基因工程重点共13页word资料Word文件下载.docx
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常用于克隆和扩增外源基因。
它们或者含有氯霉素可扩增的松弛型复制子的结构，或者复制子经过人工诱变，解除对质粒拷贝数的负控制作用，使得质粒在每个细胞中可达数千个复制拷贝。
7、穿梭质粒：
这类质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构以及相应的选择性标记基因，可以在两种不同种属的受体细胞中复制并检测。
8、表达质粒：
这类质粒在多克隆位点的上游和下游分别装有两套转录效率较高的启动子，合适的核糖体结合位点（SD序列）以及强有力的终止子结构，使得克隆在合适位点上的任何外源基因均能在受体细胞中高效的表达。
9、限制性核酸内切酶：
生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。
它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。
10、Klenow酶：
用枯草芽孢杆菌蛋白酶处理切掉大肠杆菌DNA聚合酶ⅠN端的5'
→3'
外切酶活性部分。
11、T4DNA连接酶：
由T4噬菌体基因编码，相对分子质量为60KD。
可以用来修复DNA双链上的单链缺口，连接RNA-DNA杂交双链上的DNA链缺口或RNA链缺口，也可以用来连接完全断开的两个平头双链DNA分子。
12、动物的转基因技术：
利用转基因的重组子构建技术，重组分子导入动物体内的转化技术，转基因在受体细胞染色体上的稳定整合及可控制性表达技术统称为转基因技术。
13、转基因动物：
指以实验方法导入外源基因，在染色体组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。
11、共抑制效应：
当受体细胞染色体上含有转基因的同源伙伴时，转基因与内源性同源基因的表达将同时受到抑制。
12、基因治疗：
是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。
也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。
13、Ti的共整合转化：
T-DNA在大肠杆菌质粒上，含有E.coli的选择标记和植物选择标记Kmr。
首先在E.coli中筛选重组分子，然后将重组质粒转化到农杆菌中，质粒与Ti质粒上的同源序列发生同源重组，将外源基因整合到Ti质粒上，用于侵染植物细胞。
T-DNA重组分子整合到植物细胞染色体DNA上，Kmr筛选转化细胞。
14、Ti质粒的二元整合转化系统:
即穿梭质粒。
插入外源基因的重组穿梭质粒直接转化含有Ti质粒的根瘤农杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。
农杆菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号启动Ti质粒上的Vir基因，随后将穿梭质粒的T-DNA切割下来，转移到植物细胞中。
（与共整合系统所不同的是，含外源基因的质粒可在农杆菌内自主复制并保留下来。
）
问答、填空、选择：
1、基因工程绪论（过程、原理、三大要素有一个大题）
1、基因工程的三大要素：
供体、受体、载体。
2、基因工程的基本过程：
切，接，转，增，检。
（1）基因的剪刀（切）——限制性内切酶：
一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA分子切断。
目前已发现的限制酶有200多种。
DNA被限制酶切断后有两个反向互补的“黏性末端”。
被同一种限制酶切断的几个DNA具有相同的黏性末端，能够通过互补进行配对。
（2）连——DNA连接酶：
连接酶的作用是：
将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。
（3）转——运载体：
运载体必须同时满足三个要求：
①能与目的基因结合；
②能进入受体生物细胞并在受体生物细胞内复制并表达；
③比较容易得到。
（4）增——转化细胞：
扩增重组分子或整合重组分子到受体细胞的基因组：
细菌培养、昆虫细胞培养、植物组织培养、高等动物细胞培养。
（5）检——筛选鉴定转化细胞：
PCR鉴定目的基因、抗生素筛选标记、报告基因显色筛选等。
3、基因工程的基本原理：
2、基因的表达调控（熟悉了解，也许会来选择题）
1、基因表达（geneexpression）是指基因经过转录、翻译，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子的过程。
基因表达可分为组成性表达和受调控表达两种形式。
组成性表达：
对细胞生命活动必不可少的基因处于持续表达状态，称管家基因。
2、基因的表达方式——诱导和阻遏：
诱导：
特定条件下基因表达增强的过程。
如DNA损伤诱导损伤修复相关基因表达。
阻遏：
基因表达受到抑制的过程。
如色氨酸阻遏其合成代谢相关基因表达。
3、基因表达调控及其方式：
在基因表达的各个水平均可进行调控，但转录调控是主要的调控方式。
（1）转录调控的基本要素：
顺式作用元件：
具有调控基因表达作用的特殊DNA序列。
如
启动子序列：
基本序列。
特殊调控序列：
如操纵序列。
反式作用因子：
具有调节基因表达作用的蛋白因子。
RNA聚合酶。
特异性转录调节因子：
激活蛋白或阻遏蛋白等。
（2）影响转录的因素：
启动子——起始部位：
+1、结合部位：
-10、识别部位：
-35；
启动子决定转录方向及模板链；
启动子序列决定启动效率，不同的启动子序列对RNA聚合酶亲和力不同，因此具有不同的起始频率；
σ因子与启动子序列特异性识别：
原核生物只有一种RNA聚合酶，但具有多种σ因子，不同的起始因子选择性识别不同的启动子。
阻遏蛋白——在转录水平对基因表达产生抑制作用的蛋白质：
负调控。
由调控基因（i基因）编码，阻遏蛋白是DNA结合蛋白，特异性识别并结合操纵子，阻止转录。
信号分子＋阻遏蛋白——变构——结合DNA（或去结合），从而诱导阻遏和诱导去阻遏。
正调控蛋白——结合于特异DNA序列后能促进基因转录：
正调控。
CAP蛋白：
分解代谢物基因活化蛋白又称cAMP受体蛋白CRP。
ntrC蛋白的调控。
倒位蛋白——位点特异性重组酶。
RNA聚合酶抑制物——细菌处于氨基酸饥饿状态时RNA聚合酶活性下降，rRNA和tRNA合成减少或停止的现象称为严谨反应。
衰减子——位于操纵子第一个结构基因之前，能够减弱转录作用的序列。
（3）基因表达调控的特点：
基因表达调控具有时空两重性：
按功能需要，某一特定基因表达的先后次序及相对强弱严格受时间的控制，称为基因表达的时间特异性；
某种基因产物在个体生长过程中按不同组织、细胞乃至细胞器的空间顺序出现，称为基因表达的空间特异性。
基因表达调控的模式复杂性：
基因表达调控环节众多，其中转录调控是关键.真核生物与原核生物相比的基因表达调控范围要大。
基因表达调控元件可分为核酸和蛋白质两大类。
基因表达调控实质是两者之间的相互作用，包括核酸分子内或分子间的相互作用、核酸和蛋白质之间的相互作用、蛋白分子内或分子间的相互作用。
基因表达调控的生物学意义：
适应环境，维持生长和增殖、维持个体发育与分化、调控程序上的缺陷或紊乱将导致严重后果；
（4）启动子的调控模型：
启动子的一般特性：
RNA聚合酶结合并启动转录的特异DNA序列。
有序列特异性、方向特异性、位置特异性、种属特异性。
真核生物的启动子：
根据所对应的基因编码产物分为：
Ⅰ型启动子（rRNA基因）：
核心启动子：
紧邻转录起始位点，足以使转录起始。
上游控制元件（UCE）：
-180至-107处能大幅增强转录效率
Ⅱ型启动子（mRNA基因）、Ⅲ型启动子（tRAN基因）；
3、DNA重组克隆的单元操作（重点章节）
1、DNA重组克隆所需的基本条件：
（1）用于基因克隆的载体（这个载体真的很重要的，打十颗星，最后一道综述性问答题就是有关载体的）
1）载体的功能：
运送外源基因高效转入受体细胞；
为外源基因提供复制能力或者整合能力；
为外源基因的扩增或表达提供必要的条件；
2）载体应具备的条件：
①具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性。
②具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。
③具有较高的外源DNA的载装能力。
④具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。
⑤具有合适的筛选标记。
质粒：
1）基本特性：
质粒常见于原核细菌和真菌中；
绝大多数的质粒是DNA型的；
绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构；
质粒DNA的分子量范围：
1-300kb；
质粒具自主复制性：
根据在每个细胞中分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为严谨型复制控制的质粒（1-5个拷贝）和松弛型复制控制的质粒（30-60个拷贝）。
质粒的不相容性：
任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中。
质粒的可转移性：
革兰氏阴性细菌根据能否在天然条件下自发的从一个细胞转移到另一个细胞而分为接合型质粒和非接合型质粒。
携带特殊的遗传标记：
2）质粒的构建：
野生型质粒分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想。
目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多由pSC101、ColE1和pSF2124构建。
①删除非必需区域DNA。
②灭活某些质粒的编码基因。
③加入标记基因。
④添加MCS，删除重复酶切位点。
⑤加上一些调控序列。
3）基因表达载体的组成：
目的基因、启动子、终止子、标记基因等。
4）质粒的分离纯化：
噬菌体：
噬菌体是一类特异性的病毒，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。
1）大肠杆菌的λ噬菌体
λ噬菌体是温和型的噬菌体，有外壳包装蛋白和λ-DNA（全长48.5kb，至少含有61个基因）组成。
其包装范围为原DNA的75%-105%即36-51kb。
溶原状态：
λ噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。
DNA重组技术一般需要λ噬菌体进入溶菌状态。
λ-DNA载体的构建：
①缩短长度：
野生型λ-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。
根据切除的多少，可将λ-DNA分成两大类载体：
插入型载体和取代型载体。
②删除重复的酶切位点：
野生型的λ-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1-2个。
同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点。
③加装选择标记
野生型λ-DNA上缺少合适的选择标记。
λ-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：
免疫功能类标记和颜色反应类标记。
imm434基因：
编码一种阻止λ-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。
含有完整标记基因的λ-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；
当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活，λ-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑。
lacZ基因：
编码β-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。
当外源基因插入到lacZ'
基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；
而空载体λ-DNA则产生蓝色透明斑。
④构建琥珀密码子的突变体
琥珀型突变（sup）是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。
大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。
基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。
λ-DNA重组分子的体外包装：
在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。
λ-DNA作为载体的优点：
①λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒。
②λ-DNA载体的装载能力为25kb，远远大于质粒的装载量。
③重组λ-DNA分子的筛选较为方便。
④重组λ-DNA分子的提取较为简便。
2）大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA
M13单链噬菌体外型呈丝状、由外壳包装蛋白和正链DNA组成。
不能裂解宿主细胞，但抑制其生长。
M13DNA全长6407个核苷酸，其上有10个基因。
M13DNA载体的特点：
①M13-DNA操作简便且具有选择性。
似类于质粒操作或l-DNA操作。
②M13重组分子筛选简便。
感染的细胞生长缓慢，形成混浊斑。
③可直接产生单链DNA。
④但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5kb。
考斯质粒与噬菌粒（两者之间的比较）：
考斯质粒和噬菌粒载体的构建是为了提高噬菌体DNA的装载量。
将噬菌体DNA与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。
1）考斯质粒：
1.8kbλ-DNA片段+pBR322片段，装载范围为31-45kb。
考斯质粒载体的特点：
①能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞。
②能像质粒那样在受体细胞中自主复制。
③重组操作简便，筛选容易。
④装载量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范围。
⑤不能体内包装，不裂解受体细胞。
2）噬菌粒：
是一类人工构建的含有丝状噬菌体间隔区（IG）以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。
pUC118：
pUC18+M13间隔区IG；
pUC119：
pUC19+M13间隔区IG。
噬菌粒载体的特点：
①能像M13-DNA那样转染受体细胞。
③装载量比常规的M13mp系列要大很多。
④通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA。
⑤重组操作简便，筛选容易。
人造染色体载体：
将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。
当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。
目前常用的人造染色体包括：
细菌人造染色体（BAC）和酵母人造染色体（YAC）.
1）BAC：
细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，其装载量范围在50-300kb之间。
（2）用于核酸操作的工具酶
限制性内切核酸酶（填空题、选择题）
II型限制性核酸内切酶的基本特征：
识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列
大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧
识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构
II型限制性核酸内切酶的切割方式：
绝大多数的II类酶均在其识别位点内切割DNA，切割位点可发生在识别序列的任何两个碱基之间。
同位酶：
识别相同的序列的II型酶；
同裂酶：
识别位点与切割位点均相同的不同来源的II型酶；
同尾酶：
识别位点不同，但能切出相同粘性末端的II型酶；
根据被切开的DNA末端性质的不同，所有的II型酶又可以分为5'
突出末端酶、3'
突出末端酶以及平末端酶。
除平末端，其余两种末端均可以在足够低的温度下退火互补，称为粘性末端。
（3）用于基因转移的受体菌或细胞
1）受体细胞的选择及改造：
①限制缺陷型：
打破细菌转化的种属特异性，即对外源DNA的限制修饰系统，在大肠杆菌中可以采用hsdR-缺陷的遗传表型。
提高外源DNA的可转化性。
②重组整合缺陷型：
野生型的细菌在转化过程中接纳的外源DNA分子能与染色体DNA发生体内同源重组反应，在大肠杆菌中可以选用相应基因型recA-、recB-或recC-同时灭火。
③具有较高的转化效率：
用于基因工程的受体细胞必须对DNA重组分子具有较高的可转化性，这种特性主要表现在细胞壁和细胞膜的结构上。
④具有与载体选择标记互补的表型：
受体细胞必须具有与载体所携带的选择标记互补的遗传特性，方能使转化筛选成为可能。
⑤感染寄生缺陷型：
从安全角度上考虑，受体细胞不能具有感染寄生性。
2）转化的步骤，方法以及原理：
（选择题）
细菌转化的本质是受体菌直接吸收来自供体菌游离的DNA片段，并在细胞中通过遗传交换将之组合到自身的基因组中，从而获得相应的遗传性状，其中来自供体菌的游离DNA片段称为转化子。
细菌转化的五个步骤：
①感受态的形成；
②转化因子的结合：
只有双链的DNA分子才可以。
③转化因子的吸收：
一条链被降解，而另一条链则被吸收进受体菌中。
④整合复合物前体的形成：
进入受体菌的单链DNA与另一种游离的蛋白因子结合，将其引导至受体菌染色体处。
⑤转化因子单链DNA的整合：
通过同源重组，置换受体染色体DNA的同源区域，形成异源杂合双链DNA结构。
方法和原理：
①Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化：
Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。
②细菌原生质体的转化：
革兰氏阳性细菌接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体转化的方法转移质粒或重组DNA分子。
酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化。
细菌原生质体的制备：
不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：
细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性）。
在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。
与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂。
细菌原生质体的转化：
取0.2-1ml的原生质体悬浮液（108-109个原生质体），加入10-20mlDNA重组连接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液，混匀。
转化后的悬液涂在再生平板上让原生质体再生。
③噬菌体DNA的转染：
感受态细胞的培养：
将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基
中培养至OD600=0.5
吸附：
加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30℃保温10分钟。
转染裂解：
加入20倍体积的新鲜培养基，30℃培养2小时，直至培养液
中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选。
④电穿孔转化：
将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场，在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。
同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验。
⑤接合转化：
指通过细菌细胞之间直接接触导致DNA从一个细胞转移至另一个细胞的过程。
这个过程是由接合型质粒完成的。
整个过程涉及到受体菌、含有接合质粒的辅助菌以及有待转化重组质粒的供体菌。
3）转化率及其影响因素：
转化率：
每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。
或每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数。
影响因素：
①载体及DNA重组分子方面：
载体本身的性质、载体分子的空间构象（超螺旋结构转化率高，体外酶切后的载体低）、插入片段的大小（大于30Kb的重组质粒很难进行转化）。
②受体细胞方面：
受体细胞除了具备限制重组缺陷性状外，还应与所转化的载体DNA性质相匹配。
③转化的方法：
受体细胞的预处理或感受态细胞的制备对转化率影响最大。
2、DNA重组克隆的操作过程
（1）重组率的概念以及影响因素：
概念：
重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数
在常规实验条件下，重组率一般为25-75%
重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。
影响因素（提高重组率的方法）：
①提高外源DNA片段与载体的分子比：
5:
1-10:
1；
②载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团；
③加装同聚尾末端；
3、转化子的筛选和鉴定（检）
载体遗传标记检测：
（选择题，原理的对比）
载体遗传标记的原理是利用载体DNA分子上锁携带的选择性遗传标记基因筛选转化子或重组子的。
①抗药性筛选法：
前提条件是载体DNA上携带有受体细胞敏感的抗生素的抗性基因。
抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。
②营养缺陷型筛选法：
营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。
其原理是：
载体分子上携带某种营养组分的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组分，将转化细胞涂布在不含此营养组分的培养基上，长出的便是转化子。
用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+。
③显色筛选法：
显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。
其原理是：
载体分子上
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