微生物检验.docx

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微生物检验

一、培养基种类

1．基础培养基：

含有基础生长所需的基本营养成分，最常用的是肉浸液，称肉汤，主要成分含牛肉浸液和蛋白胨。

基础培养基广泛用于增菌、检验，也是制备其他培养基的基础成分。

2．营养培养基：

在基础培养基中可加入葡萄糖、血液、生长因子等特殊成分，供营养要求较高的细菌和须要特殊生长因子的细菌生长。

最常用的是血琼脂平板、巧克力血平板等。

3．鉴别培养基：

利用细菌分解糖类和蛋白质能力及代谢产物的不同，在培养基中加入特定的作用底物和指示剂，观察细菌生长过程中分解底物所释放的不同产物，通过指示剂的反应不同来鉴别细菌。

如糖发酵培养基。

4．选择培养基：

在培养基中加入抑制剂，去除抑制标本中的杂菌生长，有助于对所选择细菌种类的生长。

5．特殊培养基：

包括厌氧培养基和细菌L型培养基等。

厌氧培养基是培养专性厌氧菌的培养基，除含营养成分外，还加入还原剂以降低培养基的氧化还原电势。

细菌L型培养基是针对细胞壁缺损的细菌L型，由于胞内渗透压较高，故培养基必须采用高渗低琼脂培养基。

二、分离培养基的选择

1．血平板：

适于各类细菌的生长，一般细菌检验标本的分离，都应接种此平板。

2．巧克力血平板：

其中含有V和X因子，适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标本。

3．中国蓝平板或伊红美蓝平板：

可抑制革兰阳性细菌，有选择地促进G-菌生长，是较好的弱选择性培养基。

发酵型革兰阴性菌因分解乳酸糖能力不同，在此平板上菌落颜色不同，便于鉴别菌种。

4．麦康凯平板：

具中等强度选择性，抑菌力略强，有较少革兰阴性菌不生长。

在该平板上能否生长，是非发酵菌鉴定的依据。

5．SS琼脂：

有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。

6．碱性琼脂：

用于从粪便中分离霍乱弧菌及其它弧菌。

7．血液增菌培养基：

用于从血液、骨髓中分离常见病原菌。

8．营养肉汤：

用于标本及各类细菌的增菌。

根据标本来源和可能存在的病原菌，确定选用各种分离培养基。

如痰标本一般选用血平板、中国蓝、麦康凯、巧克力平板做分离。

其中血平板用于肺炎链球菌、白喉棒状杆菌等的分离；中国蓝/麦康凯用于筛选革兰阴性杆菌；而含杆菌肽的巧克力平板用于筛选嗜血杆菌等，以期提高细菌检验的准确性。

三、要球菌种有金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，头状葡萄球菌，人葡萄球菌和腐生葡萄球菌。

革兰阳性菌：

葡萄球菌，链球菌，肺炎链球菌

革兰阴性菌：

脑膜炎奈瑟菌，淋病奈瑟菌

球菌呈球形：

无鞭毛，无芽胞。

葡萄球菌属生物学特征（掌握）

形态与结构：

球形或椭圆形，典型排列呈葡萄串状，在脓汁、肉浸液培养基中，可见单个，成对或短链排列。

无鞭毛，无芽胞，有些细菌能形成荚膜。

易被常用的碱性染料着色，革兰染色为阳性。

培养特性

需氧或兼性厌氧，营养要求不高，通常在肉浸液及肉浸液琼脂或加入血液的培养基上生长良好。

最适pH为7.4，最适温度为35-37℃。

在普通琼脂平板：

经35℃24-48小时培养，可形成不透明的圆形、凸起菌落，表面光滑，可呈不同颜色（金黄色、白色、柠檬色等脂溶性色素）。

在血琼脂平板：

几乎所有的葡萄球菌可产生透明的α、β、γ和δ溶血环。

在液体培养基（普通肉浸液）中生长迅速呈均匀混浊状。

生化反应

本属菌触酶试验阳性，对糖的发酵反应不规则，多数能分解葡萄糖、麦芽糖及蔗糖，产酸不产气。

多数致病性葡萄球菌能分解甘露醇产酸、液化明胶和产生血浆凝固酶。

抗原

葡萄球菌水解后，用沉淀法可获得两种抗原，即蛋白抗原和多糖抗原。

（1）蛋白抗原：

是完全抗原，具有种、属特异性，而无型特异性。

存在于葡萄球菌的表面，结合在细胞壁的粘肽部分，具有抗吞噬作用，称为葡萄球菌A蛋白。

（2）多糖抗原：

是半抗原，具有型特异性，有三种：

A型多糖抗原；B型多糖抗原；C型多糖抗原。

分类

1965年，国际葡萄球菌和微球菌分类委员会将葡萄球菌分为凝固酶阳性葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌。

凝固酶阳性葡萄球菌：

包括金黄色凝固酶阳性葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌、中间型葡萄球菌和家蓄葡萄球菌。

凝固酶阴性葡萄球菌：

包括表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌。

染色标本检查（熟练掌握）

细菌标本经染色后，由于细菌与周围环境间在颜色上形成鲜明对比，故在普通光学显微镜下可清楚地观察到细菌的形态特征（如细菌的大小、形状、排列等）和某些特殊结构（如荚膜、鞭毛、芽孢等），并可根据染色反应性对细菌加以分类鉴定。

常用染料（熟练掌握）

根据助色基解离后的带电情况，可将染料分为碱性和酸性两大类。

此外，还有复合染料。

1、碱性燃料

电离后显色离子带正电荷，易与带负电荷的被染物结合。

由于细菌的等电点在pH2-5之间，在碱性、中性、弱酸性的环境中细菌均带负电荷，易与带正电荷的染料结合而着色。

常用的染料有碱性复红、结晶紫、亚甲兰等。

2、酸性染料

电离后显色离子带负电荷，易与带正电荷的被染物结合。

一般情况下细菌都带有负电荷，不易着色。

如果降低菌液的pH使细菌带正电荷，则可被染色。

酸性染料通常用来染细胞质，而很少用于细菌的染色。

常用的酸性染料有伊红、刚果红等。

3、复合染料（中性染料）及荧光染料

复合染料是碱性染料和酸性染料的复合物，如瑞氏染料、吉姆萨染料等；

荧光染料如荧光标记的抗体，荧光素常用异硫氢基荧光素。

常用于某些特殊的染色技术中。

常用的染色方法（熟练掌握）

在细菌感染标本中，临床上常用的染色方法有革兰染色、抗酸染色和荧光染色。

1、单染色法

用一种染料将细菌和周围物体染成同一种颜色，称为单染色法。

如吕氏亚甲蓝、结晶紫和稀释复红染色法。

细菌经单染法处理后，可观察其大小、形态、排列及简单的结构，但不能显示各种细菌染色性的差异。

2、复染色法

用两种或两种以上不同染料可将细菌染成不同的颜色，称为复染法或鉴别染色法。

该方法除可观察细菌的大小、形态与排列外，还反应出细菌染色特性，具有鉴别细菌种类的价值。

常用的有革兰染色法和抗酸染色法。

（1）革兰染色：

是细菌学中最经典、最常用的染色方法。

除粪便、血液等极少数标本外，在培养前都要进行革兰染色、镜检。

通过革兰染色将所有细菌分为G+菌和G-菌两大类，可初步识别细菌，缩小范围，有助于进一步鉴定。

革兰染色除用于鉴定细菌外，病原菌革兰染色特性可为临床选择药物提供参考，帮助临床制定有针对性的治疗方案，因为G+菌与G-菌对一些抗生素表现出不同的敏感性，且其致病物质及其作用机制不同。

（2）抗酸染色：

抗酸染色也可将细菌分为两大类：

即抗酸性细菌和非抗酸性细菌。

因临床上绝大多数病原菌为非抗酸性细菌，所以抗酸染色不作为临床常规的细菌检查项目，只针对性用于结核病、麻风病等的细菌检查。

（3）荧光染色法

荧光染色法敏感性强，效率高而且容易观察结果，在临床细菌鉴定中有很大的实用价值。

主要用于结核分支杆菌、麻风分支杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等的检测。

经荧光素染色的细菌，或荧光素标记的荧光抗体与相应抗原的细菌、病毒结合形成的复合物，在荧光显微镜下发出荧光。

除以上染色方法外，用于细菌鉴定的还有鞭毛染色、异染颗粒染色等特殊染色。

鞭毛染色后于显微镜下可以观察到菌体上有无鞭毛、鞭毛的位置及数量，在细菌鉴定中，特别是非发酵菌的鉴定中很重要。

疑为白喉棒状杆菌感染，进行涂片检查，除证实为革兰阳性典型棒状杆菌外，还需用异染颗粒染色，镜检异染颗粒，才能为临床早期诊断提供依据。

外界因素对细菌的影响

掌握：

消毒、灭菌、防腐、无菌、无菌操作的基本概念

1、消毒：

消除或杀灭外环境中的病原微生物及其他有害微生物的过程。

用以消毒的化学药物称为消毒剂。

一般消毒剂在常用浓度下，只对细菌繁殖体有效，对芽胞则需要提高消毒剂的浓度和延长作用的时间。

2灭菌：

用物理或化学方法消除或杀灭物体上所有微生物（包括病原体、非病原体、细菌的繁殖体和芽胞）的方法。

灭菌的要求是把微生物存活的概率减少到最低限度。

3无菌：

指物体上或容器内无活菌存在的意思。

4防腐：

防止或抑制细菌生长繁殖的方法。

用于防腐的化学药物称为防腐剂。

５、无菌操作：

是防止微生物进入机体或其他物品的操作技术。

许多药物在低浓度时只有抑菌作用，浓度增高或延长作用时间，则有杀菌作用。

消毒与灭菌技术的选择，取决于多种因素。

在实际工作中应根据消毒灭菌的对象和目的要求不同，以及条件的不同，选择不同的合适方法。

一、物理因素对细菌的影响

温度、光线、干燥、超声波、过滤等因素均可影响细菌的新陈代谢及其化学组成，故选用一些物理方法达到消毒和灭菌的目的。

（一）温度

各种细菌都需要在最适生长温度的范围内生长。

当外界温度明显高于最适生长温度，细菌被杀死；如果在低于细菌的最低生长温度时，细菌代谢活动受抑制，则出现抑菌现象。

１、高温（湿热、干热）（掌握）：

细菌蛋白质、核酸、细胞壁和细胞膜及酶类因热力作用发生变性或凝固，活性消失，代谢发生故障导致细菌死亡。

大多数无芽孢细菌55-60℃加热30-60分钟即被杀死，加热100℃立即死亡，有芽孢的破伤风梭菌煮沸3小时才被杀死。

热力灭菌是最可靠而普遍应用的灭菌法，包括湿热灭菌和干热灭菌法。

（二）日光和射线（掌握）：

根据光线和射线的波长、强度、作用距离、持续时间而影响它们对细菌的作用。

1、日光与紫外线：

发挥杀菌作用的日光主要是紫外线，波长265-266nm时杀菌作用最强。

是由于紫外线可使DNA分子形成胸腺嘧啶双聚体，干扰DNA正常复制，导致细菌死亡。

此外，紫外线可使分子氧变成臭氧，臭氧也具有杀菌能力。

杀菌波长的紫外线对人体皮肤、眼睛均有损伤作用，使用时应注意防护。

2、电离辐射（了解）

（三）滤过除菌（了解）

（四）超声与超声波（了解）

（五）干燥（了解）

二、化学因素对细菌的影响（掌握内容：

消毒剂的种类、杀菌机制）

化学药物能影响细菌的化学组成、物理结构和生理活动，从而发挥防腐，消毒，甚至灭菌的作用。

防腐剂的浓度高或作用时间长，也可达到消毒的目的。

消毒及防腐药物对人体组织有害，只能外用或用于环境消毒。

（一）常用消毒剂的杀菌机制

1、使菌体蛋白变性或沉淀。

2、干扰微生物酶系统和影响其代谢活动。

3、损伤细胞膜。

三、影响消毒灭菌效果的因素及监测（熟悉：

影响因素；熟练掌握：

效果监测）

（一）影响消毒剂作用的因素

（1）消毒剂的性质、浓度与作用时间。

（2）微生物的种类和数量。

（3）温度和酸碱度：

（4）环境中的有机物及拮抗物质：

（5）其他：

包括湿度、穿透力、表面张力及拮抗物质等。

四、生物因素对细菌的影响（了解）

（一）噬菌体

（二）抗生素（Antibiotic）

（三）细菌素（Bacteriocin）

志贺菌属

志贺菌属是人类细菌性疾病最常见的病原菌，统称为痢疾杆菌。

根据生化反应与血清学试验将志贺菌属分为4个血清群（种）：

A群为痢疾志贺菌；B群为福氏志贺菌；C群为鲍特志贺菌；D群为宋内志贺菌。

最近将生化性状相近的A、B，C群归为一群，统称志贺菌A、B、C血清群；而将生化特征与之相异，鸟氨酸脱羧酶和β-半乳糖苷酶均阳性的宋内志贺菌单列出来。

我国以福氏和宋内志贺菌引起的菌痢最为常见。

生物学特性（掌握）

1、形态与染色：

革兰阴性短小杆菌，无荚膜，无芽胞，无鞭毛，有菌毛。

2、培养特性：

需氧或兼性厌氧，液体培养基中呈混浊生长，营养要求不高，能在普通琼脂平板和SS培养基上形成中等大小、半透明的光滑型菌落，宋内志贺菌可形成扁平、粗糙的菌落。

3、生化反应：

志贺菌属的细菌分解葡萄糖产酸不产气，不分解乳酸（宋内志贺菌可迟缓分解乳酸），吲哚试验阴性，H2S阴性，MR试验阳性，VP试验阴性，不产生赖氨酸脱羧酶，不能利用柠檬酸盐，氧化酶试验阴性。

动力检验阴性。

4、抗原结构：

志贺菌属只有O抗原为无鞭毛抗原，个别菌型及新分离菌株有K抗原。

O抗原分群特异性抗原和型特异性抗原两类。

根据抗原结构可将志贺菌分为四群，40余种血清型（包括亚型）。

所致疾病

1、急性细菌性痢疾：

表现为腹痛发热，有里急后重现象，便中含有粘液和血。

2、中毒性菌痢：

见于小儿，常无消化道症状而表现为全身中毒症状，往往造成死亡。

3、慢性细菌性痢疾：

菌痢治疗不彻底，造成反复发作迁延不愈，超过2个月视为慢性菌痢；

携带者：

有恢复期带菌、慢性带菌和健康带菌等3种，是主要的传染源。

棒状杆菌属

棒状杆菌属是一群革兰阳性杆菌，菌体粗细、长短不一，一端或两端膨大呈棒状，故名棒状杆菌。

本菌着色不匀，有异染颗粒。

无鞭毛、无荚膜、无芽孢。

需氧，营养要求较高，能分解一些糖类，产酸不产气。

本属细菌种类较多，主要有白喉棒状杆菌、假白喉棒状杆菌、干燥棒状杆菌、溃疡棒状杆菌。

其中大多数为条件致病菌，引起人类疾病的主要是白喉棒状杆菌。

白喉棒状杆菌

生物学特性（熟悉）

形态与染色：

菌体细长弯曲，一端或两端膨大的革兰阳性杆菌。

无鞭毛、无荚膜、无芽孢、无菌毛。

细菌排列呈散在L、V、Y字形及不规则珊栏状。

用亚甲兰染色菌体着色不均匀，呈现着色深浅相间的节段或深染的颗粒；用Neisser（奈瑟）法染色，菌体染成黄褐色，颗粒被染成紫黑色；Albert（阿培特）染色，菌体呈蓝绿色，异染颗粒蓝黑色。

在细菌的一端或两端有浓染的颗粒，菌体着色不均匀，称为异染颗粒，这是白喉棒状杆菌的形态学特征，对鉴定细菌有重要意义。

培养特性：

需氧或兼性厌氧菌，生长最适温度为35-37℃，pH为7.2-7.8。

在普通培养基上生长不良，形态不典型。

常用下列培养基进行分离培养。

1）血液琼脂平板：

在血平板上长出1-2mm、不透明的S型菌落。

2）吕氏血清斜面培养基：

3）亚碲酸钾血琼脂：

分离培养时常用鉴别选择培养基含0.03％-0.04％亚碲酸钾的血平板。

亚碲酸钾能抑制杂菌，且白喉杆菌能吸收亚碲酸钾使其还原为元素碲，菌落呈黑色。

4）液体培养基：

生化反应：

本菌能分解葡萄糖、麦芽糖、果糖、半乳糖，产酸不产气。

不分解乳糖，极少分解蔗糖。

能还原硝酸盐，不液化明胶，不产生吲哚，不分解尿素。

根据亚碲酸钾血琼脂培养基、肉汤培养基的生长特点及生化反应，可将本菌分为轻、中、重三型。

在我国以轻型多见。

分型与所致疾病的严重程度无关，可用于流行病学调查。

临床意义（熟悉）

白喉棒状杆菌可引起人类白喉，白喉是一种急性呼吸道传染病，该病原菌存在于患者鼻咽腔粘膜。

传染源为患者及带菌者，随飞沫或污染的物品传播，感染后在鼻咽部繁殖，产生外毒素致病，引起局部炎症，形成灰白色膜状物，称为假膜。

若伪膜脱落气管内，即可致呼吸道阻塞窒息，成为致死原因。

本菌不侵人血流，但外毒素吸收入血造成毒血症。

白喉毒素具有强烈细胞毒作用，含有分子量分别为A、B两个片段。

毒素活性位于A片段，由B片段携带转运细胞内。

白喉毒素对组织有选择性亲和力，常侵人心肌及外周神经，故临床上常有心肌炎和软腭麻痹等症状。

病后有高度免疫性。

链球菌属

分布广泛，常引起化脓性炎症、猩红热、新生儿败血症、细菌性心内膜炎、风湿热、肾小球肾炎等超敏反应性疾病，包括化脓性链球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌等病菌。

链球菌属为触酶试验阴性，兼性厌氧，呈圆形或卵圆形的革兰阳性球菌，在液体培养基中生长时易形成长链而表现为沉淀生长。

生物学特性（掌握）

1、形态与染色

菌体呈圆形或椭圆形，呈链状排列，在液体培养基中易成长链。

在脓汁标本中为短链，成双或单个散在。

革兰染色阳性。

无鞭毛、无芽孢、某些菌株在血清肉汤中可形成荚膜。

肺炎链球菌呈矛头状坦面相对，成双排列。

2、培养特性

本菌属大多为需氧或兼性厌氧菌，少数微需氧及专性厌氧。

营养要求较高，需补充血液、血清、葡萄糖等，在含有腹水的培养基上生长良好。

最适温度为35-37℃，最适pH为7.4-7.6，在5%CO2环境下生长更好。

（1）在液体培养基如血清肉汤中，溶血链球菌呈絮状或颗粒状沉淀生长。

上层液体澄清，可有菌膜。

不溶血菌株则均匀混浊生长。

（2）在血琼脂平板上，35℃18-24小时培养后，可形成灰白色、圆形、凸起的细小菌落，菌落周围出现不同溶血环。

血琼脂平板上：

圆形突起菌落，出现三种不同的溶血现象：

①甲型（α-）溶血：

菌落周围出现较窄的草绿色溶血环，如甲型溶血性链球菌（草绿色链球菌）、肺炎链球菌等。

②乙型（β-）溶血：

菌落周围出现较宽的透明溶血环，如乙型溶血性链球菌。

③丙型（γ-）溶血：

菌落周围无溶血环，如不溶血链球菌。

分类（根据溶血现象分类）：

利用链球菌在血平板上溶血情况分为三类，即

1）甲型溶血性链球菌：

称甲型溶血或溶血性链球菌。

菌落呈灰色针尖状，菌落周围有1-2mm宽的草绿色溶血环，又称草绿色链球菌。

溶血环中的红细胞并未完全溶解。

多为条件致病菌。

2）乙型溶血性链球菌：

称乙型溶血或溶血性链球菌。

菌落较小，灰白色，菌落周围有2-4mm宽的透明溶血环。

溶血环中的红细胞完全溶解。

该型细菌致病力最强，常引起人和动物多种疾病。

3）丙型链球菌：

称乙型溶血或γ溶血性链球菌。

呈灰白色小菌落，在菌落周围无溶血环，一般不致病。