新型磁性纳米电化学DNA生物传感器的研究重点.docx

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新型磁性纳米电化学DNA生物传感器的研究重点

研究报告

新型磁性纳米电化学DNA生物传感器的研究

程圭芳黄翠华赵洁谭雪莲何品刚方禹之

*

（华东师范大学化学系,上海200062

摘要利用高分子磁性纳米粒子有效地将磁性分离、富集和化学修饰电极的电化学检测相结合,构建以亚

甲基蓝为嵌入式杂交指示剂的电化学DNA生物传感器。

此传感器对碱基错配的序列有较好的选择性。

传感

器对目标序列的响应在110-13~110-6mol/L范围内呈线性关系;检出限为4.310-14mol/L。

这种新型

的高分子磁性纳米粒子电化学DNA生物传感器具有高的灵敏度,其线性范围宽,成本低,为DNA的痕量分析

提供了一种新的思路。

关键词电化学,脱氧核糖核酸,杂交,磁性纳米粒子,磁性分离富集,生物传感器20080620收稿;20080903接受

本文系国家自然科学基金（Nos.20775027,20675031和上海市纳米专项（No.0652nm006资助项目

*Emai:

lyzfang@chem.ecnu.edu.cn

1引言

电化学生物传感器因其方法简便、灵敏度高、价格便宜等优点越来越受到广泛的关注[1~5]。

随着对

电化学生物传感器的研究和应用的迅速发展,对其选择性、以及检测重现性等都提出了更高的要求。

目前提高检测灵敏度的方法主要有:

利用PCR扩增技术来弥补DNA传感器灵敏度低的不足

[6];通过化学修饰电极提高杂交指示剂在电极表面响应的灵敏度

[7];用纳米材料作为固体基质增加探针的固定量[8]等。

高分子磁性纳米粒子是一种新型的亲和性固相载体,能够方便地将所需测定组分分离出

来,并可有效地降低生物分子的非特异性吸附

[9];国外有报道将磁性纳米粒子用于免疫分析,酶、基因、蛋白质固定,DNA纯化,抗癌药物的运输等

[10~12]。

Wang等[10]开发出一种电化学基因磁性杂交检测装置,它是利用磁性分离以及酶标记放大的特性;Palecek等[11]利用磁性纳米粒子开发出一种DNA杂交

的检测装置;Taton等[13]研究发现纳米粒子功能化的寡聚核苷酸探针对DNA杂交有很好的选择性。

本研究组在利用磁纳米粒子来提高DNA检测的灵敏度方面进行了研究

[14]。

本实验采用共沉淀的方法合成了一种表面羧基功能化的高分子磁性纳米粒子,应用于DNA的固定、分离与富集,以亚甲蓝为杂交电化学指示剂,实现了靶寡聚核苷酸片段的检测。

检测过程中采用碳纳米管修饰电极,并用特制的电解池进行磁性富集,显著提高了检测灵敏度,为DNA的痕量分析检测提供了良好的方法。

2实验部分

2.1仪器与试剂

以人体增殖基因PBGD（142~170号作为探针序列:

5NH2CCTCCAGTGACTCAGCACAGGTTCCCCAG3;完全互补序列的DNA目标序列:

5CTGGGGAACCTGTGCTGAGTCACTGGAGG3;3个碱基错配序列的DNA目标序列:

5CTGGTGAACCTGTCCTCAGTCACTGGAGG3;非互补序列的DNA目标序列:

5AACCCCTTAAACAAAATCAAGTGAATCAA3（上海申能博彩生物科技有限公司。

EDC（美国Sigma公司;咪唑（江苏光耀化学公司。

苯乙烯（S,t上海试剂一厂,丙烯酸（AA,上海润捷化学试剂有限公司,二乙烯基苯（DVB,上海化学试剂公司,以上试剂均经减压蒸馏;过氧化苯甲酰（BPO,上海东懿化学试剂公司;聚乙二醇4000第37卷

2009年2月分析化学（FENXIHUAXUE研究报告ChineseJournalofAnalyticalChemistry第2期169~173

（PEG,上海浦东高南化工厂;无水乙醇（EtOH,上海云翔化工有限公司;FeCl3!

6H2O,FeSO4!

7H2O,NH3!

H2O（上海化学试剂公司;PBS缓冲液（17.6gNaCl+0.2gKCl+1.15gNa2HPO4+0.2gKH2PO4,配成1000mL溶液,pH7.3;亚甲蓝（MB,上海化学试剂厂;羧基化的多壁碳纳米管（MWNT-COOH（南昌太阳纳米科技公司,直径:

10~30nm,管长:

1~10m;水采用超纯水（艾科浦超纯化水机。

CHI832电化学分析仪（美国CHIInstrumentsInc.公司,自制电化学检测池;温控磁力搅拌器（HTCo.;501型超级恒温器（上海市实验仪器厂;Mexus670FTIR红外光谱仪（美国Nicolet公司;JEOL2010荧光透射电镜（美国GATANMSC794CCDCamera。

2.2实验方法

2.2.1电化学检测池的设计与制备将玻碳（d=3mm嵌入（5mm5mm1mmPVC材质底座中央为工作电极,与内部为倒椎体腔型高为2mm相同材质的圆柱体组成电化学检测池,上下部分用螺丝旋紧,以免漏液。

采用三电极系统,其中铂对电极和Ag/AgCl参比电极从上方插入溶液中;检测时可在电极下放置永久磁铁,使悬浮液中的磁纳米颗粒在磁场的作用下沉积在电极表面,达到富集的目的（见图1B。

2.2.2磁性高分子微球的制备磁性Fe3O4纳米粒子的制备见参考文献[15]。

将10mL新制备的磁性Fe3O4纳米粒子（0.05mol/L、3gPEG、60mLEtOH和10mLH2O混合,超声至PEG完全溶解。

在N2气氛保护下相继加入4mLSt、4mLAA、0.05mLDVB和少量BPO（0.5g。

机械搅拌10min,升温到70∀,搅速300r/min,反应9h,得到棕黄色乳液。

磁性分离,并用无水乙醇反复浸洗,得棕黑色磁性聚苯乙烯粒子,平均粒径为20~30nm。

电导滴定法测定该磁性纳米粒子表面的羧基含量为0.489mmol/g。

2.2.3碳纳米管修饰电极的制备玻碳电极用Al2O3微粒（粒径为0

.05m磨至镜面,再分别用1.0mol/LHNO3、1.0mol/LNaOH和三次蒸馏水超声清洗5min。

将2LMWNTCOOH（0.2g/L的水溶液均匀滴涂到处理好的玻碳电极表面,在空气中凉干。

置于PBS中备用。

2.2.4DNA生物传感器的制备在1.0mL9.1mg/L高分子磁性纳米粒子悬液中加入100L0.1mol/L的咪唑溶液室温下活化30min后,将1.0OD（33.0g的5氨基修饰的ssDNA探针和200L0.008mol/LEDC溶液加入到上述混合液中,室温下搅拌24h

[16]。

通过磁性沉降,用PBS洗涤

至上清液中无ssDNA存在后,贮于4∀冰箱中保存。

2.2.5杂交与测试在DNA生物传感器悬浮液中加入一定量的目标核酸链,38∀下杂交40min后,用PBS溶液洗涤数次;再加入一定量的杂交指示剂亚甲基蓝（MB（CMB=1.03mmol/L5L,于38∀下缓慢搅拌10min后,用PBS洗涤,将未嵌入的杂交指示剂亚甲基蓝除去。

然后,将溶液完全转移至自制的电解池中进行电化学检测。

实验过程见图1

。

图1DNA生物传感器检测示意图

Fig.1SchematicrepresentationofDNAbiosensorpreparationandhybridization（Aand

detectionpattern（B

3结果与讨论

3.1DNA生物传感器的表征

3.1.1红外光谱表征将DNA传感器的磁性纳米粒子的红外谱图（图2a与单纯的高分子聚合物包裹170分析化学第37卷

的磁性纳米粒子红外谱图（图2b相比,发现高分子聚合物包裹的磁性纳米粒子在1702cm-1的吸收峰

消失;在1638cm-1处的吸收峰上升并位移至1645cm-1左右,此为酰胺键上的羰基O的伸缩振动

峰;另外,在1076和1155cm-1上分别出现两个较强的吸收峰,代表CHP

的伸缩振动;这表明

图2高分子聚合物包裹的磁性纳米粒子（a和DNA探针（b的红外光谱图

Fig.2IRspectraofpolymercoatedmagneticnanoparti

cles（aandDNAprobe（b寡聚核苷酸探针序列已被固定到高分子磁性纳米粒

子表面。

3.1.2荧光标记核酸序列表征为了进一步证实

所制备DNA传感器的有效性,分别将标记有荧光基

团的寡聚核苷酸链直接固定到高分子磁性纳米粒子

表面（图3A,或将标记有荧光基团的寡聚核苷酸互

补链与DNA传感器杂交（图3B。

在荧光显微镜下

可观察到固定了荧光标记核苷酸序列的磁性粒子有

明显的荧光信号（A2;而与标记荧光基团的互补DNA序列杂交后的DNA传感器（B2也有明显的荧光信号。

A2和B2都发射较强的荧光,进一步证明了

本研究所采用的DNA固定方式是可行的。

图3（A直接固定荧光标记ssDNA的磁性纳米粒子透射电镜图（A1和荧光显微镜图（A2;（BDNA

探针与荧光标记互补ssDNA杂交后的透投射电镜图（B1和荧光显微镜图（B2

Fig.3（ATEM（A1andflorescentmicroscope（A2imagesofmagneticnanoparticlesimmobilizedwithfluo

ssDNA;（BTEM（B1andflorescentmicroscope（B2imagesofDNAprobehybridizationwithfluossDNA

3.2碳纳米管修饰电极对亚甲基蓝的电化学响应的表征

在较高的离子强度下,亚甲基蓝MB与DNA的作用以嵌入方式为主[17]。

由

MB在修饰电极上响应

图4MB在MWNTs修饰电极（a和裸玻碳电

极（b上的DPV图,cMB=110-6mol/L,pH7.3Fig.4DPVplotsofmethyleneblue（MBatMWNTsCOOHCME（aandbareGCE（b,cMB=110-6mol/L,pH7.3的峰电流（a要明显地高于裸电极（b,且峰电位由

-0.238V移至-0.220V（图4可知,MCNTs修饰电极

对MB的还原具有良好的催化作用。

3.3磁性微球用量对电化学检测的影响

通过对高分子磁性纳米粒子用量的实验,发现随着磁

性纳米粒子的加入,杂交信号有所下降直至达到平台

（图5,其原因是不导电的高分子磁性纳米粒子在电极表

面的沉积会阻碍电子传递,使杂交电信号降低。

实验中选

用高分子磁性纳米粒子用量为0.04g/L,对信号的降低率仅为0.5%左右。

3.4传感器杂交条件的优化

以三碱基错配的寡聚核苷酸序列为对照,分别研究了

传感器与完全互补序列杂交时的杂交温度、时间及离子强

度对杂交效率的影响。

研究结果表明,以pH7.3磷酸生理

缓冲溶液（含有1.0mol/LNaCl为杂交液,38∀交杂40min时,完全互补序列与三碱基错配序列的杂171第2期程圭芳等:

新型磁性纳米电化学DNA生物传感器的研究

3.5基于磁性高分子微球的DNA传感器对特定DNA序列杂交反应的电化学检测

3.5.1对特定DNA片段检测选择性的研究图6比较了DNA生物传感器分别与完全互补的寡聚核图5磁颗粒用量对DPV杂交信号的影响Fig.5EffectofmagneticnanoparticleonDPVresponsesafterhybridization苷酸序列,一、二和三碱基错配的寡聚核苷酸序列以

及非互补的寡聚核苷酸序列杂交后的DPV信号。

其中,三碱基错配序列与DNA杂交的DPV信号仅

为完全互补序列的28.5%,而非互补序列杂交的信

号与空白几乎相同,证明了基于高分子磁性纳米粒

子的DNA生物传感器具有良好的选择性。

3.5.2DNA序列的定量检测按相同操作步骤,

将一系列不同浓度的完全互补寡聚核苷酸序列与传

感器杂交,分别在普通和自制电解池中测定杂交后

MB电化学信号。

从图7a上可以看出,在无磁富集

条件下,仅在1.010-6mol/L~1.010-12mol/L

范围内,检测信号与目标链浓度成线性关系

（图7a,其线性方程为ip（A=3.09lgctarget

（pmol/L-2.59,相关系数为0.994,检出最低浓度为5.810-13mol/L（3。

当有磁场存在时,在110-6~110-13mol/L范围内,响应信号与目标链的浓度呈线性关系（图7b,其线性方程为

ip（A=25.8+25.3lgctarget（pmol/L,相关系数为0.992和检出限为4.310-14mol/L。

由此可见,当

采用磁场富集进行检测的,溶液中的微球能在电极上沉积完全,使传感器上的MB在电极表面得到富集,使其检测灵敏度优于纳米金胶及银扩增金胶体系[18,19]

。

图6DNA传感器与不同序列寡聚核苷酸片段杂交后在

多壁碳纳米管修饰电极上的DPV响应

Fig.6DPVplotsofMBinDNAbiosensoratMWNT

COOHCMEafterhybridizedwithdifferentoligonucleotide

sequences

1.complementarysequence;

2.onemismatchedsequence;3.twomismatchedseuqence;

4.threemismatchedsequence;5.noncomplementarysequence.图7DNA探针对互补序列检测无磁富集（a和有磁富集（bFig.7CalibrationcurvesofDNAbiosensorforelectrochemicaldetectionofcomplimentaryDNA（awithoutmagneticenrichmentand（bwithmagneticenrichment

References

1WangJ,LiuGD,MerkociA.J.Am.Chem.Soc.,2003,125:

3214~3215

2TakenakaS,UtoY,KondoH,IharaT,TakagiM.Anal.Biochem.,1994,218:

436~443

3XuC,CaiH,HePG,FangYZ.FreseniusJ.Anal.Chem.,2001,369,428~432

4LiSha（李莎,WangYanYan（王艳艳,ZhaoZiXia（赵紫霞,QinXia（秦霞,WangXinSheng（王新胜,,（A172分析化学第37卷

5ZhuNN,CaiH,HePG,FangYZ.Anal.Chim.Acta,2003,481:

181~189

6OlexovaL,KuchtaT,PangalloD.IngredientiAlimentari.,2005,4:

16~20

7MillanKM,SaraulloA,MikkelsenSR.Anal.Chem.,1994,66:

2943~2948

8LinL,ZhaoHQ,LiJR,TangJA,DuanMX,JiangL.Biochem.Biophys.Res.Commun.,2000,274:

817~8209PalecekE,FojtaM.Bioelectrochemistry,2002,56:

85~90

10WangJ,XuD,ErdemA,PolskyR,SalazarMA.Talanta,2002,56:

931~38

11PalecekE,BillovaS,HavranL,KizekR,MiculkovaA,JelenF.Talanta,2002,56:

919~930

12FredjHB,HelaliS,EsseghaierC,VonnaL,VidalL,AbdelghaniA.Talanta,2008,75:

740~747

13TatonTA,MirkinCA,LetsingerRL.Science,2000,298:

1757

14ChengGF,ZhaoJ,TuYH,HePG,FangYZ.Anal.Chim.Acta,2005,533:

11~16

15MoldayRS,USPatent4452773,1984

16ChuBCF,WahlGM,OrgelLE.NucleicAcides.Res.,1983,11:

6513~6529

17KaraP,KermanK,ZkanD,MericB,ErdemA,ZkanZO,OzsozM.ElectrochemistryCommunication,2002,4（19:

705~709

18CaiH,WangQJ,HePG,FangYZ.Anal.Chim.Acta,2002,469:

165~172

19WangJ,XuD,KawdeAN,PolskyR.Anal.Chim.Acta,2001,431:

219~224

ANovelElectrochemicalBiosensorforDeoxyribonucleicAcid

DetectionBasedonMagnetiteNanoparticles

CHENGGuiFang,HUANGCuiHua,ZHAOJie,TANXueLian,HEPinGang,FANGYuZhi

*（DepartmentofChemistry,EastChinaNormalUniversity,Shanghai200062

AbstractDNAdetectionisofgreatimportanceforclinicaldiagnosisandfoodsafety.Inthisstudy,asensitiveelectrochemicalbiosensorforDNAsequencemutationdetectionbasedonthemagneticnanoparticlesseparationandenrichmentwasproposed.Fortheproposedbiosensor,theprobesequenceswereimmobilizedonthesurfaceofcarboxylfunctionedmagneticnanoparticletorecognizethetargetsequencesandmethyleneblue

（MBwasusedashybridizationindicator.Intherangeof110-13mol/Lto110-6mol/L,theconcentra

tionofcomplementarysequencewaslinearlywiththeresponseoftheelectrochemicalsignalofMBandthedetectionlimitwas4.310-14

mol/Loftargetoligonucleotide.TheimprovementofdetectionsensitivityforthisbiosensorwasmainlyduetothemagneticeenrichmentandMCNT/GCE.

KeywordsElectrochemistry,deoxyribonucleicacid,hybridization,magneticnanoparticle,magneticseparationandenrichmen,tbiosensor

（Received20June2008;accepted3September2008#色谱定性与定量∃（第二版

该书主要介绍了色谱分析中常用的定性和定量方法。

在定性分析中除了介绍经典的保留值定性的各种方法外,对近年来在色谱定性分析中使用的质谱和红外光谱的谱图解析作了较详细的介绍。

定量分析中除了介绍各种定量分析方法外,对数据处理中的误差分析、定量结果的评价和表达方法作了详细介绍。

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