RTPCR实验步骤.docx

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RTPCR实验步骤

RT-PCR实验有三步：

抽提RNA，RT，PCR。

要求：

1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。

2.RT按要求做，一般不会出太大问题。

3.PCR，按常规。

但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。

1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？

必须

在RT时，引物设计有3种方法即a：

Random9mers；b：

OligodT-AdaptorPrimer；和c：

特异的下游引物。

如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR的模板继续扩增。

如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？

.ncbi.nlm.nih.gov

问题：

在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！

（注：

已肯定该基因在两种组织中都表达，且参照在两种组织都可扩增出来）

从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？

请高手指教！

解答：

1.RT-PCR有两种做法：

条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。

但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。

（promega）。

2.RT-PCR应具备的条件

高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。

3.RACE

我做过RACE（3’RACE是宝生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3’UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故，我都快绿了，有无

RT-PCR的常用标b－actin和GAPDH的使用有选择性吗？

比如不同的细胞，不同的刺激。

有关参：

RT-PCR参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些），最好分开两管，把除了引物之外的mixture统一配，拍照后，算目的基因和参的比值，这就是基因表达的相对浓度。

问：

我曾经作过同一管的PCR，有actin和目的基因引物。

虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。

请教mxbdna2003，你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度？

答：

itshoulddeterminedtheamountofRNA.butitnotforthequantitityofthePCR.itjustwasconvienenttoguesstheamountotthetemplate<（forRTandPCR）andbettrerforpublicationandeditorifhedonnotknowthepreoceduremuch.buttheamountjustusing"accuratepiptte"iswrong.itshoudberememberedtodotheinnercontrolofhousekeepinggeneeverytime.

在同一管中做RT，其实没有什么问题，不需要taq魅加量，taq酶本来就是过量的^-^，（平时做pcr的时候，完全可以再省一些taq酶的，半斤八两就可以了，我想这肯定再很多贴子里应该都谈到了。

Mg就跟不能变了，一变整个体系就变了。

能看到均一条带就很好了。

关键是摸，十八摸（太少，只争朝夕，开个玩笑）虽然用不着，但是摸上3、5摸总是必要的，首先遥分开摸，然后再一起摸，直到摸的好了，还要考虑比较的不同的模板中的量，所以我们不建议再同一管中进行，因为还有互相竞争抑制的问题，即使不同基因之间。

有关参的建议：

一定要做参的，每一次，我想。

不作参的结果是不可信的

电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，着我在好几封帖子里都谈了，再说一边我得观点，1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量，除非你能准确知道来自多少细胞，但是细胞还有死的呢。

2、以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但不能作为最终结果的，3、半定量RT-PCR应该再两管中进行，除非参基因和目的基因表达相同，长度差不多，GC含量相似，或者实在穷的要省PCR管和taq。

关于平台期和线性期的问题，实际上线性期是指数期，只不过碰巧2的冥和2的倍数是相同的。

看上去任何一个时期都可以，实际上是不对的，因为牵涉到酶促动力学的问题，这个我也不懂，有一些专门的文章，好像，涉及到很多化学的东西。

我们学医的，也没必要知道那些，但是其中主要是因为模板引物酶原料和buffer之间的关系，这种反应单靠改变其中一种成分没有用的，酶一直是过量，再加酶也没用，引物ntp都是这样。

烟鬼正传，最好选线性期的开始阶段，但是要在你的凝胶成像分辨围，所以选一个这两种的契合点。

给你一图你就明白了，再开始的时候酸的是切线，这图我在***帖过。

关于引物设计，再可能的情况下，除了常规要求之外，最好兼顾跨含子（不过，根据要求，还可以专门设计隔含子的，这样还可以用于基因组PCR）、长度小于500bp－600bp等等。

引物当然要设计成一样的退火温度，即使不再一管中，也要一样的，要在一台机器里啊。

我的引物占了冰箱一格，大部分是一个温度，这样任何几个都可以拿来披，也不用查。

我反复说过了，别用软件，就用眼睛看，软件涉及的在好，有些基因在它出软件的时候，还没发现呢，跟不要说在基因组的位置和序列了，怎么考虑含子的问题呢？

18s的引物也和著名的βactin一样是设计的，只要拿到序列就可以了，但是限制是只能用总RNA为模板，但是比actin和bubulin等可准多了，更不要说GAPDH这个破烂了。

18s除了在细胞中更相同（量）外，主要是它占的比例远远高于看家基因，所以定量更加准确，我想，不知对不对，请几位主任和eeflying指教。

我认为，就像你用某一种东西的数量去概括，因该选那种多的东西，说一座房子是由2000块砖造成的，比说又29根梁更准确吧。

更不要说没有看家基因不看家的缺点，因为他是服务于整个基因组表达谱什么的。

PE有专门的用于实时PCR的参试剂盒，就是用18s，不过我们看懂使用的那条序列，不知有没有人用过，告知其序列和genbank号。

正好问一下，我查了一些序列，一直没有去合成，主要是因为手上的actin的荧光探针还没有完，当初和成了一堆。

有那位高手用过18s的参，请问您的序列（我指的是模板的序列）？

原位杂交最好用RNA做探针，效果好一些，反正你有钱卖roche的盒子，而且量也能保证，因为转录过程嘛，沿着一条线突突地跑就是了。

正义反义也容易理清。

我觉得做RT-PCR的方法和条件及应注意的事项就是那么几条,许多专业书都有详细的描述,但是许多人还是历经多次磨难，有时就是得不出结果。

因此，我认为因为每个人所要克隆的片断不同，引物不同等，因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,我的以下经历说明：

做实验时各人的情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子。

记得我开始我的ＲＴ－PCR时，按常规方法，提取总ＲＮＡ后，首先用自己设计的下游引物进行逆转录，不断改变反应条件，进行了Ｎ次均没有结果。

后来考虑到本人的克隆的PCR的片断位于我们实验另一位同学克隆的片断当中，而该同学已经用RT-PCR克隆出她的片断（尽管她用这些ＲＴ－ＰＣＲ产物做模版再进行ＰＣＲ时也没办法重复出她的产物），因此，我先用她的引物和条件扩增出她的片断，然后用她的ＲＴ－ＰＣＲ产物作模板（有点改进，逆转录反应换用了９mers随机引物），用我的引进物进行一般PCR，终于得到我的产物，测序结果完全正确。

尽管我的这个经历别人很人遇到，但足可以说明实验可以有自己的模式，书本的知识和别人的经验很重要，但有时也不定要受到书本框框和别人经验的限制

请问：

1引物的特异退火温度怎样设定？

可以根据gc和at含量算出吗？

可以用引物报告单上的Tm值吗？

2PCR时20微升体系中cDNA应加多少比较合适？

MgCl2应加多少？

各个成分的量有无确定标准？

3PCR结果跑电泳，actin有，但跑不出目的条带，有几种原因？

与cDNA的量少有关吗？

Mg离子太多是否会抑制Taqase的活性？

一般来说引物报告单伤得是对的,也可以自己算,实际上重要的各条引物一致,剩下的可以摸的.

20中是指体积还是量?

只要不明显改变体系的离子强度,加1,2ul都可以的.mg要调的,但我总觉得没有书里讲的那么玄乎,我都是常年不变的.

如果参照有,目的没有,至少证明不是"美丽惹"的祸.原因书里应该都说了.

在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。

而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。

由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。

因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。

在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制源性的RNA酶。

RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。

外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。

在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。

这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。

而各种组织和细胞中则含有大量源性的RNA酶。

一、防止RNA酶污染的措施

1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。

2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：

有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。

3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。

4.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37℃处理12hr以上。

然后用高压灭菌除去残留的DEPC。

不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。

6.设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。

二、常用的RNA酶抑制剂

1.焦磷酸二乙酯（DEPC）：

是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。

它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

2.异硫氰酸胍：

目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。

它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。

3.氧钒核糖核苷复合物：

由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。

4.RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：

从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。

RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。

5.其它：

SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。

mRNA的分离与纯化

真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端帽子结构（m7G）和3’端的Poly（A）尾巴。

绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3’端存在20-30个腺苷酸组成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。

这种结构为真核mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。

mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。

此法利用mRNA3’末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。

寡聚（dT）纤维素柱纯化mRNA

一、试剂准备

1．3M醋酸钠（pH5.2）

2．0.1MNaOH

3．1×上样缓冲液：

20mMTris-HCl（pH7.6）；0.5MNaCl；1MEDTA（pH8.0）；0.1%SLS（十二烷基氨酸钠。

配制时可先配制Tris-HCl（pH7.6）、NaCl、EDTA（pH8.0）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育（30min）的10%SLS至终浓度为0.1%。

4．洗脱缓冲液：

10mMTris-HCl（pH7.6）；1mMEDTA（pH8.0）；0.05%SDS

5．无水乙醇、70%乙醇

6．DEPC

二、操作步骤

1．将0.5-1.0g寡聚（dT）-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。

2．用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管，将寡聚（dT）-纤维素装柱0.5-1ml，用3倍柱床体积的DEPCH2O洗柱。

3．使用1×上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。

4．将RNA溶解于DEPCH2O中，在65℃中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2×上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。

当RNA上样液全部进入柱床后，再用1×上样缓冲液洗柱，继续收集流出液。

5．将所有流出液于65℃加热5min，冷却至室温后再次上柱，收集流出液。

6．用5-10倍柱床体积的1×上样缓冲液洗柱，每管1ml分部收集，OD260测定RNA含量。

前部分收集管中流出液的OD260值很高，其含物为无Poly（A）尾的RNA。

后部分收集管中流出液的OD260值很低或无吸收。

7．用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱Poly（A+）RNA，分部收集，每部分为1/3-1/2柱体积。

8．OD260测定Poly（A+）RNA分布，合并含Poly（A+）RNA的收集管，加入1/10体积3MNaAc（pH5.2）、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30min。

9．4℃离心，10000g×15min，小心吸弃上清。

用70%乙醇洗涤沉淀。

[注意：

此时Poly（A+）RNA的沉淀往往看不到]。

4℃离心，10000g×5min，弃上清，室温晾干。

10.用适量的DEPCH2O溶解RNA。

三、注意事项

1．整个实验过程必须防止Rnase的污染。

2．步骤（4）中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNAPoly（A+）尾处的二级结构，使Poly（A+）尾充分暴露，从而提高Poly（A+）RNA的回收率；另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。

所以此步骤不能省略。

3．十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降，会阻碍柱液体流动，若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl。

4．寡聚（dT）-纤维素柱可在4℃贮存，反复使用。

每次使用前应该依次用NaOH、灭菌ddH2O、上样缓冲液洗柱。

5．一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5μgPoly（A+）RNA，约相当于上柱总RNA量的1%-2%。

RNA酶保护试验（（RNaseProtectionAssay,RPA）是通过液相杂交的方式,用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。

与Northern杂交和RT-PCR比较，RPA有以下几个优点：

1．检测灵敏度比Northern杂交高。

由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。

2．由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。

3．由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。

4．步骤较少，耗时短。

与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。

5．RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。

6．一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。

7．检测分子长度可以任意设置，灵活性大。

RPA的缺点是需要同位素标记探针。

一、试剂准备

1．GACUPOOL：

取100mMATP、CTP、GTP各2.78μl、100mMUTP0.06μl，加DEPCH2O至100μl。

2.杂交缓冲液IPES0.134g、0.5MEDTA（pH8.0）20μl、5MNaCl0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPCH2O至10ml。

3.RNase消化液：

5MNaCl120μl、1MTris-HCl（pH7.4）20μl、0.5MEDTA（pH8.0）20μl、RNaseA（10mg/ml）8μl、RNaseT1（250U/μl）1μl，加DEPCH2O至2ml

二、操作步骤

1．反义RNA可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备，也可以用含启动子的PCR产物为模板制备，本文介绍后者。

（1）设计含T7启动子的PCR引物

由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板，所以一对引物中的下游引物5’-端要含T7启动子序列:

T7启动子序列为：

5’-TAATACGACTCACTATAGGG

引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。

PCR产物的长度决定了反义RNA探针的长度，具体设计时可考虑100-400bp长。

最好采用巢式PCR，即先扩增出一较长的片段，再以该片段为模板扩增出较短的片段，以保证探针的特异性，如下图所示：

上游引物

下游引物ⅡT7启动子序列

下游引物Ⅰ

（2）PCR

先用上游引物和下游引物Ⅰ进行PCR，再以PCR产物为模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7进行二次PCR（具体操作参见PCR章节）。

（3）探针合成标记与纯化

在0.5ml离心管中加入下列试剂：

RNasin（40U/μl）0.5μl

GACUPOOLGAC

（含GTP、CTP、ATP各2.75mM,UTP61μM）2μl

[α-32P]UTP（10μCi/μl）2.5μl

DTT（二硫糖醇，0.1M）1μl

5×转录buffer2μl

模板（50ng/μl）1μl

T7RNA聚合酶（15U）1μl

混合后，短暂离心，37OC保温1hr。

加入DNaseⅠ（10U/μl）1μl,37OC15min,然后75OC10min以灭活DNAseⅠ和T7RNA聚合酶。

加入：

饱和酚50μl

氯仿50μl

酵母tRNA（2μg/μl）4μl

DEPCH2O100μl

室温下充分混匀，离心10000g×2min。

取上层液置另一0.5ml离心管中，加入100μl氯仿，混匀，离心10000g×2min。

将上层液转移至另一0.5ml离心管中，再加入3MNaAc10μl、预冷无水乙醇250μl，混匀后，-20OC静置30min。

4OC离心13500g×10min。

弃上清液，沉淀用75%乙醇100μl洗涤，4OC离心13500g×2min,弃上清液。

室温下挥发残留乙醇。

加入50μl杂交缓冲液溶解沉淀，4OC下保存待用。

可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。

（参见本节电泳步骤）。

2．杂交

（1）RNA提取后溶解在杂交缓冲液中，浓度为1μg/μl。

（2）取8μlRNA加入1-3μl探针（根据探针检测结果调整）于0.5ml离心管中。

（2）80OC保温2min，然后40-45OC下杂交12-18hr。

3.消化

（1）杂交管于37OC保温15min，加入RNase消化液，37OC保温30min。

（2）加入10%SDS10μl、10μg/μl蛋白酶K20μl，混匀，37OC保温10min。

（3）加入65μl饱和酚和65μl氯仿，混匀，室温离心，10000g×2min。

（4）转移上层液到另一0.5离心管中，加入10μl酵母tRNA和3MNaAc15μl，再加入200μl异丙醇，混匀后，置-20OC30min，4OC离心,135000g×10min。

（5）弃上清液，室温下挥发乙醇，加入5-8μl上样缓冲液溶解沉淀。

4、电泳与放射自显影

（1）配制凝胶：

（50ml）

40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺（19：

1）6.25ml

5×TBE10ml

尿素24g

加H2O至50ml

溶解后加入25%过硫酸胺50μl，TEMED50μl，混匀，注入电泳槽中，插入梳，待胶凝固。

（2）预电泳

以1×TBE为上下槽电泳缓冲液，加上电压后进行预电泳，如果用测序电泳装置，电压应达2000v以上，功率设定为100w，温度设为50OC。

待胶板温度达50OC时，暂停电泳，准备加样。

（3）加样

将已溶解在加样缓冲液中的样品80OC加热2min，立即加样到胶孔中，电泳1-2hr。

（电泳条件同预电泳）。

（3）电泳结束后，打开胶板，用滤纸取下胶，覆上一层保鲜膜，放置于暗盒中，暗室红光下，压上一X片，盖上暗盒，-70OC曝光1-3天。

暴光结束后，将X光片显影、定影、水洗、晾干。

三、注意事项

1．本实验大部分为RNA操作，注意RNA酶的污染。

2．RNase消化液消化未杂交的单链RNA和探针RNA，当探针与样品之间有碱基错配时，错配位点也将被消化，因此会产生片段较小的杂交片段。

因此进行PCR时，采取尽量减少错配的措施。

3、同位素对RNA合成有一定影响，有时会产生非全长的探针。

因此，标记时间不宜过长。

4、RNase消化液有时会产生过度消化而无检测信号，可以将消化液稀释10-100倍后使用。

可能问题出在标本的保存：

一般四小时之就应处理，分离出细胞

说的是套式PCR,可以在你的第一次PCR两个引物,再设计一对引物进行第二次PCR就行了

如果你的第一次PCR刚好包括目的片段,那只好设计个更长的了

第二次的引物设计要求可以低一点

以50μl体系为例

引物各1μl

第一次PCR产物5μl

二次PCR和巢式PCR，即设计两对引物进行扩增，不是一个概念，它是拿第一次的PCR产物，稀释100-1000倍做模板，加入底物，从新进行扩增反应，以期增加产物的量

我做RT-PCR时,提总RNA时,都是用灭菌DEPC水,按1:

100稀释后测OD260和OD280,后根据公式:

RNA浓度=OD260*稀释度/25（ug/ul）,后用1mgtotalRNA分离mRNA.做逆转录及PCR,效果