HRM操作流程.docx

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HRM操作流程

HRM的应用

2010-10-2210:

05阅读（378）评论（0）

 高分辨率熔解曲线分析技术（HighResolutionMelting），简称HRM，是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变。

HRM技术因其速度快，操作简便，高通量，灵敏性特异性高，对样品无污染等优点而被迅速的应用在生命科学、医学、农学、畜牧业等领域的研究工作中。

1． 原理

       HRM技术主要是基于核酸分子物理性质的不同。

不同核酸分子的片段长短、GC含量、GC分布等是不同的，因此任何双链DNA分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。

HRM技术的基本原理就是根据熔解曲线的不同来对样品来进行区分。

       以二倍体细胞为例，当纯和子样品通过PCR扩增，经过变性复性后，仍然是纯合子，如图一A。

而杂合子PCR扩增完，经过变性复性后，样品中会形成部分的含有非沃森-克里克配对的双链分子存在。

   如图一B所示，杂合子样品扩增后，经变性复性，会有非配对碱基的形成，而纯合子样品没有。

这样，杂合子样品相对纯合子样品来说，双链不够稳定，表现在解链温度上就会有微小的差别。

如果采用高分辨率的仪器进行检测，并用专门的软件进行分析，微小的差别就会被检测出来，从而成功的筛选出纯合子与杂合子。

     下图是杂合子样品熔解曲线的的示意图：

   以二倍体细胞为例，杂合子扩增后通过变性复性会形成二种同源双链和两种异源双链的混合物，在熔解过程中四种链会形成一条独特的溶解曲线，从而与纯合子的熔解曲线区分出来。

      下图是采用Lightscanner仪器对纯合子，杂合子，双杂合样品的分析结果。

图三.采用Lightscanner系统对标准样品的分析。

灰色的曲线代表的是纯合子样品，红色的曲线代表的是杂合子样品，蓝色的曲线代表的是双杂合样品，通过Lightscanner系统的分析，三种样品被明显的分为了三类，表现出了极高的灵敏性和准确性。

2.  应用

HRM技术可以用于以下两方面：

突变筛查和基因分型。

下面将详细的讲解这两种方法。

2.1突变筛查

所谓突变筛查指的是寻找目的片段中的未知SNP位点。

由于杂合子与纯合子的熔解温度不同，根据产生的曲线形状的不同判断样品可能存在SNP位点。

具体如下图所示：

此方法的要求是：

a：

要求目的片段150-400bp。

b：

在PCR反应之前加入LCGreen。

c：

要求模板的量要均一，引物的特异性要好。

d：

反应体系为10ul，LCGreen的加入量为1ul。

e：

在PCR反应之前应加入矿物油25ul。

推荐反应体系下：

操作步骤如下：

⑴．配制PCR缓冲液。

⑵．进行梯度实验。

梯度实验分两步：

第一步不加LCGreen，确定引物是否能用。

第二步加LC Green，确定加染料后的退火温度。

一般加染料之后的退火温度会高于不加染料的5℃左右（取决于引物的特异性）。

⑶．用优化好的PCR条件扩增模板。

推荐反应程序为：

⑷．双击Lightscanner图标，打开文件。

点击“RUN”，设置扫描程序。

将反应之后的96孔板放入LS96中进行扫描。

等待温度升到待机温度，将96孔板插入到机器内，注意有切角的一端先插入，待门关好。

点击“StartRun”，弹出一个窗口，用来储存文件。

软件对数据进行收集。

⑸．分析结果。

打开LightScanner软件：

在桌面上点击LightScanner的图标。

打开要分析的数据：

点击“Scanning”后会弹出一个窗口，然后选择要分析的数据，打开。

对数据进行分组（如果不需要分组的话直接进入下一步）。

点击软件左上角的“Subsets”，然后点击软件中部的“NewSubset”按钮，此时软件自动记录为第一组。

在SampleSelection里选择要分入到第一组的样本，然后点击软件页面下方的“AddMarkedtoSubsets”，此时，第一组分组完毕。

如果还需要分组，再点击“NewSubset”按钮，此时软件自动记录为第二组，选择要分入第二组的样本，点击“AddMarkedtoSubsets”，此时，第二组分组完毕。

如果需要更多分组，重复以上操作直至分组完毕。

对样品进行命名：

点击软件上方的“samples”，软件右侧显示出一个表格，可以对样本进行注释或命名。

如果不需要，可以直接跳过此步骤。

对选定的组进行分析：

点击软件上面的“Scanning”，软件左侧中部出现一排操作选项，按照顺序依次点击就完成对样品的分析。

首先出来的是“NegativeFilter”，用来选择阴性或者阳性结果，选择好后点击“ApplyChange”；然后点击“Normalize”，对曲线进行规一化；然后点击“CurveShift”，对ShiftLevel进行调节，默认值为0.050，一般不需要调节；点击：

“Group”，在Standards一栏的下拉菜单中有“Commonvs.Variants”，“AutoGroup”和“UseInternalStandards”三个选项，选择合适的选项后，点击“ComputeGroups”即可。

查看报告：

点击“Report”。

2.2 基因分型

        基因分型方法有两种，一种是非标记探针法（LunaProbe法），另一种是小片段法（SmallAmplicon法）。

下面将详细的介绍这两种方法。

2.2.1 LunaProbe法

       非标记探针法是在突变位点附近设计一非标记探针，利用不对称PCR反应，使探针序列的数目足够大，从而在熔解曲线图中显示出探针峰与目的片段两个峰，之后通过分析探针峰进行基因分型。

非标记探针法要求如下：

a：

要求目的片段小于250bp。

设计引物的退火温度为60-65℃，探针的退火温度65-70℃。

设计探针时突变位点要处于探针的中部，使错配不稳定。

避免PCR过程中的竞争，引物和探针不要重叠。

b：

探针长度为20-35bp，3’端封闭。

C3，C5，C7封闭效果最好，磷酸化封闭也可以接受。

c：

要求DNA模板的量要均一。

d：

其它要求同mutationscanning。

推荐反应体系如下：

（表中的比例为探针与下游引物合成的链互补时的情况，上下引1:

5）

操作步骤：

⑴．配制PCR缓冲液。

⑵．进行梯度实验。

梯度实验分两步：

第一步不加LCGreen，确定引物是否能用。

第二步加LCGreen，确定加染料后的退火温度。

一般加染料之后的退火温度会高于不加染料的5℃左右（取决于引物的特异性）。

⑶．确定加染料之后的退火温度，在反应中加探针，做梯度实验，确定探针和引物是否互相抑制（PCR反应中不加探针扩增的很好，加探针之后扩增的不好）。

如探针不影响反应，做不对称PCR，摸索合适的引物浓度比。

一般上下引比例为1:

5或5:

1时效果好，可以通过在反应中或多或少的加入探针来增加或减少探针信号。

大多数探针反应在探针终浓度0.20-0.25um的情况下运行良好。

如探针影响PCR反应，可在PCR反应之后加探针。

 ⑷．用优化好的PCR条件扩增模板。

推荐反应程序为：

⑸．双击Lightscanner图标，打开文件。

点击“RUN”，设置扫描程序。

将反应之后的96孔板放入LS96中进行扫描。

等待温度升到待机温度，将96孔板插入到机器内，注意有切角的一端先插入，待门关好。

点击“StartRun”，弹出一个窗口，用来储存文件。

 软件对数据进行收集。

⑹．分析结果打开LightScanner软件，点击“Genotyping”下方的“UnlabeledProbes”，打开要分析的数据。

分组和样本命名的方法与步骤和MutationScanning相同（省略），分组和命名完成后，进行基因型分析：

点击LightScanner软件上部的“Genotyping”，软件左侧中部出现一排操作选项，按照顺序依次点击就可以完成对样品的分析。

首先出来的是“NegativeFilter”，用来选择阴性或者阳性结果，选择好后点击“ApplyChange”；然后点击“Normalize”，选择要分析的曲线范围，并对对曲线进行规一化；点击：

“Group”，在Standards一栏的下拉菜单中有“AutoGroup”和“UseInternalStandards”两个选项，选择合适的选项后，点击“ComputeGroups”即可。

Tmcalling:

在Tmcallingsetting表格中，Method下拉菜单中选择“Automaticmode”，Selection中选择“genotype”，Sensitivity中选择“Normal”，点击“ComputerTmValue”即可计算出Tm值。

查看报告：

点击“Report”。

2.2.2 SmallAmplicon 法

       小片段基因分型是一种很好的探针替代方案。

由于异源双链的存在，杂合子很容易检测，而这很大程度上是通过熔解曲线的形状来决定的。

小片段法要求：

a：

要求目的片段45-120bp。

高低温内标要3’端封闭。

b：

在PCR反应之前加入LCGreen。

c：

要求模板的量要均一，引物的特异性要好。

d：

反应体系为10ul，LCGreen的加入量为1ul。

e：

在PCR反应之前应加入矿物油25ul。

内标的序列为：

 反应体系为：

操作步骤：

⑴．配制PCR缓冲液。

⑵．进行梯度实验。

梯度实验分两步：

第一步不加LCGreen，确定引物是否能用。

第二步加LCGreen，确定加染料后的退火温度。

一般加染料之后的退火温度会高于不加染料的5℃左右（取决于引物的特异性）。

⑶．用优化好的PCR条件扩增模板。

推荐反应程序为：

 ⑷． 双击Lightscanner图标，打开文件。

点击“RUN”，设置扫描程序。

将反应之后的96孔板放入LS96中进行扫描。

等待温度升到待机温度，将96孔板插入到机器内，注意有切角的一端先插入，待门关好。

点击“StartRun”，弹出一个窗口，用来储存文件。

 软件对数据进行收集。

⑸．分析结果。

打开LightScanner软件，点击“Genotyping”下方的“SmallAmplicon”，打开要分

    析的数据。

分组和样本命名的方法与步骤和MutationScanning相同（省略），分组和命名完成

    后，对小分子扩增片断进行基因型分析：

点击LightScanner软件上部的“Genotyping”软件左

    侧中部出现一排操作选项，按照顺序依次点击就可以完成对样品的分析。

首先出来的是

   “NegativeFilter”，用来选择阴性或者阳性结果，选择好后点击“ApplyChange”；Calibration:

   用来做校正，如果采用了内部校正的话，按内部校正来设定，如果没有进行校正，直接进行下

  一步。

然后点击“Normalize”，对曲线进行规一化；点击：

“Group”，在Standards一栏的下

   拉菜单中有“AutoGroup”和“UseInternalStandards”两个选项，选择合适的选项后，点击

 “ComputeGroups”即可。

查看报告：

点击“Report”。

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