紫外可见分光光度法Word格式.docx
《紫外可见分光光度法Word格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《紫外可见分光光度法Word格式.docx（36页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
光速、波长和频率的关系为
为频率，C为光在真空中的传播速度，写C=2.997×
108m/s，λ为波长。
知识链接赫兹
频率的单位是赫兹，简称赫，以符号Hz表示。
赫兹是德国著名的物理学家，1887年，是他通过实验证实了电磁波的存在。
赫兹关于电磁波的实验，为无线电技术的发展开拓了新的道路，奠定了现代文明的基础，后人为了纪念他，把“赫兹”定为频率的单位。
常用的频率单位还有千赫（KHz）、兆赫（MHz）、吉赫（GHz）等。
在载带信息的电信号中，有时会包含多种频率成分；
将所有这些成分在频率轴上的位置标示出来，并表示出每种成分在功率或电压上的大小，这就是信号的“频谱”。
它所占据的频率范围就叫做信号的频带范围。
例如，在电话通信中，话音信号的频率范围是300～3400赫；
在调频（FM）广播中，声音的频率范围是40赫～15千赫，电视广播信号的频率范围是0～4.2兆赫等。
光的粒子性是把光作为具有一定能量的光子（或光量子）加以描述，光的粒子性体现在热辐射、光的吸收和发射，光电效应以及光的化学作用等方面。
光子的能量与波长成反比，与频率成正比，它们的关系为
式中h为谱朗克常数，h=6.6262×
10-34J·
s，E为光子的能量，单位为焦尔（J）或电子伏特（ev）（1ev=1.6022×
10-19J）。
说明，在计算式中波长λ的单位要转换成米（m），1nm=10-9m。
所有电磁波在本质上是完全相同的，不同电磁波之间的区别仅在于波长或频率不同，其能量也不同。
2．电磁波谱把电磁波按照波长或频率的大小顺序排列起来，就称为电磁波谱，电磁波谱的排布情况、频率、波长及实际用途如表8-1所示。
表8-1电磁波谱的排布情况、频率、波长及实际用途
电磁波种类
频率（Hz）
真空中波长（m）
用途
无线电波
104~3×
1012
3×
10-4
通讯，广播，导航等
红外线
1012~3.9×
1014
104~7.7×
10-7
加热烘干，遥测遥感，医疗等
可见光
3.9×
1014~7.5×
7.7×
10-7~4×
照明，照相，加热等
紫外线
7.5×
1014~5×
1016
4×
10-7~6×
10-9
消毒杀菌，治疗皮肤病等
伦琴射线
1016~3×
1020
10-8~10-12
检测探测，透视，治疗等
γ射线
1019以上
10-11以下
探测，治疗等
知识链接核磁共振成像
核磁共振是基于原子尺度的量子磁物理性质。
人们在发现核磁共振现象之后很快就产生了实际用途，化学家利用分子结构对氢原子周围磁场产生的影响，发展出了核磁共振谱，用于解析分子结构，随着时间的推移，核磁共振技术解析分子结构的能力也越来越强，进入1990年代以后，发展出了依靠核磁共振信息确定蛋白质分子三级结构的技术，使得溶液相蛋白质分子结构的精确测定成为可能。
随着电脑技术、电子电路技术、超导体技术的发展而迅速发展起来的一种核磁共振成像也称磁共振成像，是利用核磁共振原理，通过外加梯度磁场检测所发射出的电磁波，据此可以绘制成物体内部的结构图像，经常为人们所利用的原子核有1H、11B、13C、17O、19F、31P，在物理、化学、医疗、石油化工、考古等方面获得了广泛的应用。
将这种技术用于人体内部结构的成像，就产生出一种革命性的医学诊断工具。
医生考虑到患者对"
核"
的恐惧心理，故常将这门技术称为磁共振成像，磁共振成像所获得的图像非常清晰精细，大大提高了医生的诊断效率，避免了剖胸或剖腹探查诊断的手术。
由于磁共振成像不使用对人体有害的X射线和易引起过敏反应的造影剂，因此对人体没有损害。
磁共振成像可对人体各部位多角度、多平面成像，其分辨力高，能更客观更具体地显示人体内的解剖组织及相邻关系，对病灶能更好地进行定位定性。
对全身各系统疾病的诊断，尤其是早期肿瘤的诊断有很大的价值。
3．可见光在电磁波谱中，人眼能感觉到的光称为可见光，其波长在400~760nm之间，它们只是电磁波谱中一个很小的波段。
如日光、白炽灯光及各种颜色的光等。
具有单一波长的光称为单色光。
由不同波长的光混合而成的光称为复合光。
如日光、白炽灯光等，都是复合光，白光（日光、白炽灯光、日光灯的光等）是各种色光按一定的强度比例混合而成的复合光。
如果让一束复合光通过棱镜或光栅，就能散射出红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种颜色的光，这种从复合光分离出单色光的现象称为光的色散。
在可见光区内，不同颜色的光具有不同的波长，但不同色光之间并没有严格的界限，而是由一种颜色逐渐过渡到另一种颜色，各种颜色光的近似波长范围，如表8-2所示。
表8-2各种色光的近似波长范围
光的颜色
波长范围（nm）
红色
760~650
青色
500~480
橙色
650~610
蓝色
480~450
黄色
610~560
紫色
450~400
绿色
560~500
近紫外光
400~200
4．互补色光将两种适当颜色的单色光按一定强度比例混合后得到白光，则这两种单色光互称为互补色光，简称补色光，如图8-2所示。
图8-2互补色光示意图
在图8-2中，通过原点的直线对应两端的两种色光都是互为补色光。
例如，紫光与绿光互补，蓝光和黄光互补。
实验证明，日光是由很多对补色光按一定强度比例混合而成的。
8.1.3物质的颜色与物质对光的吸收之间的关系
如果把具有各种颜色的物体放置在黑暗处，则什么颜色也看不到。
可见，物质呈现的颜色与光线有着密切的关系。
物质的颜色就是光源发射的光线照射到该物质上，该物质吸收了某种波长的光线后又反射或透过另一种波长的光线到眼睛里，引起视觉有色感的结果。
一种物质能呈现何种颜色，与光的波长和物质本身的结构有关。
1．固体物质颜色与其对光的吸收的关系当白光照射到固体物质上时，由于固体物质的透光程度不同，对各种光线的吸收、透过、反射的程序也不同，从而呈现出不同的颜色。
固体物质颜色与其对光的吸收的关系如表8-3所示。
表8-3固体物质颜色与其对光的吸收的关系
固体物质呈现的颜色
固体物质对光的吸收
黑色
对各种波长的色光都能完全吸收
白色
对各种波长的色光都完全反射
灰色
对各种波长的色光均匀地吸收
呈现与吸收光呈互补关系的色光颜色
固体物质选择性地吸收了某种单色光
如红色
吸收了蓝绿色光
如绿色
吸收了紫色光
2．溶液的颜色与光的吸收之间的关系当白光照射到溶液中时，溶液中的溶质分子或离子选择性地吸收了白光中的某一色光，并将这一色光的补色光透过溶液，因此，我们看到溶液的颜色是与溶液吸收光成互补色光的颜色。
不同溶液对光的选择性吸收不同，从而呈现不同的颜色。
例如，高锰酸钾溶液能够吸收白光中的绿色光而呈现紫色。
再如硫酸铜溶液能够吸收白光中的黄色光而呈现蓝色。
课堂讨论举例说明生活中常见物品的颜色与其对光的吸收之间的关系。
课堂讨论溶液的特征是什么？
无色溶液与光的吸收之间的关系怎样？
有无黑色或白色溶液？
为什么？
8．2光的吸收定律
8.2.1透光率与吸光度
1．透光率
当一来平行的单色光照射到均匀、无散射的溶液时，一部分光被溶液吸收，一部分光透过溶液，还有一部分光被器血表面反射。
溶液对光的吸收如图8-3所示。
图8-3溶液对光的吸收示意图
入射光的强度Io，透过光的强度It，吸收光的强度Ia，反射光的强度Ir，则
Io=It+Ia+Ir
在分光光度分析中，通常将被测溶液与参比溶液或标准溶液置于相同材质与型号的器皿中。
因此，反射光的强度基本相同且很小，可以忽略，则上式可以简化为
Io=It+Ia
透过光的强度It与入射光的强度Io的比值称为透光率或透光度，用符号T表示，则
溶液的透光率越大，表示它对光的吸收程度越小。
溶液的透光率越小，表示它对光的吸收程度越大。
2．吸光度溶液对光的吸收程度称为吸光度，用符号A表示。
在实际应用时，吸光度A等于透光率T的负对数。
即
A=-lgT或T=10-A
8．2．2光的吸收定律
1.光的吸收定律光的吸收定律又称为朗伯—比尔定律，光的吸收定律的物理意义可以表述为当一束平行的单色光通过均匀、无散射的含有吸光性物质的溶液时，在入射光的波长、强度及溶液的温度等条件不变的情况下，该溶液的吸光度A与溶液的浓度c及液层厚度L的乘积成正比。
光的吸收定律的数学表达式为
A=K·
c·
L
式中K为吸光系数，是吸光物质在浓度为1及液层厚度为1cm时的吸光度。
在给定单色光、溶剂和温度等条件下，吸光系数K是物质的特征常数，表明物质对某一波长的吸收能力。
光的吸收定律表明了物质对光的吸收程度与其浓度及液层厚度之间的数量关系，它不仅适用于均匀、无散射的溶液，而且也适用于均匀、无散射的固体和气体；
不仅适用于可见光区，也适用于红外光区和紫外光区。
光的吸收定律是分光光度法进行定量分析的基本定律。
光的吸收定律仅适用于一定浓度范围的稀溶液。
2．吸光系数溶液浓度的单位不同，吸光系数的物理意义和表达方式也不同。
吸光系数常用以下几种表达方式。
（1）摩尔吸光系数当入射光波长一定时，溶液浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时的吸光度，用符号ε表示，单位为L/mol·
cm（L·
mol-1·
cm-1）。
通常将ε≥104时称为强吸收，ε＜102时称为弱吸收，ε介于两者之间时称为中强吸收。
摩尔吸光系数通常不能直接测定，而是通过测定已知准确浓度的稀溶液的吸光度，根据光的吸收定律求得，即摩尔吸光系数的数学表达式为：
（2）百分吸光系数百分吸光系数也称为比吸光系数。
当入射光波长一定时，溶液浓度为1%（即100ml溶液中含有1g被测物质），液层厚度为1cm时的吸光度，用符号
表示，单位为100ml/g·
cm（100ml·
g-1·
百分吸光系数与摩尔吸光系数之间的换算关系为：
式中M为被测物质的摩尔质量。
不同物质对同一波长单色光可以有不同的吸光系数。
同一物质对不同波长的单色光也会有不同的吸光系数。
一般用物质的最大吸收波长λmax的吸光系数作为一定条件下衡量灵敏度的特征常数，因此，吸光系数是分光光度法进行定性和定量分析的重要参数之一，ε或
越大，表明相同浓度的溶液对某一波长的入射光越容易吸收，测定的灵敏度越高。
（3）光吸收系数当入射光波长一定时，溶液浓度为1g/L，液层厚度为1cm时的吸光度，用符号α表示，单位为L/g·
cm（L·
摩尔吸收系数ε、光吸收系数α与百分吸光系数
之间的换算关系为
ε=α·
M
例1．用双硫腙测定Cd2+溶液的吸光度。
若配置Cd2+溶液的浓度为140μg/L，并置于厚度为1cm的吸收池中，在λmax=525nm波长处，测得吸光度为0.220，试计算摩尔吸光系数及比吸光系数。
解：
已知镉的摩尔质量为112.4g/mol
Cd2+的物质的量浓度为
根据光的吸收定律A=ε·
8.3紫外-可见分光光度计
8.3.1主要部件
分光光度计是指研究吸收或发射的电磁辐射强度和波长关系的仪器，分光光度计的波长范围不同，可以分为不同的分光光度法，但其主要部件和工作原理基本相似。
波长在200～760nrn范围内，能够任意选择不同波长的单色光用来测定溶液的吸光度（或透光率）的仪器，称为紫外—可见分光光度计。
这类仪器的主要部件如图8-3所示。
图8-4分光光度计主要部件方框图
1．光源光源的主要作用是发射强度足够均匀的稳定的具有较宽的波长范围的连续光谱的复合光。
紫外—可见分光光度计常用氢灯和钨灯两种光源。
（1）氢灯或氘灯氢灯或氘灯都是气体放电发光的光源，发射150～400nrn的连续光谱。
氘灯产生的光谱强度比氢灯大3~5倍，而且寿命也比氢灯长。
（2）钨灯或卤钨灯钨灯或卤钨灯都是热辐射发光的光源，发射360～2500nrn的连续光谱，主要用于可见和近红外光区的测量。
钨灯又称白炽灯，卤钨灯是在钨丝灯泡内填充碘或溴的低压蒸气，减少了钨原子的蒸发，能够延长灯的使用寿命，且发光效率明显提高。
2．单色器单色器的作用是将来自光源的复合光色散分离出所需单色光波长的光学装置，是分光光度计的关键部件。
3．吸收池用来盛放溶液的容器称为吸收池，也称为比色皿或比色杯。
在可见光区测定时，可用光学玻璃材质制成的吸收池。
在紫外光区测定时，必须使用石英材质制成的吸收池。
4．检测器检测器的作用是检测来自吸收池的光信号并将其转换为电信号。
检测器是利用光电效应将接收到的光信号转变为便于测量的电信号，光照射产生的光电流，在一定范围内与照射光的强度成正比。
现在的分光光度计常用光电管和光电倍增管作为检测器。
光电管与光电倍增管的工作原理基本相似，光电管输出的电讯号很弱，需经放大后输入显示器；
光电倍增管能产生较强的光电流，其灵敏度比光电管要高得多。
5．信号处理与显示器光电流经过放大后，以适当的方式将测量结果显示出来。
信号处理过程包含一些数学运算，信号处理装置可对信号进行放大及自动记录与打印，并能进行波长扫描。
显示器常用的有电表指示、荧光屏显示、数字显示装置等，显示数据主要有透光率与吸光度，有的还能转换成浓度、吸光系数等显示。
8．3．2紫外—可见分光光度计的类型
紫外—可见分光光度计型号很多，改进也快，尤其近年来很多仪器装配了计算机和光多道二极管陈列检测器，使仪器的质量、功能和自动化程度都得到了很大提高。
不同类型的分光光度计之间的主要区别是光学系统不同。
1．可见分光光度计
可见分光光度计的光源一般是钨灯，电磁辐射的波长范围为360~800nm，单色光器为光栅，每台仪器配有厚度不等的一套石英材料制成的吸收池，检测器为真空光电管，显示器为数字显示，较早的也有指针显示。
这种仪器的构造简单，单色性较差，常用于可见光区的一般定量分析。
在实际工作中，较早使用的有721型分光光度计，现常用的是国产722型可见分光光度计。
722型分学光度计的外形如图8-5所示：
图8-5722型分光光度计外形图
2．单光束分光光度计
这类分光光度计用钨灯或氢灯作光源，从光源到检测器只有一束单色光。
仪器的结构简单，对光源发光强度的稳定性要求较高，常用的有国产7530型、UV755B型、TU-1810型和日产岛津QR-50型等。
如UV55B型分光光度计的外形如图8-6所示。
图8-6UV755B型分光光度计的外形图
3．双光束分光光度计
这类分光光度计的特点是从单色器发射一束单色光，经过一个旋转的扇面镜将它分成波长相同的两束交替的单色光，分别通过样品池和参比池后，再用一个同步旋转的扇面镜将两束透过光交替照射到光电倍增管上，使光电管产生一个交变脉冲信号，经过比较放大后，由显示器显示出透光率、吸光度、浓度或进行波长扫描，记录吸收光谱，这类仪器的特点是测量中不需要移动吸收池，可在随意改变波长的同时记录所测量的光度值，便于描绘吸收光谱。
如国产740型和TU-1901型，英国产UnicamSP700型，美国产uv-6100型，日产岛UV-200型及UV-240型等。
4．双波长分光光度计
这类分光光度计的特点是仪器采用两个并列的单色光器，分别产生不同波长的两束色光，交替照射同一试样溶液，得到同一试样溶液对不同波长单色光的吸收度差值。
其优点一是不需要参比溶液；
二是可以用双波长的方式工作，也可以用单波长双光束的方式工作。
如国产WFZ800-S型，日产岛津UV-300型等。
8．3．3紫外-可见分光光度计的光学性能
不同型号的紫外—可见分光光度计的价格差异较大，主要是由其光学性能决定的，一般从以下几个方面进行比较和考察，根据不同的测量要求选择相应的仪器。
1．测光方式指仪器显示的测定数据结果，如透光率、吸光度、浓度、吸光系数等。
2．波长范围指仪器可以提供测量光波的波长范围。
可见分光光度计的波长范围一般为400~1000nm，紫外—可见分光光度计的波长范围一般为190~1100nm。
3．狭缝或光谱宽是仪器单色光纯度指标之一，低档仪器的谱带宽度可达几个纳米。
高档仪器的谱带宽度一般小于1nm。
一般仪器的狭缝宽度是固定的，精密仪器的狭缝宽度是可以调节的。
4．杂散光通常以光强度较弱处（如220nm或340nm处）所含杂散光强度的百分比作为指标。
一般仪器不超过0.5%，高档仪器可小于0.1%。
5．波长准确度指仪器显示的波长数值与单色光实际波长之间的误差，高档仪器可低于±
0.2nm，中档仪器大约为±
0.5nm，低档仪器可达±
5nm。
6．吸光度范围指吸光度的测量范围。
中档仪器一般为-0.1730~2.00，高档仪器可任意设定。
7．波长重复性指重复使用同一波长时，单色光实际波长的变动值。
此值大约为波长准确度的二分之一。
8．测光准确度常以透光率误差范围表示，高档仪器可低于±
0.1%，中档仪器不超过±
0.5%，低档仪器可达±
1%。
9．光度重复性指在相同测量条件下，重复测量吸光度值的变动性。
此值大约为测光准确度的二分之一。
10．分辨率指仪器能够分辨出最靠近的两条谱线间距的能力。
高档仪器可低于0.1nm，中档仪器一般小于0.5nm。
8．4定量分析方法
利用紫外—可见分光光度法既可对物质进行定性分析，又可进行定量分析，这里主要讨论定量分析。
紫外—可见分光光度法不仅可以对在紫外—可见光区有吸收的无机物和有机化合物进行定量分析，而且还能够对在紫外—可见光区没有吸收的物质，通过与某些试剂发生“显色反应”生成有强烈吸收的产物，实现对“非吸收物质”的定量测定。
紫外—可见分光光度法进行定量分析的理论依据是光的吸收定律A=K·
L，在一定条件下，被测溶液的吸光度与其浓度呈正比，因此，可以选择适当的工作波长进行定量分析。
利用分光光度法进行定量分析的分析方法较多，下面介绍几种常用的方法。
8.4.1标准曲线法
标准曲线法又称为工作曲线法，是分光光度法中最经典和较简便易行的定量方法，特别适合于大批量样品的定量测定。
在测量时，要求用同一台仪器，在固定工作状态和测量条件下，当液层厚度一定时，溶液的吸光度与其浓度呈正比，即A=K´
·
c。
1．配制标准溶液按照滴定分析中直接法配制标准溶液相同的要求配制分光光度法中所需的标准溶液。
2．配制标准系列取若干个相同规格的容量瓶或比色管，按照体积由少到多的顺序依次加人标准溶液，在相同的条件下加适量溶剂稀释，并分别加人等体积的试剂及显色剂，再加溶剂稀释至相同的体积，摇匀备用。
3．配制样品溶液另取一个相同规格的容量瓶或比色管，精密吸取一定体积的原样品溶液，按照与标准系列相同的操作程序和实验条件，配制一定浓度的样品溶液。
若要测定大批量试样，则按照同样要求配制大批试样溶液。
4．测定标准系列和样品溶液的吸光度选择合适的参比（空白）溶液，在相同的条件下，以该溶液最大吸收波长λmax的光作为人射光，分别测定标准系列各溶液和样品溶液所对应的吸光度。
5．绘制标准曲线根据测定结果，以标准系列溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吸光度一浓度曲线（A—c曲线），称为标准曲线，也称为工作曲线或A-c曲线。
如果标准系列的浓度适当，测定条件合适，理想的标准曲线是一条通过坐标原点的直线，如图8-7所示。
图8-7标准曲线
6．计算原样品溶液的浓度根据测定样品溶液的吸光度，在标准曲线上的纵坐标上找到A样，再在标准曲线的横坐标上确定所对应的样品溶液的浓度c样，如图8－7所示。
最后，根据配制样品溶液时所取的原样品溶液的体积以及稀释后的体积，用下式计算原样品溶液的浓度c原样。
c原样=c样×
稀释倍数
这种方法很适用于常规的分析工作，但仪器经搬动或维修后应重新校正波长。
更换仪器时，必须重新绘制标准曲线。
课堂讨论滴定分析中的标准溶液与分光光度法中的标准溶液有何异同？
8.4.2标准对较法
标准对照法又称比较法或对比法。
在相同条件下，配制标准溶液与样品溶液，用该溶液最大吸收波长λmax作为入射光，分别测定标准溶液和样品溶液的吸光度，根据光的吸收定律得：
=Kc标L
=Kc样L
因为标准溶液与样品溶液中的吸光性物质是同一化合物，所以在相同的条件下，二者的吸光系数K和液层厚度L的数值相等，故得
，则：
根据稀释倍数可以求出原样品溶液的浓度为：
c原样=c样×
当测定试样溶液中某组分的含量时，可同时配制相同浓度的样品溶液
和标准品溶液
，即
=
，在最大吸收波长λmax处分别测定二者的吸光度
和
，设
为样品溶液
中纯被测组分的浓度，则：
根据下式可以计算出样品中纯被测组分的质量分数ω。
例2．分别取不纯的KMnO4样品与标准品KMnO4各0.1000g，分别用1000ml容量瓶定容。
各取10.00ml稀释至50.00ml，在λmax=525nm时，测得
=0.220，
=0.260，求样品中纯KMnO4的质量分数。
因为
=0.1000×
g
升级会员 