高效液相色谱法讲义包含讲义和实验Word下载.docx

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分配色谱的色谱过程本质上是组分分子在固定想和流动相之间不断达到溶解平衡的过程。

（3）离子交换色谱

离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。

离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。

固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。

（4）凝胶色谱

凝胶色谱的原理比较特殊，类似于分子筛。

待分离组分在进入凝胶色谱后，会依据分子量的不同，进入或者不进入固定相凝胶的孔隙中，不能进入凝胶孔隙的分子会很快随流动相洗脱，而能够进入凝胶孔隙的分子则需要更长时间的冲洗才能够流出固定相，从而实现了根据分子量差异对各组分的分离。

调整固定相使用的凝胶的交联度可以调整凝胶孔隙的大小;

改变流动相的溶剂组成会改变固定相凝胶的溶涨状态，进而改变孔隙的大小，获得不同的分离效果。

二、高效液相色谱法简介

1.高效液相色谱发展背景

液相色谱法发展初期是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。

高效液相色谱法（HighperformanceLiquidChromatography，HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。

它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法（HighPressureLiquidChromatography，HPLC）。

又因分析速度快而称为高速液相色谱法（HighSpeedLiquidChromatography，HSLP）。

也称现代液相色谱。

一句话，高效液相色谱是以高柱效小颗粒填料为载体，以高压泵为流动相驱动力，对物质进行快速分离和分析的方法。

2.高效液相色谱的特点

高效液相色谱的“高效”主要体现在以下“四高”：

（1）高压

流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。

（2）高速

分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。

（3）高效

分离效能高。

可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。

（4）高灵敏度

紫外检测器可达0.01ng，进样量在μL数量级。

三、高效液相色谱的组成

1.系统结构简图（以安捷伦1220为例）

如上图所示，高效液相色谱主要有储液瓶、高压泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱工作站组成。

2.储液瓶和脱气机

主要用于存储流动相（溶剂或缓冲液）和除去流动相中的气泡。

流动相进入高压泵之前必须脱气（脱气机一般包含在高压泵组件中），尤其是水和极性溶剂。

否则气泡进入色谱柱以后，将影响分离效率、基线不稳使检测器灵敏度降低，甚至不能正常工作。

3.高压泵

色谱柱用细粒填料，填充紧密，液体流动相粘度高，阻力大，必须高压输液。

高压泵是高效液相色谱的关键部件，直接影响整个仪器和分析结果的可靠性。

高压泵分为两类：

恒流泵和恒压泵。

恒流泵：

柱阻力变化，流动相粘度变化，引起柱压变化而流量恒定，如往复柱塞泵。

恒压泵：

流量可随外界阻力变化而输出压力恒定，例如装柱用的气动泵。

HPLC广泛采用往复柱塞泵，由液缸，柱塞，单向阀和驱动机构组成。

密封圈耐磨（PTF-石墨）单向阀，柱塞为人造红宝石。

泵流量不稳将影响化合物的保留时间，直接影响峰面积重现性和定量精度，使噪音变大，最小检测量变大。

双柱塞泵流量平稳，输液精度高，流量精量+/-0.1%，流量准确度+/-1%。

双柱塞泵液缸容积很小（几微升~几百微升）适于梯度洗脱。

为提供无脉动的准确流量，在输液系统中还需加一些辅助设备：

过滤器、混合器、阻尼器，测压装置。

多元混合溶剂需用比例阀，如二元、三元和四元比例阀。

溶剂按预定比例，低压混合后，经高压泵输入系统。

4.进样系统

HPLC采用六通阀进样，重现性好，操作方便，易于自动化，大大提高了分析精度。

注射器进样：

绝对误差在5%左右，相对误差在1%。

阀进样：

误差均在1%以内。

进样量由定体积定量管和平头微量注射器控制，注射器体积应为定量管体积的2~3倍。

HPLC柱可注入较大体积的稀溶液，进样体积在10~250ul。

对于多样品的连续分析，可以采用自动进样系统；

该系统可以在软件的控制下，自动逐个进样。

5.色谱柱

色谱柱是色谱仪最重要的部件。

通常用厚壁玻璃管或内壁抛光的不锈钢管制作的，对于一些有腐蚀性的样品且要求耐高压时，可用铜管、铝管或聚四氟乙烯管。

柱子内径一般为1～6mm。

常用的标准柱型是内径为4.6或3.9mm，长度为15～30cm的直形不锈钢柱。

填料颗粒度5～10μm，柱效以理论塔板数计大约7000～10000。

色谱柱的发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。

填料的类型决定了色谱柱的用途。

液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。

正相柱：

多以硅胶为柱填料。

根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3—10μm的范围内。

另一类正相填料是硅胶表面键合—CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。

反相柱：

主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团（ODS）的非极性填料。

也有无定型和球型之分。

常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在3—10μm之间。

6.检测器

高效液相色谱仪的检测器主要用于分析样品信号的采集，常用的检测器有紫外检测器、荧光检测器、示差检测器、电导检测器、光电二极管阵列检测器等。

（1）紫外检测器

它是利用被分析样品对特定波长紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关系遵守比尔定律。

是最常用的检测器，应用最广，对大部分有机化合物有响应，具有灵敏度高、线性范围宽等优点。

（2）荧光检测器

荧光检测器是一种高灵敏度、高选择性检测器。

对多环芳烃，卟啉类化合物、维生素B、黄曲霉素、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。

其结构及工作原理与荧光光度计相似。

（3）示差检测器

除紫外检测器之外应用最多的检测器。

示差折光检测器是通过连续测定流通池中溶液折射率的方法来测定试样浓度的检测器。

溶液的折射率是纯溶剂（流动相）和纯溶质（试样）折射率乘以各物质的浓度之和。

因此溶有样品的流动相和纯流动相之间折射率之差表示试样在流动相中的浓度。

（4）电导检测器

其作用原理是根据物质在某些介质中电离后所产生电导变化来测定电离物质含量。

（5）光电二极管阵列检测器

阵列由1024个光电二极管阵列，每个光电二极管宽仅50μm，各检测一窄段波长。

如图所示，在检测器中，光源发出的紫外或可见光通过液相色谱流通池，在此流动相中的各个组分进行特征吸收，然后通过狭缝，进入单色其进行分光，最后由光电二极管阵列检测，得到各个组分的吸收信号。

经计算机快速处理，得三维立体谱图。

7.色谱工作站

色谱工作站主要完成色谱信号的在线采集、检测、调整和数据处理，不同厂家的高效液相色谱配备有不同的色谱工作站。

四、高效液相色谱的应用

高效液相色谱法的应用远远广于气相色谱法。

它广泛用于合成化学、石油化学、生命科学、临床化学、药物研究、环境监测、食品检验及法学检验等领域。

1.在生命科学中的应用

　　主要用于两大类分子的分析，分别是低分子量物质（如氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇、卟啉等）和高分子量物质（如多肽、核糖核酸、蛋白质和酶等）的分离分析。

2.在食品分析中的应用

　　主要包括对食品中营养成分（如蛋白质、氨基酸、糖类、维生素等）、添加剂（甜味剂、防腐剂、着色剂等）以及污染物（如霉菌毒素、多环芳烃等）的分析。

3.在医学检验中的应用

　　主要用于体液中代谢物测定、药代动力学等研究、以及临床药物监测。

4.在环境分析中的应用

主要包括环芳烃（特别是稠环芳烃）、农药（如氨基甲酸脂类，反相色谱）残留等分析。

参考书:

[1]图解高效液相色谱技术与应用，于世林，科学出版社，第1版（2009年5月1日）

第二部分：

实验部分

一、实验目的

1.了解高效液相色谱仪的原理、结构及其各部分的功能；

2.学习安捷伦1220高效液相色谱仪的结构和操作流程；

3.使用安捷伦1220高效液相色谱仪对基础有机化学实验中得到的产物进行分析；

二、实验原理

液相色谱法是吸附色谱法的一种，开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。

安捷伦1220高效液相色谱仪主要由储液瓶、高压泵（包括泵头、脱气机和混合器）、进样器（六通阀）、色谱柱和紫外检测器和色谱工作站六个部分组成，分别用于流动相的储存和脱气、提供压力、进样、样品分析、样品检测，以及数据采集和分析，可以用于具各种有紫外吸收特性的化合物的分析，包括各种样品的纯度分析和定量分析等。

三、实验器材

1.实验仪器

安捷伦1220高效液相色谱仪及EZchromelite色谱工作站；

2.实验材料

色谱级甲醇、蒸馏水、一次性注射器，针头式过滤器、样品瓶（10mL）

3.实验药品

测试标准品（酪氨酸溶液，2mM）、基础有机化学实验合成得到的产物（包括咖啡因、苯甲醇、苯甲酸等）

四、实验步骤

1.样品制备

1）标准品的制备：

称取18.1mg酪氨酸（Tyr）溶于50mL双蒸水，针头式过滤器过滤后备用；

2）测试品的制备：

取少量化合物（有机化学实验合成产物），容易一定体积的蒸馏水或色谱级甲醇，针头式过滤器过滤后，在样品瓶中备用；

2.安捷伦1220液相色谱仪开机

先开硬件再开软件。

打开液相色谱仪电源后，再打开电脑桌面的数据采集软件（色谱工作站EZchromelite）。

3.设置测试方法

根据经验或已有文献设置测试方法。

包括流动相（甲醇和蒸馏水）的洗脱梯度的设置（流动相比例和相应的洗脱时间），检测器检测波长的选择。

4.基线调整

重新设置检测波长后需要对基线进行校正。

运行基线调整程序，使基线恢复到0点。

5.准备进样

将进样器状态调整到“Load”位置后将待测样品插入进样针，待样品信息设置结束后，准备进样。

6.样品信息设置

点击“单次运行”，根据对话框设置样品的名称以及存放位置。

设置完毕后，点击“开始”运行本次实验。

7.进样

“开始”实验后，注意右下方状态栏的提示，出现“等待进样”后，将样品注入进样器，同时将进样器调整到“inject”位置。

此时样品开始进入色谱柱，开始分析。

8.数据采集

根据“在线信号”实时监测样品分析进度。

9.结果分析和输出

通过“离线模式”打开EZchrom工作站，对数据进行分析和输出。

五、实验结果

1.测试样品名称：

例如咖啡因

2.测试方法（包括浓度变化及其时间）

例如：

（其中A甲醇，B为蒸馏水）

3.测试结果（测试结果打印后，贴在此处）

六、实验讨论

与小组内其他同学的实验结果进行比较，对自己的实验结果进行分析（例如色谱溶剂的比例和时间对样品的出峰时间和峰形的影响，自己合成样品的纯度及可能的杂质等）