第9章环境卫生微生物检验Word格式文档下载.docx
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10的悬液。
（二）膏、霜、乳剂半固体状样品
1、亲水性样品
称取10g，加到装有玻璃珠及90mL灭菌生理盐水的三角瓶中，充分振荡混匀，静置15分钟。
用其上清液作为1:
2、疏水性样品
称取10g，放到灭菌的研钵中，加10mL灭菌液状石蜡，研磨成黏稠状，再加入10mL灭菌吐温80，研磨待溶解后，加70mL灭菌生理盐水，在40~44℃水浴中充分混合，制成1:
（三）固体样品
称取10g，加到90mL灭菌生理盐水中，充分振荡混匀，使其分散混悬，静置后，取上清液作为1:
如有均质器，上述水溶性膏、霜、粉剂等，可称10g样品加入90mL灭菌生理盐水，均质1~2分钟；
疏水性膏、霜及眉笔、唇膏等，称10g样品，加10mL灭菌液状石蜡，10mL灭菌吐温80,70mL灭菌生理盐水均质3~5分钟。
三、化妆品微生物指标检验方法
（一）菌落总数
菌落总数（aerobicbacterialcount）是指化妆品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度、培养时间、pH、需氧性质等），1g（1mL）检样中所含菌落的总数。
所得结果只包含一群本方法规定的条件下生长的嗜中温的需氧性菌落总数。
测定菌落总数便于判明样品杯细菌污染的程度，是对样品进行卫生学总评价的综合依据。
1、检验步骤
（1）用灭菌吸管吸取1：
10稀释的检液2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。
另取1mL注入到9mL灭菌生理盐水试管中（注意勿使吸管接触液面），更换一支吸管，并充分混匀，制成1:
100检液。
吸取2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。
如样品含菌量高，还可再稀释成1：
1000、1：
10000、……，每种稀释度更换一支吸管。
（2）将融化并冷至45~50℃的卵磷脂吐温80营养琼脂培养基倾注到平皿内，每皿约15mL，随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平民，置36±
1℃培养箱内培养48±
2小时。
另取一个不加样品的灭菌空平皿，加入约15mL卵磷脂吐温80营养琼脂培养基，待琼脂凝固后，翻转平皿，置36±
2小时，为空白对照。
（3）为便于区别化妆品中的颗粒与菌落，可在没100mL卵磷脂吐温80营养琼脂中加入1mL0.5%的TTC溶液，如有细菌存在，培养后菌落呈红色，而化妆品的颗粒颜色无变化。
2、菌落计数方法
先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5~10倍的放大镜检查，以防遗漏。
记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。
若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数。
若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以2，以代表全皿菌落数。
3、菌落计数及报告方法
（1）首先选取平均菌落数在30~300个之间的平皿，作为菌落总数测定的范围，每当有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数（见表9-1中例1）。
（2）若有两个稀释度，其平均菌落数均在30~300个之间，则应求出两菌落总数之比值来决定，若其比值小于或等于2，应报告其平均数，若大于2则报告期中稀释度较低的平皿的菌落数（见表9-1中例2及例3）。
（3）若所有稀释度的平均菌落数均>
300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表9-1例4）。
（4）若所有稀释度的平均菌落数均<
30个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表9-1例5）。
（5）若所有稀释度的平均菌落数均不在30~300个之间，其中一个稀释度>
300个，而相邻的另一稀释度<
30个时，则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表9-1中例6）
（6）若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每克或每毫升<
10CFU。
（7）菌落计数的报告，菌落数在10以内时，按实有数值报告之，>
100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。
为了缩短数字后面零的个数，可用10的指数来表示
（见表9-1报告方式栏）。
在报告菌落数为“不可计”时，应注明样品的稀释度。
表9-1细菌计数结果及报告方式
例次
不同稀释度平均菌落数
两稀释度
菌数之比
菌落总数
CFU/mL或CFU/g
报告方式
10-1
10-2
10-3
1
1365
164
20
-
16400
16000或1.6×
104
2
2760
295
46
1.6
38000
38000或3.8×
3
2890
271
60
2.2
27100
27000或2.7×
4
不可计
4650
513
513000
510000或5.1×
105
5
27
11
270
270或2.7×
102
6
305
12
30500
31000或3.1×
7
<
1×
10
CFU：
菌落形成单位
（二）粪大肠菌群
粪大肠菌群（Fecalconliforms）系一群需氧及兼性厌氧革兰阴性无芽胞杆菌，在44.5±
0.5℃培养24~48小时能发酵乳糖产酸产气。
该菌直接来自粪便，是重要卫生指标菌。
1、检验步骤
（1）取10mL1:
10稀释的检液，加到10mL双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基中，置44±
0.5℃培养箱中培养24~48小时，如不产酸也不产气，则报告为粪大肠菌群阴性。
（2）如产酸产气，划线接种到伊红亚甲蓝琼脂平板上，置36±
1℃培养18~24小时。
同时取该培养液1~2滴接种到蛋白胨水中，置44±
0.5℃培养24±
经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。
粪大肠菌群在伊红亚甲蓝琼脂培养基上典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。
也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落，亦常为粪大肠菌群，应注意挑选。
（3）挑取上述可疑菌落，涂片革兰染色镜检。
（4）在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂约0.5mL，观察靛基质反应。
阳性者液面呈玫瑰红色；
阴性反应液面呈试剂本色。
2、检验结果报告
根据发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。
（三）铜绿假单胞菌
铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）属于假单胞菌属，为革兰阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。
此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42±
1℃条件下能生长。
该菌对人有致病力，可使伤处化脓，引起败血症等。
（1）增菌培养：
取1:
10样品稀释液10mL加到90mLSCDLP液体培养基中，置36±
如有铜绿假单胞菌生长，培养液表面多有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。
（2）分离培养：
从培养液的薄膜处跳取培养物，划线接种在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上，置36±
凡铜绿假单胞菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素，此培养基选择性强，大肠埃希菌不能生长，革兰阳性菌生长较差。
在缺乏十六烷基三甲基溴化铵琼脂时也可以用乙酰胺培养基进行分离，将菌液划线接种于平板上，置36±
铜绿假单胞菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色，其他菌不生长。
（3）染色镜检：
挑取可疑的菌落，涂片，革兰染色，镜检为革兰阴性者应进行氧化酶试验。
（4）氧化酶试验：
取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑取铜绿假单胞菌可疑菌涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基对苯二胺试液，在15~30秒钟之内，出现粉红色或紫红色时，为氧化酶试验阳性；
若培养物不变色，为氧化酶试验阴性。
（5）绿脓菌素试验：
取可疑菌落2~3个，分别接种在绿脓菌素测定培养基上，置36±
1℃培养24±
2小时，加入氯仿3~5mL，充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿液内，待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中加入1mol/L的盐酸1mL左右，振荡后，静置片刻。
如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，表示被检物中有绿脓菌素存在。
（6）硝酸盐还原产气试验：
挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培养物，接种在硝酸盐胨水培养基中，置36±
2小时，观察结果。
凡在硝酸盐胨水培养基内的小导管中有气体者，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。
（7）明胶液化试验：
取铜绿假单胞菌可疑菌落的纯培养物，穿刺接种在明胶培养基中，置36±
2小时，取出放冰箱10~30分钟，如仍呈溶解状或表面溶解时即为明胶液化试验阳性；
如凝固不溶者为阴性。
（8）42℃生长试验：
挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放在42±
1℃培养箱中，培养24~48小时，铜绿假单胞菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。
被检样品经增菌分离培养后，经证实为革兰阴性杆菌，氧化酶就绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌；
如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42℃生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌。
（四）金黄色葡萄球菌
金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）为革兰阳性球菌，呈葡萄状排列，无牙胞，无荚膜，能分解甘露醇，血浆凝固酶阳性。
该菌是葡萄球菌中对人内致病力最强的一种，能引起人体局部化脓性病灶，严重时可导致败血症。
（1）增菌：
10稀释的样品接种到90mLSCDLP液体培养基中，置36±
1℃培养箱，培养24±
注：
如无此培养基也可用7.5%氯化钠肉汤。
（2）分离：
自上述增菌培养液中，取1~2接种环，划线接种在BairdParker培养基，如无此培养基也可划线接种到血琼脂平板，置36±
1℃培养24~48小时。
在血琼脂平板上菌落呈金黄色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。
在BairdParker培养基上为圆形，光滑，凸起，湿润，直径为2~3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一浑浊带，在其外层有一透明带。
用接种针接触菌落似有奶油树胶的软度。
偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但无混浊带及透明带。
挑取单个菌落分纯在血琼脂平板上，置36±
挑取分纯菌落，涂片，进行革兰染色，镜检。
金黄色葡萄球菌为革兰阳性菌，排列成葡萄状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌，菌体较小，直径约为0.5~1μm。
（4）甘露醇发酵试验：
取上述分纯菌落接种到甘露醇发酵培养基中，在培养基液面上加入2~3mm的灭菌液状石蜡，置36±
2小时，金黄色葡萄球菌应能发酵甘露醇产酸。
（5）血浆凝固酶试验：
吸取1：
4新鲜血浆0.5mL，放入灭菌小试管中，加入待检菌24±
2小时肉汤培养物0.5mL。
混匀，放36±
1℃恒温箱或恒温水浴中，每半小时观察一次，6小时之内如呈现凝块即为阳性。
同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物及肉汤培养基各0.5mL，分别加入灭菌1:
4血浆0.5mL混匀，作为对照。
凡在上述选择平板上有可以菌落生长，经染色镜检，证明为革兰阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸，血浆凝固酶试验阳性者，可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌。
（五）霉菌和酵母菌
霉菌和酵母菌数测定（Determinationofmoldsandyeastcount）是指化妆品检样在一定条件下培养后，1g或1mL化妆品中所污染的活的霉菌和酵母菌数量，借以判明化妆品被霉菌和酵母菌污染程度及其一般卫生状况。
本方法根据霉菌和酵母菌特有的形态和培养性，在虎红培养基上，置28±
2℃培养72小时，计算所生长的霉菌和酵母菌数。
检验操作步骤
（1）样品稀释：
建菌落总数测定
（2）取1:
10、1:
100、1:
1000的检液各1mL分别注入灭菌平板内，每个稀释度各用2平板，注入融化并冷至45±
1℃左右的虎红培养基，充分摇匀。
凝固后，翻转平板，置28±
1℃培养72±
2小时，计数平板内生长的霉菌和酵母菌数。
若有霉菌蔓延生长，为避免影响其他霉菌和酵母菌的计数时，于48±
2小时应及时将此平板取出计数。
（3）计算方法：
先点数每个平板上生长的霉菌和酵母菌菌落数，求出每个稀释度的平均菌落数。
判定结果时，应选取菌落数在5~50个范围之内的平皿计数。
乘以稀释倍数后，即为每g（或每mL）检样中所含的霉菌和酵母菌数。
其他范围内的菌落数报告应参照菌落总数的报告方法报告之。
（4）每g（或每mL）化妆品含霉菌和酵母菌数以CFU/g（mL）表示。
第二节公共场所卫生管理及监督监测
（第一部分：
公共场所卫生管理规定及相关标准）
一、公共场所卫生管理条例
公共场所卫生管理条例是为创造良好的公共场所卫生条件，预防疾病，保障人体健康而制定的。
公共场所卫生管理条例适用于下列公共场所：
1、宾馆、饭馆、旅店、招待所、车马店、咖啡馆、酒吧、茶座；
2、公共浴室、理发店、美容店；
3、影剧院、录像厅（室）、游艺厅（室）、舞厅、音乐厅；
4、体育场（馆）、游泳场（馆）、公园；
5、展览馆、博物馆、美术馆、图书馆；
6、商场（店）、书店；
7、候诊室、候车（机、船）室、公共交通工具。
公共场所的下列项目应符合国家卫生标准和要求：
1、空气、微小气候（湿度、温度、风速）；
2、水质；
3、采光、照明；
4、噪声；
5、顾客用具和卫生设施。
公共场所的卫生标准和要求，由卫生部负责制定。
国家对公共场所以及新建、改建、扩建的公共场所的选址和设计实行“卫生许可证”制度。
“卫生许可证”由县以上卫生行政部门签发。
公共场所的主管部门应当建立卫生管理制度，配备专职或者兼职卫生管理人员，对所属经营单位（包括个体经营者，下同）的卫生状况进行经常性检查，并提供必要的条件。
经营单位应负责所经营的公共场所的卫生管理，建立卫生责任制度，对本单位的从业人员进行卫生知识的培训和考核工作。
公共场所直接为顾客服务的人员，持有“健康合格证”方能从事本职工作。
患有痢疾、伤寒、病毒性肝炎、活动期肺结核、化脓性或者渗出性皮肤病以及其他有碍公共卫生的疾病的，治愈前不得从事直接为顾客服务的工作。
经营单位须取得“卫生许可证”后，方可向工商行政管理部门申请登记，办理营业执照。
在本条例实施前已开业的，须经卫生防疫机构验收合格后，补发“卫生许可证”。
“卫生许可证”两年复核一次。
公共场所因不符合卫生标准和要求造成危害健康事故的，经营单位应妥善处理，并及时报告卫生防御机构。
各级卫生防疫机构，负责管辖范围内的公共场所卫生监督工作。
民航、铁路、交通、厂（场）矿卫生防疫机构对管辖范围内公共场所，施行卫生监督，并接受当地卫生防疫机构的业务指导。
卫生防疫机构根据需要设立公共场所卫生监督员，执行卫生防疫机构交给的任务。
公共场所卫生监督员由同级人民政府发给证书。
民航、铁路、交通、工矿企业卫生防疫机构的公共场所卫生监督员，由其上级主管部门发给证书。
卫生防疫机构对公共场所的卫生监督职责：
1、对公共场所进行卫生监测和卫生技术指导。
2、监督从业人员健康检查，指导有关部门对从业人员进行卫生知识的教育和培训。
3、对新建、扩建、改建的公共场所的选址和设计卫生审查，并参加竣工验收。
卫生监督员有权对公共场所进行现场检查，索取有关资料，经营单位不得拒绝或隐瞒。
卫生监督员对所提供的技术资料有保密的责任。
公共场所卫生监督员在执行任务时，应佩戴证章、出示证件。
凡有下列行为之一的单位或者个人，卫生防疫机构可以根据情节轻重，给予警告、罚款、停业整顿、吊销“卫生许可证”的行政处罚：
1、卫生质量不符合国家卫生标准和要求，而继续营业的。
2、未获得“健康合格证”，而从事直接为顾客服务的。
3、拒绝卫生监督的。
4、为取得“卫生许可证”，擅自营业的。
罚款一律上缴国库。
违反公共卫生管理条例的规定造成严重危害公民健康的事故或中毒事故的单位或者个人，应当对受害人赔偿损失。
违反公共卫生管理条例致人残疾或者死亡，构成犯罪的，应由司法机关依法追究直接责任人员的刑事责任。
对罚款、停业整顿及吊销“卫生许可证”的行政处罚不服的，在接到处罚通知之日起15天内，可以向当地人民法院起诉。
但对公共场所卫生质量控制的决定应立即执行。
对处罚的决定不履行又逾期不起诉的，由卫生防疫机构向人民法院申请强制执行。
公共场所卫生监督机构和卫生监督员必须尽职尽责，依法办事。
对玩忽职守，滥用职权，收取贿赂的，由上级主管部门给予直接责任人员行政处分。
构成犯罪的，由司法机关依法追究直接责任人员的刑事责任。
二、公共场所卫生监督工作
各级卫生监督机构以及民航、铁路、交通、厂（场）矿卫生职能部门和卫生防疫站对所辖区域实施公共场所卫生监督。
准备开业的公共场所需要到卫生防疫机构办理“卫生许可证”，“卫生许可证”每两年复核1次。
从业人员需要进行健康检查，持有“健康合格证”才可上岗。
经常性卫生监督检查的内容包括：
1、卫生组织、卫生制度是否建立、健全及执行情况；
2、基本卫生设施是否具备；
3、公共场所内外环境卫生状况；
4、消毒制度、消毒设施是否健全、完好及运行情况；
5、公共场所卫生标准中“有关规定”部分执行情况；
6、抽查部分从业人员“健康合格证”和“考核合格”章；
7、符合从业人员名单是否准确无误，以确定直接为顾客服务人员（含临时工）为体检、培训对象。
卫生监督员在监督检查中，应认真填写“现场卫生监督记录”。
卫生监督员在执行任务时，不得当场作出行政处罚的决定。
在开展公共场所卫生监测时应严格遵守各项操作规程，认真填写“样品采集记录表”，采样记录的编号应于样品编号一致。
采样后应填写“卫生监测样品送检单”，连同样品及时送至检验单位。
检验者应出具“卫生监测结果报告单”退还承办卫生监督员。
卫生防疫机构依据检验结果填写“卫生监督监测评价书”送被监督单位。
凡涉及行政触发者，都必须立案。
现场调查、核实必须有两名以上卫生监督员或助理卫生监督员（其中卫生监督员不少于1名）同行，赴现场时，卫生监督员必须着装整齐，佩戴“中国卫生监督”证章，出世“中国卫生监督”证件。
认证、无证、地点、时间及情节是执行行政处罚的主要依据。
在诉讼过程中不得再向被处罚者或证人收集证据，经人民法院同意的除外。
涉及国家机密或技术专利的证据，监督机构及调查取证人员要予以保密。
由3名以上卫生监督员或助理卫生监督员（其中卫生监督员不少于两名）对经营单位的违法事实进行合议，填写行政控制或行政处罚审批表，并附上述现场调查所得材料，按行政处罚的批注权限逐级上报。
对停业整顿及超过3000元的罚款处罚须经同级卫生行政部门批准。
地、市级以下卫生防疫机构应报省、自治区、直辖市卫生防疫机构备案。
行政处罚实施完毕后，由主办卫生监督员填写结案报告单，予以结案。
结案卷宗应包括与本案有关的各种文书、证据。
三、公共交通工具卫生标准要求
公共交通工具卫生标准规定了旅客列车车厢、轮船客舱、飞机客舱的微小气候、空气质量、噪声、照度得个标准值及其卫生要求。
火车、轮船、飞机上的饮水水质应符合GB5749-2006要求。
贮水水箱及蓄水设施应定期清洗消毒。
旅客使用的卧具、铺位、席位必须整洁卫生。
火车硬卧车厢卧具应单程更换，软席车厢卧餐应一客一换。
轮船供三等舱以上旅客使用的卧具应一客一换，供应四、五等舱的卧具应保持清洁。
飞机旅客座位头片应做到一客一换，公用毯用后应及时消毒、加封。
火车、轮船应有茶餐消毒设备，未经消毒的公用茶具不得供旅客使用。
飞机上供旅客使用的茶具、餐布等消毒后上机，应严格执行储藏规定。
旅客用毕的一次性塑料餐具等容器应及时处理，集中销毁。
旅客列车、轮船、飞机上的卫生间的卫生设施应保持完整。
卫生间内应无积水、无积粪、无明显臭味。
火车和轮船内的厕所不应设坐式便器。
飞机内的厕所应按要求在马桶内投放划粪剂和消毒剂。
车厢和客舱内的蚊、蝇、蟑螂指数及鼠密度影达到全国爱卫会考核规定。
若发现四害，应立即杀灭。
车厢和客舱用于消毒的杀虫和灭鼠的药物，不得有损于人体健康。
旅客的固体废弃物应统一装袋，应停站时集中处理，不得随意向窗外抛弃。
车厢和客舱内禁止吸烟，应有禁烟的明显标志和管理制度。
宜在通风处设置吸烟区。
严谨携带腥、臭物品及其有碍公共卫生的物品进入车厢或客舱。
火车行驶市区、大桥、隧道和停车5分钟以上的车站量，应封闭厕所，不得倾倒污水、污物，保持周围环境清洁。
公共交通工具的设计卫生应执行本标准的要求。
四、公共浴室卫生标准内容
公共浴室卫生标准规定了公共浴室[包括更衣室、浴室（淋、池、盆浴）、桑拿浴室]的室温、空气质量和水温等标准值及其卫生要求。
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