ELISA分析采用间接ELISA检测抗血清效价.docx

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ELISA分析采用间接ELISA检测抗血清效价

ELISA分析　采用间接ELISA检测抗血清效价。

用pH9.6,0.05mol.L-1的碳酸盐缓冲液将纯化的重组热休克蛋白稀释为20μg·mL-1,包被酶标板,每孔100μL,4℃包被过夜。

次日每孔加入100μL5%的脱脂奶粉,37℃封闭1h后,用pH7.4的PBST洗涤3次。

然后每孔加入200～51200倍稀释的兔抗血清100μL,阴性对照为1:

50倍稀释的免疫前血清,空白对照为兔抗血清稀释液（PBS）,每份样品均做1平行,37℃孵育1h后,同上洗涤3次。

再次每孔加入100μLHRP标记的羊抗兔IgG,37℃孵育1h后,同上洗涤3次。

接下来每孔加入100μLTMB显色液,37℃避光反应20min后,每孔再加入50μL2mol·L-1硫酸终止液。

最后,在酶标仪上测450nm下的OD值。

ELISA分析结果

兔抗蚌热休克蛋白的血清进行间接ELISA检测时,当（样品吸光值-空白吸光值）/（阴性吸光值-空白吸光值）>2.1即认为是阳性,经计算,此研究制备的兔抗血清效价为1：

12800（表1）。

间接ELISA的操作

按间接ELISA法进行测定:

用0.1mol/L的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液将包被抗原稀释至工作浓度,每孔加100μL，37℃孵育1h,再放入4℃冰箱过夜,弃去孔内液体,用PBST洗涤缓冲液洗三遍,每遍3min（以下简称洗涤）；每孔加1.5%明胶封闭液200μL,37℃温箱放置1h后,洗涤;将血清百倍比稀释后每孔加入100μL,37℃温箱放置1h后,洗涤;每孔加入1∶1500HRP-羊抗鼠IgG100μL,37℃温箱放置1h后,洗涤,每孔加新鲜配制的TMB-H2O2底物液100μL室温反应15min;每孔加终止液1mol/L硫酸50μL,15min内用酶标仪于波长450nm处测定OD值。

每块板同时设空白对照孔、阴性对照孔和阳性对照孔,以待测孔的OD值大于或等于阴性对照孔的2.1倍者,即P/N大于或等于2.1,判为阳性。

抗血清效价的测定采用酶联免疫吸附测定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）:

将抗原稀释于包被缓冲液（0.1mol/LNa2CO3，pH9.6）中，终浓度为5ng/μL，每孔加50μL。

并设立空白对照（只加包被缓冲液）。

4℃包被过夜后。

用1×PBST（1×PBS+（0.1%）Tween20）于室温下洗涤3次，每次5min。

然后每孔加200μL封闭液（10%的小牛血清溶于1×PBS中），4℃封闭过夜。

1×PBST洗涤3次。

加入一抗，血清样品按1∶100;1∶200倍比稀释于1×PBS中，每孔100μL，阴性孔加入100μL1∶200阴性血清，空白孔加入100μL1∶100样品血清。

37℃孵育2h。

1×PBST洗涤3次。

加入酶标二抗，酶标二抗按说明书，1∶1000稀释于1×PBS中，每孔50μL，37℃，2h。

显色，显色液［5mgOPD（邻苯二胺）;4μL30%H2O2;10mL底物缓冲液（0.2mol/LNa2HPO4，0.1mol/L柠檬酸钠）］，每孔100μL，37℃，至阴性孔显色时，加入50μL2mol/LH2SO4终止。

酶标仪上判读结果。

1.2.5抗血清的检测采用间接ELISA法测定CDK7和cyclinH两种抗血清的效价，步骤如下：

用纯化后的CDK7和cyclinH原核表达产物作为抗原，分别包被两个反应板（抗原浓度为1mg/ml，每抗原孔加100ml）。

3%BSA封闭后以未免疫的兔血清作为阴性对照，免疫后的抗血清作为一抗；辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG作为二抗；经TMB显色后用H2SO4终止反应，用酶标仪在450nm处读取数值。

间接ELISA

1.溶液准备：

包被液：

50mMNa2CO3（pH9.6），20mMTris-HCl（pH8.5）或10mMPBS（pH7.2）

封闭液：

一般封闭用BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶等

洗涤液：

0.02-0.05%Tween-20的0.1M磷酸盐缓冲液或者Tris盐缓冲液（pH7.4）

2.实验程序：

1）将抗原按适当浓度溶解于包被液中。

2）在对应的孔中加入100μl抗原，室温孵育2h或4℃过夜。

3）倒空液体并拍干残留液体，用300μl洗涤液清洗两次。

4）每个孔中加300μl封闭液，孵育1h.

5）倒空液体并拍干残留液体，用300μl洗涤液清洗两次。

6）每个孔中加100μl一抗，37℃孵育1h或室温孵育3h.

7）倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加满洗涤液，倒空液体并拍干残留液体，重复3次。

8）每个孔中加100μl二抗，室温孵育1h.

9）倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加满洗涤液，倒空液体并拍干残留液体，重复3次。

10）用洗涤液浸泡5min,拍干残留液体，这次的洗涤步骤对于减少背景信号是很重要的。

11）每个孔中加满洗涤液，倒空液体并拍干残留液体，重复5次。

12）每个孔中加100μl底物，显色30min并立即在405-410nm读数。

ELISA实验基本原理

基本原理

1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。

这一方法的基本原理是：

①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。

②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。

在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。

用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。

加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。

由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

方法类型和操作步骤

ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。

在这种测定方法中有3种必要的试剂：

①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。

根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。

（一）双抗体夹心法

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：

（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：

洗涤除去未结合的抗体及杂质。

（2）加受检标本：

使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。

洗涤除去其他未结合的物质。

（3）加酶标抗体：

使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。

彻底洗涤未结合的酶标抗体。

此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

（4）加底物：

夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。

根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。

（二）双位点一步法

在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。

这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显着提高。

单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。

在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。

当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。

钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。

（三）间接法测抗体

间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。

操作步骤如下：

（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：

洗涤除去未结合的抗原及杂质。

（2）加稀释的受检血清：

其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。

经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。

其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。

（3）加酶标抗抗体：

与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。

洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。

例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。

（4）加底物显色：

颜色深度代表标本中受检抗体的量。

本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。

（四）竞争法

竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。

以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。

操作步骤如下：

（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。

洗涤。

（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。

如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。

如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。

参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。

洗涤。

  （3）加底物显色：

参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。

参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。

待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。

（五）捕获法测IgM抗体

血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。

因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM.操作步骤如下：

（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM.洗涤。

（2）加入稀释的血清标本：

保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。

洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。

（3）加入特异性抗原试剂：

它只与固相上的特异性IgM结合。

洗涤。

（4）加入针对特异性的酶标抗体：

使之与结合在固相上的抗原反应结合。

洗涤。

（5）加底物显色：

如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。

（六）应用亲和素和生物素的ELISA

亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。

分子量60kD,每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。

现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。

生物素（biotin）又称维生素H,分子量244.31,存在于蛋黄中。

用化学方法制成的衍生物，生物素-羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide,BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。

亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。

由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。

因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。

亲和素-生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。

可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素-生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。

这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。

另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素-酶结合物，以放大反应信号。

ELISA普遍用作非放射性同位素的成键化验。

在这种方法中，通常标准配体是固定的，通过加入溶液相受体或蛋白质来使之成键。

通过加入与受体特异性反应的抗体来定量成键的受体，而且最初抗体的量以加入第二种能显色的抗体测量。

第二种抗体能识别抗体的末端，在其末端的碱性磷酸酯或过氧化物酶等与酶发生反应，从而使溶液显色。

ELISA测定操作规程（以小鼠TNF-a为例）

一、原理与意义

通过抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象,对样品中的抗原或抗体进行定性和定量检测。

本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法,用抗小鼠TNF-a单抗包被于酶标板上,标准品和样品中的TNF-a与单抗结合,加入生物素化的抗小鼠TNF-a抗体,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（Streptavidin）与生物素结合,加入酶底物邻苯二胺（OPD）,出现黄色,加终止液浓硫酸,颜色变深,在492nm处测OD值,TNF-a浓度与OD值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中TNF-a浓度。

它是样品中蛋白质含量检测的定性和定量方法。

二、试剂盒的组成

96/48微孔板（1块,已包被抗小鼠TNF-a单抗）、样品稀释液（1瓶）、第一抗体工作液（1瓶）、酶标抗体工作液（1瓶）、底物稀释液（1瓶）、终止液（1瓶）、洗涤液（20×,1瓶）、标准品（2000pg/ml,2管,冻干粉）、OPD片（3片）、坐标纸（1张）。

三、实验准备工作

1、试剂配制:

洗涤液按1:

20三蒸水稀释;标准品在用前每管加入200?

l蒸馏水溶解即可（具体见说明书）;底物工作液应在显色前5-10min将OPD片放入底物稀释液中溶解,每片加5ml液。

2、标本收集:

采集血清或体液尽早检测,2~8℃保存一天需更长时间须冷冻（-20℃）保存,避免反复冻融;组织（胎肝、胎脑等）实验前一天组织匀浆,用90%体积RIPA裂解液（PH8.0,50mMTrisHCl、1%NP-40、,0.25%sodiumdeoxycholate、150mMNaCl、1mMEDTA）和10%体积的10mMPMSF进行组织匀浆（10%）,冰上裂解30min,12000×20min后取上清,4℃待用。

3、器材准备:

酶标仪、37℃恒温烤箱、滤纸、托盘、量筒、烧杯、各种规格的移液器、离心管、管架和废液缸等。

三蒸水自备。

四、操作步骤

1、设立标准孔8孔（根据样品蛋白浓度可调整为6孔）,每孔中先各加入样品稀释液100ul,第一孔再加标准品100ul,混匀后用移液器吸出100ul,移至第二孔,如此反复作对倍稀释至第7孔,最后,从第7孔中吸出100ul弃去,使之体积均为100ul。

第8孔为空白对照。

2、加样:

待测样品孔中每孔各加入待测样品100ul。

3、将反应板置于37℃×120min。

4、洗板:

用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,向滤纸上扣干。

5、每孔中加入第一抗体工作液50ul。

6、将反应板充分混匀后置37℃×60min。

7、洗板:

用洗涤液将反应板充分洗涤4~6次,向滤纸上扣干。

8、每孔加酶标抗体工作液100ul。

9、将反应板置于37℃120min。

10、洗板:

用洗涤液将反应板充分洗涤4~6次,向滤纸上扣干。

11、每孔中加入底物工作液100ul,置于37℃暗处反应5~10min。

12、每孔中加入50ul终止液混匀。

13、用酶标仪在492nm处测吸光值。

五、计算结果与判断

1、以标准品1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0pg/ml之OD值在半对数纸上作图,画出标准曲线。

2、所有OD值都应减去空白管值后再计算。

根据样品OD值在该标准曲线图上查出或根据标准曲线公式换算出相应样品中TNF-a含量。

六、注意事项

1、以上标准孔及待查样品均建议做复孔,每次测定均要做标准孔。

2、本试剂盒宜置-20℃冷藏保存。

3、本试剂盒取出的试剂在室温（20~25℃）环境下使用,溶液应轻轻摇匀后使用。

4、本试剂盒含2M硫酸,不要将它与含叠氮化钠的废物混在一起。

5、板条开封后剩余板条要再封好,保持板条干燥。

6、避免交叉污染。

如洗涤时向样品待测蛋白含量可能高的一侧倾倒。

7、提前24h打开烤箱预热。

8、底物工作液应在显色前5~10min配制。

若配制时间过长,会变质。

9、甩尽孔内液体,每孔加350ul左右洗涤液,静止30s后甩尽。

尤其加抗体工作液或底物时尽量弄干孔内液体。

且孵育过程中要盖住各反应孔,防止液体恢复。

10、尽量防止样品待测蛋白浓度过高而出现酶标仪显示out。

当酶标仪测定值出现许多out时,可通过稀释一定倍数后用可见光分光计测定,所有孔均同时测定。

参照上海森雄科技实业有限公司提供的进口分装美国biosource公司说明书。