生物工艺学Word下载.docx
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衰亡期
4、分批发酵、补料分批发酵、连续发酵？
a）分批发酵（maytakedaystomonths）是一种准封闭式系统，种子接种到培养基后，除了气体流通外发酵液始终留在生物反应器内。
优缺点：
操作简单、周期短，染菌的机会减少，生产过程、产品质量易掌握，不适用于测定过程动力学，对基质浓度敏感的产物，用分批发酵不合适
b）补料分批发酵（sterileculturemediumisaddedcontinuouslyorperiodicallytofermentationbatch）：
在分批发酵中补入新鲜的料液，以克服由于养分的不足，导致发酵过程过早的结束（由于只有料液的输入，没有输出，因此发酵液的体积在增加）优点：
补料分批发酵与传统分批发酵相比，其优点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度。
低基质浓度的优点：
1）可解除底物抑制，产物的反馈抑制和快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不致于加剧供氧的矛盾；
2）可降低培养基的黏度，并尽可能地延长产物的形成时间；
3）避免培养基积累有毒代谢物。
与连续发酵相比，补料分批发酵不需要严格的无菌条件，也不会产生菌种老化和变异等问题。
c）连续发酵：
（uncommoninfoodfermentations,butusedinsomelargescalebeerbrewingprocesses）发酵过程中一边补入新鲜的料液，一边一相近的流速放料，维持发酵液原来的体积
5、工业发酵的一般流程是什么？
生物发酵工艺多种多样，但基本上包括工业微生物与育种、菌种培养基的配制与优化、扩大培养和接种、发酵过程控制，下游处理即分离提纯等几个过程。
第三讲工业微生物
1、常用的发酵工业微生物有哪些？
原生生物界及非细胞型微生物（病毒、噬菌体），主要是细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、噬菌体、藻类
2、发酵工业对生产菌种的要求？
（10点）
•产率高
•原料要易得、价廉
•发酵条件粗放
•菌种生长和发酵速度较快，发酵周期短：
感染杂菌的机会减少，提高设备的利用率
•尽量诱变次数少，避免选择缺陷型
•菌种纯粹，稳定性好
•菌种退化，生产性能下降是生产中常碰到的问题。
•抗杂菌能力强，如抗噬菌体
•不是病原菌，不产生有害物质和毒素
•使用新菌种时更应注意；
应用食品领域更需经严格鉴定，早期酱油生产采用黄曲霉，现已停止
3、如何筛选出生产目标产品的菌株？
菌株筛选的两个关键问题？
定方案–采样–增殖–分离–发酵性能测定
1、“分离什么和从哪里分离出所需微生物?
”
罗列出所要分离的微生物类群
根据所采集样本的各种生态参数，描述所要分离的微生物之生态系统或栖息地
土壤是理想的分离环境，不同的产物筛选时需要选取特别的环境，如纤维素酶产生菌、厌氧菌等
2、“如何筛选分离出所需微生物?
筛选培养基的设计——“筛子”
有机酸生产菌、纤维素酶生产菌
4、什么是诱变育种？
菌种诱变育种的方法？
（1）诱变育种通过物理或化学等诱变剂的处理，使诱变对象细胞内的遗传物质发生变化,再经过筛选，从而达到菌种诱变选育的目的。
（2）物理诱变（紫外线、快中子、X射线、γ射线）、化学诱变（碱基类似物、与碱基反应的物质eg.NTG、在DNA分子中插入或缺失一个或几个碱基物质）、生物诱变（噬菌体）（重组DNA、原生质体融合）
a、出发菌株选择：
稳定、高产、对诱变剂敏感、生长周期短
b、诱变剂的选择：
考虑试验菌株的遗传背景，各种诱变剂有不同的作用机制，一种诱变剂的作用常主要集中在DNA的某些特异部位上复合诱变不易回复突变
c、预实验确定诱变条件
d、筛选方法：
随机筛选：
诱变后随机挑选单菌落（制备生长限制因素培养基、避免使用易同化的C/N源会代谢物阻遏、缓冲液维持PH、确定生长辅助因子）
理性化筛选：
生长因子产生菌（对应于营养缺陷型）的筛选、抗反馈突变株（抗结构类似物）的筛选
高通量筛选：
自动化
5、什么是菌种保藏？
方法有哪些？
（1）菌种保藏主要是根据菌种的生理、生化特点，人为地创造条件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态。
首先挑选优良纯种，最好是休眠体（孢子、芽孢）；
其次要创造一个最有利于休眠的环境条件，降低其代谢活动，延长保存期的目的
（2）菌种保藏方法：
斜面低温保藏法、液体石蜡保藏法、砂土管保藏法、冷冻干燥保藏法、液氮保藏法
第四讲培养基
1、什么是培养基？
类型和用途？
定义：
是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物的所需要的，按一定比例配制的多种营养物质的混合物，提供微生物所需能量，包括碳源、氮源、无机元素、生长因子及水、氧气等。
A按营养物质来源划分：
天然：
定义是采用化学成分还不清楚或化学成分还不恒定的各种动植物和动物组织或微生物的浸出物、水解液等物质制成的
半合成：
采用一部分天然有机物作碳源、氮源和生长因子的来源，再适当加入一些化学药品以补充无机盐成分，使其更能充分满足微生物对营养的需要
合成定义：
B按物理性状划分：
固体培养基：
适合于菌种和孢子的培养和保存，也用于有子实体的真菌类（香菇、白木耳）的生产
液体培养基：
80－90%是水，配有可溶性的或不溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基
半固体培养基：
在液体培养基中加入0.5－0.8%的琼脂，用于鉴定细菌、观察细菌运动特征及噬菌体的效价滴度
C按用途划分：
孢子培养基：
是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，要求能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，营养不太丰富，常用的有麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米碎屑培养基、琼脂斜面培养基
种子培养基：
是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长得粗壮，成为活力强壮的“种子”，一般采用营养丰富且完全的培养基
发酵培养基：
供菌体生长、繁殖和合成产物之用，组成除有菌体生长所必需的元素和化合物之外，还要有合成产物所需的特定元素、前体和促进剂等
2、工业微生物常用培养基？
培养基菌株最适pH耐受pH
牛肉膏蛋白胨培养基细菌6.5-7.55-8.5
高氏1号培养基放线菌6.5-7.55-8.5
查氏合成培养基霉菌5-73-8.5
麦芽汁培养基酵母4-53.5-7.5
LB培养基
3、营养源的成份及作用，举例？
碳源:
为微生物菌种的生长繁殖提供能源和合成菌体所必需的碳成分,为合成目的产物提供所需的碳成分。
来源：
糖类、油和脂肪、有机酸、烃和醇类
氮源：
用于构成菌体细胞物质和含氮代谢，包括有机氮源、无机氮源（快速氮源）。
有机氮源：
在微生物分泌的蛋白酶作用下，消解成氨基酸，被菌体吸收后再进一步分解代谢。
有机氮源营养丰富，还含有少量的维生素和生长因子。
如花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟
无机氮源：
铵盐、硝酸盐和氨水等、生理酸性物质与生物碱性物质
例如：
（NH4）2SO4、NaNO3
无机盐、：
镁、磷、钠、钾、硫、钙和氯
Eg.MgSO4、NaCl、NaH2PO4、K2HPO4
P
ATP，磷酸化酶，能促进糖代谢。
许多次级代谢过程对磷酸盐浓度的承受限度比生长繁殖过程低，故必须严格控制。
S
硫存在于细胞的蛋白质中，是含硫氨基酸的组分和某些辅酶的活性基，如辅酶A（coenzymeA）,谷胱甘肽等。
硫是某些产物如青霉素、头孢菌素等分子的组成部分，在培养基中加入Na2SO4等含硫化合物作硫源。
Fe
铁（iron）是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的成分，因此铁是菌体有氧氧化必不可少的元素。
Cl
一些产含氯代谢物如金霉素和灰黄霉素等的发酵中，除天然含有外，通常还需加入0.1%氯化钾。
在啤酒生产中，20－60mg/ml的氯对酶和酵母有一定的促进作用
K，Na，Ca
钠、钾离子与维持细胞的渗透压有关。
钾离子是许多酶的激活剂，能促进糖代谢。
钙是某些酶（如蛋白酶）的激活剂，还参与细胞膜通透性的调节。
培养基中钙盐过多时，容易形成磷酸钙沉淀。
微量元素:
钴、铜、铁、锰、锌、钼
Eg.TMS：
tracemetalsolution
锌、镁、钴、锰等是某些酶的辅基或激活剂。
镁离子还可提高抗生素生产菌对自己所产生抗生素的耐性；
钴既是一些酶的激活剂，又是VB12的组成元素，发酵中加入一定量的钴盐，能使VB12的产量提高数倍。
锰对于羧化作用是必需的，糖代谢中许多酶的活性都与锰有关。
生长因子:
氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等;
有机氮源是生长因子的重要来源;
玉米浆中生长因子含量丰富
水:
良好的溶剂，溶解营养物质，细胞的渗透、分泌、排泄等作用都是以水为媒介，并且水直接参与代谢作用中的许多反应;
水的比热高，是热的良导体，调节细胞的温度;
恒定的水源是发酵工厂的关键，水源质量很重要.
前体:
指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高
产物促进剂、抑制剂
4、发酵培养基选择的基本原则？
–必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分
–有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率
–有利于提高培养基和产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力
–有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期
–尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化
–原料价格低廉，质量稳定，取材容易
–所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗
–有利于产品的分离纯化，尽可能减少产生“三废”的物质
第五讲灭菌
1、什么是灭菌？
培养过程中那些需要灭菌？
灭菌的方法以及使用的范围？
（1）所谓灭菌，是指用物理或化学方法杀灭或物料或设备中一切有生命物质的过程。
（2）培养基灭菌、气体除菌、设备及管道灭菌。
化学灭菌：
常用的化学药剂有甲醛、氯（次氯酸钠）、高锰酸钾、环氧乙烷、季铵盐、臭氧
射线灭菌：
利用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的射线进行灭菌。
紫外线：
穿透力低，仅用于表面消毒和空气消毒。
干热灭菌：
常用的干热条件为在160℃下保温1小时，不如湿热灭菌有
效，一些要求保持干燥的实验器具和材料等可以用干热灭菌。
湿热灭菌：
利用饱和水蒸汽进行灭菌。
蒸汽有很强的穿透力，且在冷凝时放出大量冷凝热，易使蛋白质凝固而杀灭各种微生物。
培养基、发酵设备与管理的灭菌以及实验器材的灭菌，普遍采用湿热灭菌。
121℃,20-30min
湿热灭菌比干热灭菌更有效，细菌蛋白质在有水的情况下易于凝固变性;
湿热穿透力强;
湿热蒸气有潜热存在，水蒸气凝固成水释放潜热，迅速提高被灭菌物体的温度
过滤除菌：
利用过滤方法截留微生物，达到除菌的目的。
适用于澄清流体的除菌：
空气、热敏性培养基组分；
产品提取也可利用无菌过滤处理料液，获得无菌产品。
火焰灭菌法：
接种环、接种针
物理方法：
超高静压等
分批灭菌：
将配制好的培养基放在发酵罐或其它窗口中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起灭菌的操作过程，也称实罐灭菌。
（优点：
无需专门的灭菌设备，设备投资少，灭菌效果可靠，对蒸汽要求低（0.2－0.3MPa），缺点：
灭菌温度低、时间长而对培养基成分破坏大，操作难于实现自动控制。
）
连续灭菌：
以“高温、快速”为特征的连续灭菌，是将配制好的培养基在通入发酵罐时进行加热、保温、降温的灭菌过程，也称之为连消。
对培养基破坏小，可以实现自动控制、提高发酵罐的设备利用率、蒸汽用量，缺点：
蒸汽的要求较高，一般不小于0.45MPa，同时需要一组附加调和，设备投资大）
空气的过滤除菌：
绝对过滤、深沉过滤
排气经碱液处理后排向大气
第六讲种子培养
1、种子？
指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。
这些纯种培养物称为种子。
2、种子质量要求。
种子培养与发酵培养的目的与培养基的差异？
（1）纯；
活力旺盛；
有足够的菌体浓度；
要求种子培养至对数生长期中后期
（2）种子培养基：
3、接种龄？
过于年轻或过老的种子对于发酵的影响？
（1）接种龄是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。
种龄以菌丝体处于生命力极为旺盛的对数生长期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时，较为合适
（2）Ⅰ过于年轻的种子接入发酵罐后，往往会出现前期生长缓慢、整个发酵周期延长、产物开始形成的时间推迟，甚至会因菌丝量过少而在发酵罐内结球，造成异常发酵的情况；
Ⅱ接入种子罐中的种子，随着培养时间的延长，菌丝增加，但由于基质的消耗、代谢产物的积累及菌丝体的死亡，菌丝量不再增加，而逐渐趋于老化。
过老的种子会引起生产能力下降而菌丝过早自溶
4、接种量？
对发酵的影响？
（1）接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。
（2）接种量的大小取决于菌种在发酵罐中生长繁殖的速度。
①采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖到达高峰的时间，使产物的形成提前到来；
接种量大，有利于对基质的利用和产物的合成，生产菌迅速占据培养环境，减少了杂菌生长的机会
但接种量过多，菌丝生长过快，培养液黏度增加，造成溶解氧不足，而影响产物的合成
e.g.嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶
接种1%，酶活最高；
1.5%~4%影响不大；
大于4%，酶产量明显下降。
②接种量过小，除了延长发酵周期外，往往还会引起其它不正常情况
第七讲发酵过程控制
1、发酵热的来源？
发酵热:
发酵过程中释放出来的净热量。
Q发酵=Q生+Q搅拌-Q蒸发-Q显-Q辐射
2、温度对发酵过程的影响
1）从动力学角度来看，T升高，反应速度加快，生长繁殖快，产物提前合成；
另一方面，T升高，酶失活愈快，菌体易于衰老，影响产物合成，失活愈快，周期缩短，产物最终产量少。
2）温度通过影响发酵液的物理性质间接影响发酵，影响氧的溶解和传递，影响对基质的分解和吸收速度。
3）影响生物合成方向
如:
金色链霉菌>
35℃时，合成四环素；
<
30℃时，合成金霉素。
3、菌株的最适温度？
最适温度是指在该温度下最适于菌的生长或产物的合成。
不同菌种，不同的培养条件，不同的发酵时期，最适温度是不同的。
菌体生长与产物合成的最适温度不一定相同各种微生物在一定条件下，都有一个最适的生长温度范围；
产物合成的最适温度与生长温度往往不同。
谷氨酸产生菌最适生长30-32℃，产物34-37℃；
黑曲霉最适生长37℃，柠檬酸、糖化酶32-34℃；
青霉素最适生长30℃，分泌青霉素20℃；
e.g青霉素变温发酵
起初5小时，维持在30C，以后降到25C培养5小时，再降到到20C培养28小时，最后又提高到25C，培养40小时，放罐。
青霉素的产量比在25C恒温发酵条件下提高14.7%。
4、pH对发酵过程的影响？
1）pH变化会引起各种酶活力的改变:
影响酶活性中心上有关基团的解离；
影响底物（培养基成分）的解离，从而影响酶——底物的结合
2）影响细胞膜电荷，膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及低谢产物的排泄
3）引起菌体的代谢过程的不同,影响菌体的生长和产物的合成
•黑曲霉:
酸性pH2-3产生柠檬酸,中性产生草酸
•酵母:
pH5.0产生乙醇,碱性产生甘油
•棒杆菌:
pH5.0-5.8产生谷氨酰胺,中性产生谷氨酸
5、发酵过程中pH变化规律？
第一，糖类和脂肪代谢产酸，蛋白质代谢产碱。
当碳氮比例高的培养基，如培养真菌的培养基，经培养后其pH值常会明显下降，而碳氮比例低的培养基，如培养一般细菌的培养基，经培养后，其pH值常会明显上升。
产抗生素的一般是放线菌，霉菌，以青霉素为例，用的是青霉，属于真菌，培养后其pH值下降。
第二，发酵后期,菌体自溶造成pH的上升
引起pH下降的因素
1）培养基中碳、氮比例不当，碳源过多，特别是葡萄糖过量，或者中间补糖过
多加之溶解氧不足，致使有机酸大量积累
2）消沫油加得过多
3）生理酸性物质的存在
引起pH上升的因素：
1）氮源过多
2）生理碱性物质存在
3）中间补料中氨水或尿素等的碱性物质加入过多
6、如何控制发酵液的pH?
Buffer、Ammoniawater,urea,NaOH,HCl
其他方法酶制剂、抗生素发酵通过加糖、淀粉来控制pH。
青霉素根据代谢需要，改变加糖率，比固定加糖而用酸碱调节pH增产25%
7、溶氧的表示方法？
百分饱和度？
比耗氧速度或呼吸强度（QO2）：
单位时间内单位重量的细胞所消耗的氧气，mmolO2·
g菌-1·
h-1
摄氧率（r）：
单位时间内单位体积的发酵液所需要的氧量。
mmolO2·
L-1·
h-1。
百分饱和度是氧浓度表示方法之一,是最常用的方法,培养液被空气完全饱和时,即为溶氧100%饱和度,室温下为7mg/L左右
8、临界氧溶度与最适氧溶度？
1）指不影响菌的呼吸所允许的最低氧浓度
氧饱和度＝发酵液中氧的浓度/临界溶氧溶度
所以对于微生物生长，只要控制发酵过程中氧饱和度>
1
2）指溶氧浓度对生物合成有一最适范围,有下限,也有上限,与临界氧
浓度是不同的概念
产物的形成和菌体生长的最适溶解氧，常常不一样
9、影响溶氧的因素有哪些？
如何调节发酵液中溶氧水平？
•dc/dt=KLa（C*-CL）
dc/dt为单位时间内发酵液溶氧浓度的变化,mmolO2/（L·
h）
KL为氧传质系数,m/h
a为比界面面积,m2/m3
C*为氧在水中的饱和浓度,mmol/L
CL为发酵液中的溶氧浓度，mmol/L
影响溶氧的因素
Ⅰ影响C*
通气量Aeration
•罐内压力Pressure
•通气气体成分Componentsofair
•温度Temperature
Ⅱ影响KLa
养料的丰富程度Nutrientconc.
•发酵液的性质:
粘度Fermentationbrothproperty
•搅拌Agitation
•挡板Baffle
•表面活性剂Detergent
1）养料的丰富程度
通过减少菌的生长速率达到限制菌对氧的大量消耗从而提高溶氧水平
如控制加糖或者补料速率、液化培养基等
2）温度
降低培养温度,C*提高,可得到较高的溶氧值
3）通气量通气的气速与发酵液体积之比vvm
提高通气量,增加液体中夹持气体体积的平均成分
4）搅拌
增加搅拌可以改善罐内液体的混合和循环,从而具有抑制气泡聚合的效果,而且可以避免低于平均氧浓度的死角存在
但过高的搅拌增加了动力消耗,另一方面也提高了体系的剪切应力,对细胞生长不利
5）挡板
通过挡板的剪切作用,避免低于平均氧浓度的死角存在
6）通气气体成分
AirPureoxygen许多高密度培养过程中需要富氧气体
7）罐内压力提高罐压,增加C*
缺点:
同时增加二氧化碳的溶解度,影响pH及可能会影响菌的代谢,而且对设备要求高
10、基质浓度对发酵过程的影响？
•过低,菌体生长缓慢,生物合成慢
•适中,菌体生长迅速,生物合成快
•过高,会抑制菌体生长,引起碳分解代谢物阻遏现象,阻碍产物形成
11、发酵过程中泡沫的变化规律？
如何控制泡沫？
•
（1）与培养基成分有关:
玉米浆,蛋白胨,花生饼粉,黄豆饼粉,酵母粉,糖蜜等是主要的发泡因素；
发酵过程中,造成泡沫稳定的蛋白质分解,泡沫减少；
发酵后期菌体自溶,可溶性蛋白质浓度增加促使泡沫上升
•
（2）机械法：
消沫桨、罐外消泡、罐压加压（节省原材料,减少污染机会,但不能从根本上消除引起稳定泡沫的因素）
•消泡剂：
消泡剂有选择性。
消泡剂用多了有毒性，而且还影响通气和气体分散，因此要少量地加
12、CO2对有氧发酵的影响
第八讲反应器的设计
1、好氧反应器根据反应器通风和搅拌的方式不同可分为？
机械搅拌通风式、自吸式和气升式。
2、通用搅拌式发酵罐的基本要求？
①发酵罐应具有适宜的高径比。
一般高径比为2.5~4。
②发酵罐能承受一定的压力。
由于发酵罐在消毒和正常工作时，罐内有一定的压力和温度，因此罐体各部件要有一定的强度，能承受一定的压力。
③发酵罐的通风搅拌装置要能使气泡分散细碎，
气液充分混合，保证发酵液必须的溶解氧，提高氧的利用率。
④发酵罐应具有足够的冷却面积。
⑤发酵灌内应抛光，尽量减少死角，避免藏垢积污，使灭菌彻底，避免染菌。
⑥搅拌器的轴封严密，尽量减少泄漏。
3、搅拌式发酵罐搅拌器的形式？
性能上的比较？
粉碎气泡的能力：
平叶>
弯叶>
箭叶式
翻动流体的能力：
箭叶式>
平叶
4、夹套与蛇管在传热能力上的差异？
1）夹套,传热系数为400-630kJ/（m2·
h·
°
C
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