时，二氯乙烷将由无色转变为粉红色。

3、整个实验过程应尽可能迅速、避光，注意pH的控制，并除去任何氧化剂、还原剂的干扰。

实验六、超氧化物岐化酶（SOD）活性的测定（NBT还原法）

《植物生理学实验指导》高俊凤主编

高等教育出版社2006.5

超氧化物岐化酶（SOD）是生物体内普遍存在的参与氧代谢的一种含金属酶（有Cu—Zn—SOD、Mn—SOD、Fe—SOD三种类型）。

该酶与植物的衰老及抗逆性密切相关，是植物体内重要的保护酶之一，因此SOD活性的测定在研究植物衰老及抗逆机制中有着重要的意义。

一、原理

SOD可催化超氧物阴离子自由基（O2—）发生歧化反应，生成O2和H2O2，生成H2O2的可被过氧化氢酶分解为O2和H2O。

测定SOD活性的方法较多，简便且常用的是NBT（氮蓝四唑）光还原法。

该方法的原理是：

当反应体系中有可被氧化的物质（如甲硫氨酸）时，核黄素可被光还原，还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化，使O2被单电子还原产生O2—，O2—则可将NBT还原成蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收值。

SOD能够清除O2—，当反应体系中有SOD存在时可抑制NBT的还原，酶活性越高，抑制作用越强，反应液的蓝色越浅。

因此可通过测定A560来计算SOD活性，以抑制NBT光还原反应50%所需的酶量为一个酶活性单位。

二、仪器设备

1、高速离心机2、分光光度计3、微量进样器

4、荧光灯5、恒温水浴6、15mm*150mm试管

7、研钵8、刻度移液管：

1.0、2.0、5.0mL

三、试剂

1、50mmol·L—1磷酸缓冲液（pH7.8）。

磷酸钠（Na2HPO4-NaH2PO4）缓冲液（pH7.8）

母液A（0.2mol/LNa2HPO4溶液）：

称取35.61gNa2HPO4·2H2O（Mr=178.05）或53.65gNa2HPO4·7H2O（Mr=268.25）或71.64gNa2HPO4·12H2O（Mr=358.22），溶解，稀释至1000mL。

母液B（0.2mol/LNaH2PO4溶液）：

称取27.60gNaH2PO4·H2O（Mr=138.01）或31.21gNaH2PO4·2H2O（Mr=156.03），溶解，稀释至1000mL。

取91.5mL母液A和8.5mL母液B混合后，用蒸馏水稀释至400mL。

2、130mmol·L—1甲硫氨酸（Met）溶液：

称取1.93973gMet,用蒸馏水溶解定容至100mL。

3、0.75mmol·L—1NBT溶液：

称取0.06133gNBT用蒸馏水溶解定容至100mL，避光保存。

4、0.04mmol·L—1核黄素溶液：

称取0.0075g核黄素蒸馏水溶解定容至500mL，随用随配，避光保存。

5、10mmol·L—1EDTA—Na2溶液：

称取0.3764gEDTA—Na2·2H2O，蒸馏水溶解定容100mL。

6、SOD提取介质：

50mmol·L—1磷酸缓冲液（pH7.8）内含1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。

四、实验步骤

1、SOD的提取：

称取植物材料1.0g于预冷的研钵中，加2mL预冷的提取介质在冰浴中研磨匀浆，转移至25mL量瓶中，用提取介质冲洗研钵2~3次（每次1~2mL），合并冲洗液于量瓶中，定容至25mL。

取10mL提取液于4℃下10000r/min离心15min,上清夜即为SOD粗提液。

2、SOD活性测定：

取透明度好、质地相同的15mm*150mm试管7支，测定管3支，光下对照3支，暗中对照（调零）1支，按下表加入反应显色试剂。

反应试剂（mL）

测定管

光下对照

暗中对照

1

2

3

4

5

6

7

50mmol·L—1磷酸缓冲液

1.8

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

130mmol·L—1Met溶液

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

750µmol·L—1NBT溶液

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

100µmol·L—1EDTA—Na2溶液

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

20µmol·L—1核黄素溶液

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

粗酶液

0.1

0.1

0.1

0

0

0

0

蒸馏水

0

0

0

0.1

0.1

0.1

0.1

反应显色剂：

1.8ml50mmol·L—1磷酸缓冲液+0.3ml130mmol·L—1Met溶液+0.3ml750µmol·L—1NBT溶液+0.3ml100µmol·L—1EDTA—Na2溶液+0.3ml20µmol·L—1核黄素溶液+100µl酶液（蒸馏水）

7号试管加入核黄素后立即用双层黑色硬纸套遮光，全部试剂加完后摇匀，将试管置于4000lx荧光灯下显色反应15~20min（要求各管照光要一致，反应温度控制在25~35℃之间，视光下对照管的反应颜色和酶活性的高低适当调整反应时间）。

反应结束后用黑色罩遮盖试管终止反应。

以暗中对照管作空白（调零），在560nm下测定1~6号试管反应液的吸光度，记录测定数据。

3、结果计算

SOD活性（U·g—1·h—1）=

式中Ao：

光下对照管吸光度；

As：

样品测定管吸光度；

Vt：

样品提取液总体积（mL）；

Vs：

测定时取粗酶液量（mL）；

t：

显色反应光照时间（min）；

W：

样品鲜重（g）。

【注意事项】

1、显色反应过程中要随时观察光下对照的颜色变化，当Ao达到0.6~0.8时终止反应。

2、当光下对管反应颜色达到要求的程度是，测定管（加酶液）未显色或颜色过淡，说明酶对NBT的光还原抑制作用过强，应对酶液进行适当稀释后再显色，以能抑制显色反应的50%为最佳。

3、植物组织中的酚类物质对测定有干扰，对酚类含量高的材料提取酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）消除之。

实验七、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的测定

《植物生理学实验指导》高俊凤主编

高等教育出版社2006.5

苯丙氨酸解氨酶（PAL）是植物体内苯丙烷代谢途径的关键酶，其活性高低控制着植物体内多种次生酚类化合物、类黄酮植保素、木质素等抗菌物质的合成，因此PAL在植物的次生代谢和抗病代谢中具有重要作用。

一、原理

PAL催化L—苯丙氨酸脱氨生成反式肉桂酸，反式肉桂酸在290nm处有强吸收峰，因此可通过测定反应液A290值的变化计算PAL活性。

二、仪器设备

1、紫外分光光度计2、高速冷冻离心机3、恒温水浴

4、研钵5、试管：

10mL5支

6、移液管：

0.5mL1支，1mL3支，2mL1支，5mL1支

三、试剂

1、0.05mol/LTris-HCl缓冲液，pH8.8。

母液A（02mol/LTris）：

称取24.23gTris溶解，稀释至1000mL。

母液B（0.2mol/LHCl）：

取16.67mLHCl（37.2%），稀释至1000mL。

取250mL母液A和42.5mL母液B混合后，调节pH到8.8，稀释至1000mL。

2、提取液：

（50mmol/LTris-HCl缓冲液：

pH8.8；15mmol/Lβ—巯基乙醇；5mmol/LEDTA；5mmol/LVc；1mmol/LPMSF；0.15%（w/v）PVP）

取1.052mLβ—巯基乙醇，1.4612gEDTA，0.8807gVc，1.5gPVP，溶于1000mL50mmol/LTris-HCl缓冲液（pH8.8）中，低温（4℃）保存备用。

使用时，每100mL加入1mL100mmol/LPMSF。

100mmol/LPMSF：

称取17