薄层色谱板的制备和使用Word格式.docx

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三、薄层板的使用

1．点样

将样品溶于适当的溶剂中（应尽量避免有水），取微量注射器或玻璃毛细管截齐后，吸取一定量的检样，轻轻接触到薄层上，使样品自动吸到薄层上，点的直径不要超过0.3厘米，一次不能点完，待干后再点，稍有过分就会损伤板面，影响展开后的斑点形状。

每两个样点之间相距至少1.5厘米。

点样的起点距薄板底边至少1.5厘米，以免样点浸入展开溶剂中，同块薄板上各样点应保持在与底边平行的一条直线上，为控制好点样距离，应用薄层点样尺架。

2．展开

根据薄层板大小，自行选用适当玻璃标本缸，长方形，如17×

10×

6厘米的标本缸可容纳下15×

9厘米的玻璃板。

采用较大的玻璃缸和玻璃板时，在缸内沿周围缸壁衬一层预先浸有溶剂的滤纸，以便缸内展开溶剂易达到饱和，防止边缘效应（即两边缘的点走得快）和同一物质Rf值不一致现象。

一般将薄层板斜置展开容器内，密闭。

先不使溶剂浸湿薄层板，饱和10~15分钟后再进行展开，展开溶剂沿着薄层板向上移动。

对加粘合剂的涂板可以近于垂直的状态进行展开，而对未加粘合剂的薄层板则必须以倾斜状态（15度角）进行展开。

为了防止产生“边缘效应”和展开溶剂不饱和现象。

还可采用夹心式展开容器，其方法是将薄层板的左右两侧各刮去5~10毫米，垫上条状玻璃或塑料，盖一块与薄层板同样大小的玻璃，用夹子将两边夹好，插入展开溶剂中进行展开，并能取得良好效果。

3．显色

薄层展开后，凉干。

如含粘合剂，即可直接喷显色剂，使之显色，有的还需经紫外线（254nm）照射后方能显色；

对不含粘合剂的薄板，在喷显色剂时应尽量远离薄层板，否则会连吸附剂一起吹掉，应予以注意。

四、检样的定性定量分析

1．比移值（Rf）的测定

当样品的薄板一端被展开，经过毛细管作用流向另一端，样品是按一定的比例分配在固定相与流动相之间。

并沿着溶剂流动的方向移动，由于样品中各组分在两相中分配系数不同，各组分的移动速度也不同，经一定距离后使各组分彼此分离。

样品各组分移动的速率，亦即分离后在薄层板上的位置与溶剂展开前沿的距离的比值为比移植。

2．定性分析

相同的物质Rf值应当是相同的，但因能影响Rf值的因素很多，要想得到与标准物质相同的Rf值，最好在鉴定时，将样品与标准物质点在同一张薄层板上一同展开，根据检样斑点的Rf值与标准样品的Rf值比较，即可确定二者是否相同，但要做到准确的定性，需要两种以上展开溶剂系统所得的Rf值比较判断。

3．定量分析

（1）目测比较法

①用吸附剂（如硅胶G）涂布成厚0.25~0.5毫米，大小20×

20厘米的薄层板，110℃活化30分钟，室温冷却。

②用微量注射器（10微升）在距板底1.5厘米处，将标准样品溶液按1、3、5、7微克自左向右点在起始线上，然后再吸取不同量的检材提取溶液（相同于1、3、5克检材的提取溶液）按次序点在同一板的右侧。

③选择比移值适中的展开剂（Rf在0.45~0.75之间者）用夹心式展开法或连续薄层展开法。

展开距离为10厘米，显色剂要求能使显色后的斑点明显清晰。

这样得到的色斑比较集中，重现性好，便于比较。

④显色后，观察其色斑大小，深浅与已知不同浓度的标准样品系列色斑相比较，粗略定出含量，然后算出检液总体中含量，根据所取检材量，求出百分含量。

（2）洗脱测定法

①在制备好的薄层板左端，先点一标准样品点，作为对照定位用，然后根据检材提取溶液的多少，在同一板的右端点成点状或线状。

②置玻璃缸中展开（如有连续薄层展开仪更好），展开后晾干，再用玻璃板遮住右侧检材部分，仅使对照定位点显色。

③显色后，根据斑点位置将未显色部分（相当于色斑所在部分）的吸附剂用刮刀刮下或用抽吸法收集起来。

④将收集的吸附剂置于小层析柱管中，用极性大的溶剂甲醇或乙醇进行洗脱，收集洗脱液并加以浓缩。

⑤用适当溶剂调整到一定体积，可用紫外分光光度计，在被检物最大吸收波长处进行测定。

同时用薄层吸附剂洗脱液作空白吸收值测定。

如有灵敏度高专属性好的比色反应，还可用比色计测定化合物的含量。

上述洗脱液亦可作为气相色谱仪、液相色谱仪分析前的处理液。

（3）薄层色谱扫描仪测量法

以洗脱法处理层析色斑，不仅操作麻烦，而且有些待测成分不能定量地洗脱下来。

或者在洗脱过程中发生分解，影响测定结果的准确性，最好是采用双波长薄层色谱扫描仪直接定量检测，经电子积分器积分推算出检样中待测物质的含量。

其测定方法包括为：

①斑点面积测量法；

②斑点光密度测量法；

③斑点荧光测量法。

附：

实验仪器

1．薄层涂布器 

2．微量注射器 

3．薄层点样尺架

4．薄层板展开缸 

5．吸引器 

6．喷瓶

7．烘烤箱

实验二 

氢氰酸及氰化物的检测

了解氰化物中毒的条件和毒性反应，掌握氰化物的化学性质，检材的采取及处理方法和常见的鉴定方法。

一、检材采取和毒物的分离

1．检材采取：

最好的检材为中毒者剩余的食物、饮料、呕吐物及尸体胃和胃内容物，其次为血液，肺、肝、脑等。

吸入中毒的应采取血液为宜。

检材应盛于密闭容器内，并尽量少留空间，尽快进行检验，不能及时检验者应将检材低温冰冻保存。

2．毒物分离：

含氰化物中毒检材的分离采用水蒸气蒸馏法

（1）分离原理：

氰化物遇酸可形成易挥发的氢氰酸，氢氰酸具有较高的蒸气压，检材在酸性条件下当和水同时加热或通入热水蒸气时，能随水蒸汽在较低的温度沸腾蒸馏出来，在碱性环境下被冷却收集，达到分离的目的。

（2）操作方法：

取适当量检材（10～50克），剪碎或捣碎，放入250毫升圆底烧瓶中，加水2倍，再加10％的酒石酸酸化（PH5）。

取1000毫升烧瓶作为水蒸气发生瓶，倒入热水，投入数小块沸石，上插安全管（长度60厘米的玻璃管）。

按图所示：

用连接管将两瓶相连，将检材瓶浸入水浴锅中接上冷凝管，收集液瓶中加入5毫升0.01N氢氧化钠溶液使接收管直接通到受液瓶中稀碱液液面下，以防馏出氰化物逸失，检查所有瓶塞及各接头处紧密不漏气后，将水蒸气发生瓶和水浴锅同时加热，收集馏液10分钟备检。

〔注意事项〕

（1）检材处理的愈碎愈好，检材溶液必须呈酸性。

（2）蒸馏装置的各接头处必须严密不漏气。

（3）蒸馏完毕后，应先将受液瓶取下，再将水蒸气发生瓶的瓶塞放松，或将水蒸气发生瓶与检材瓶之间的连接处拆开，然后再停止加热以防各瓶之间相互倒流。

（4）对血液、面糊、稀粥等检材，可加入2～3毫升液体石蜡或适量的三氯醋酸溶液，以避免蒸馏时发生大量的泡沫溢入冷凝管。

（5）蒸馏瓶中的内容物，不能超过瓶容积的1/3。

二、氢氰酸及氰化物的鉴定方法

（一）普鲁士蓝反应：

1．原理：

蒸馏出来的氢氰酸吸收在稀碱溶液中生成氰化钾，加硫酸亚铁后生成亚铁氰化钾（黄血盐），后者与溶液内亚铁氧化成高铁，在酸性条件下，化合为亚铁氰化铁，即普鲁士兰或柏林蓝。

该反应是氰化物的专属反应，阳性结果可确证氰化物的存在，反应灵敏度为1：

5000。

2．操作方法：

取蒸馏液3～5毫升，加新配的20％硫酸亚铁2滴，加热至恰沸，加稀硫酸使成酸性，如有氰根视含量多少，溶液有蓝绿色至深蓝色。

量多即析出蓝色沉淀，量少时颜色和沉淀可能要隔24－48小时后才显出。

（二）氰化物的快速检验法

检材不经水蒸气蒸馏，可直接做普鲁士兰试验。

氢氰酸与硫酸亚铁－氢氧化钠试纸作用生成亚铁氰化物，在酸性条件下，再与由空气氧化产生的三价铁离子作用生成普鲁士兰。

6HCN+Fe2++6OH-=Fe（CN）64-+6H2O

4Fe3++3Fe（CN）4-6＝Fe4[Fe（CN）6]3（普鲁士兰）

取检材5～10克，置锥形瓶中，加适量水调成稀糊状，加10％的硫酸使之变成酸性，取滤纸一小方，滴加新配制的20％硫酸亚铁2滴及10％氢氧化钠2滴，将此滤纸覆盖于锥形瓶口，瓶底缓缓加热，待有蒸气上冒，取下滤纸，浸入6N盐酸内，如有氰根，滤纸即蓝色斑点，水洗，色斑更鲜艳。

实验三 

血中一氧化碳的检测

熟悉一氧化碳中毒的特征和检材的采取要点，掌握碳氧血红蛋白分析鉴定方法及饱和碳氧血红蛋白的制备技术。

一、检材的采取

一氧化碳中毒检材以取血液为最好，对于尸体通常是采取心腔内血液进行检测。

活体通常静脉采血并要加抗凝剂，密封。

盛装检血的容器应将检血装满不要留有空间，以避免一氧化碳损失而影响检验结果。

二、碳氧血红蛋白的鉴别试验

1．煮沸法

取血2－3毫升，置试管内，放水浴锅中加热，使发生凝固。

如系一氧化碳血，呈砖红色凝固体，而正常血则呈褐色或黑褐色凝块。

此法最简便，不需任何试剂，在勘验现场即可进行，但含量在40％才可测出。

2．硫化铵法

取水10毫升，加血5滴，加硫化铵5滴，较混合之，再加少量10％醋酸使微呈酸性，如系一氧化碳血，呈玫瑰色；

而正常血为绿褐色。

此法灵敏，含量在10％即可检出。

3．碱液稀释法

取血1－2滴，加水稀释至15毫升，再加5滴10％氢氧化钠，同时取一正常血样作对照，与碱液混合后立即记下时间，正常血由于碱性正铁血红素的形成，立即变为草绿色或绿褐色而含10％以上一氧化碳血液需要15秒钟后才变为草绿色或绿褐色；

含50％者需要50秒钟后。

4．钯镜试验

（1）原理：

碳氧血红蛋白与硫酸作用释放出一氧化碳，一氧化碳可使氯化钯还原成钯镜。

取扩散皿（孔威氏盒）一个，内槽内放入0.5毫升0.1％氯化钯溶液，外槽内一侧放入0.5毫升检血，另一侧放入0.5毫升10％硫酸溶液（封盖前不要让它们接触），然后盖上盒盖，轻轻摇晃使血液与硫酸充分接触。

20分钟至2小时内观察试验结果，如有一氧化碳释出，可见内圈形成发亮的钯镜。

以上各鉴别试验，一定要取正常血同时做对照试验，以作对比。

三、碳氧血红蛋白的定量检验

1．实验室中饱和碳氧血红蛋白的制备：

实验装置图见下：

1.硫酸 

2.甲酸 

3.血液 

4.20％NaOH

一氧化碳发生装置

先将浓硫酸加热，而后扭开分液漏斗活塞，让甲酸（H－COOH）一滴一滴与浓硫酸接触，即有一氧化碳气体冒出，经过洗气瓶，通入盛有正常血的瓶中，10毫升血（用0.05克枸椽酸钠作抗凝剂）通一氧化碳约15分钟，即可使血红蛋白的一氧化碳饱和度达l00％，避免通气过猛，以免血液内产生大量泡沫外溢。

因每人Hb含量不同，最好取死者血通以一氧化碳使达饱和，可省去换算。

2．吸收光谱法测定血中HbCO饱和度

在各类测定方法中，研究和应用最多的是利用可见光吸收光谱的分光光度法来测定血中HbCO饱和度。

（1）原理：

双波长吸光度比值法：

CO中毒的检血中同时含有HbO2、HbCO、MetHb和Hb的血，用连二亚硫酸钠使之还原后，血样中只含有HbCO和Hb两个组分，其吸收光谱是HbCO和Hb两者吸收光谱的加和。

因555nm是Hb的最大吸收波长，538nm是HbCO的最大吸收波长之一，所以，随着血中HbCO饱和度的增高，555nm处的吸光度减小，而538nm处的吸光度增大，538nm处的吸光度与555nm处的吸光度之比值A538／A555也随着HbCO饱和度增高而增大，且其间也有近似直线的关系。

故可用下式计算血中HbCO饱和度。

用下式表示。

（A538/A555）X－（A538/A555）0

（A538/A555）100－（A538/A555）0

HbCO（％）＝ 

×

100％

上式中括号外的下角标，X表示未知HbCO饱和度的血样，0与100分别表示HbCO饱和度为0％和100％的血样。

先将非吸烟者的血样用0.1％碳酸钠溶液稀释约200倍，加入少许连二亚硫酸钠（约0.1％）后，放置15min。

使HbO2还原，在538nm和555nm处测定吸光度，计算得HbCO饱和度为0％的比值。

再将此溶液通入一氧化碳气体使Hb全部转变为HbCO，在相同两波长处测定吸光度，并计算出HbCO饱和度为100％的比值。

检血也按上述方法稀释并加入还原剂，同样波长处测定吸光度，得出比值。

将所得三个比值代入上式即可求出未知血样的HbCO饱和度。

此方法对HbCO饱和度较高的检血有较好的重现性，但不适合测定HbCO饱和度低的检血。

方法对检血的稀释不要求很精确；

HbCO饱和度为0％和100％的比值一次测定后，只要条件不改变，不必每次都测。

通常（A538／A555）0的值为0.775，（A538／A555）100的值为1.233。

实验四 

酒精的检测

熟悉对含酒精检材的采取保存方法，掌握酒精的常用鉴别试验。

了解气相色谱理论和设备；

初步熟悉应用气相色谱进行定性、定量分析的方法。

一、检材的采取保存和分离

1．乙醇中毒可取血、尿、唾液、胃内容物及呼出气为检材，其中血液为首选检材，此外还可采脑、肺、肝、肾等脏器为检材。

采取血液以周围静脉血（股静脉）为宜。

2．含酒精的检材应及时检测，如不能及时检测，应放置冰箱内保存。

盛装检材的容器在保存检材时应装满不要留有空间，并进行密封以避免酒精挥发损失。

3．对所有生物检材中含有的酒精可采用蒸馏法进行分离，对血、尿等液体性质检材亦可直接取样进行微量扩散和气相色谱分析，胃内容物可将其离心后取上清液直接做分析测定。

二、酒精的颜色反应

1．碘仿反应

碘与碱作用生成次碘酸盐，能将乙醇氧化成乙醛，乙醛与碘作用生成三碘乙醛，再与碱作用，生成黄色碘仿。

取溜液2—5毫升，放入试管内，加10％氢氧化钠溶液数滴混合。

滴加碘化碘钾试剂至溶液呈浅黄色。

在60℃水浴上加热，如颜色消退，再加碘液至黄色，多余的碘液可加几滴氢氧化钠除去，静置后如馏液中含有乙醇，即有黄色结晶沉淀析出，置显微镜下观察结晶呈六角形。

【注】本反应并非乙醇所特有，乙醛、丙酮、甲基酮及能被次碘酸盐氧化为乙醛，或甲基酮的醇均能产生同样反应。

2．微量扩散法――预试验

重铬酸钾与乙醇或其他还原性物质（醛类和其它低级分子）作用时，被还原成Cr3＋，颜色由橙黄色转为兰绿色。

在扩散皿的内槽中放置重铬酸钾－硫酸试剂1毫升，外槽一侧加饱和碳酸钠1毫升，另一侧加入检血1毫升，盖上盒盖后，倾斜旋转使检血和碳酸钠溶液接触混合，放置一小时，观察结果，如检材内含有乙醇，以其含量大小呈现黄绿至蓝色变化，见下表1血中乙醇不同含量的颜色变化；

表2血液中乙醇浓度与酩酊度。

表1 

血中乙醇不同含量的颜色变化

含乙醇克数％

重铬酸钾硫酸识别颜色

结果

0.00

鲜黄色

0.08

黄－黄绿

＋

0.15

黄绿－绿

＋＋

0.23

绿－深绿

＋＋＋

0.30

深绿－蓝色

表2 

血液中乙醇浓度与酩酊度

血中乙醇含量％

0－0.05

0.05－0.15

0.15－0.30

0.25－0.40

0.35－0.50

0.50

酩酊度

初出现异常状态

行动尚较正常，但已欣快多话

正常行动较难，思考力减退

行动已困难但意识仍较清楚

昏睡

致死

三、气相色谱分析

【色谱条件】

色谱柱：

4mm×

2m不锈钢柱，内装10％PEG20M，ChromosorbW（60～80目）

2m不锈钢柱，内装GDX－201W（60～80目）

FID检测器和气化室温度：

150℃；

柱温：

lOO℃。

载气（N2）流速：

45ml／min；

H2：

35ml／min；

空气：

300ml／min。

【操作】

在10ml左右的玻璃瓶（顶空瓶）中加入0.5ml检材（血或尿），0.5ml内标液，约1g硫酸铵，加盖聚四氟乙烯薄膜和胶塞，用铝盖封好，摇匀，置于60℃水浴中加热15～20分钟，用事先预热好的注射器抽取200µ

l气体，迅速注入气相色谱仪，记录乙醇和正丙醇的峰面积。

再取0．5m1正常血（或尿）加入顶空瓶中，加入0．5ml标准液（含乙醇和正丙醇各为0．5mg／m1）和约1g的硫酸铵，加盖聚四氟乙烯薄膜和胶塞，加铝盖密封，其余操作和检材相同，求出乙醇和正丙醇的峰面积比（K），重复操作三次取平均值，检材中乙醇的含量按下式计算：

检材中乙醇的含量（mg／m1）＝A乙醇/A正丙醇×

1/K×

C乙醇

其中

A乙醇：

检材中乙醇所产生的色谱峰面积。

A正丙醇：

检材中正丙醇内标产生的色谱面积。

附：

试剂

1．碘化碘钾试剂：

2克碘化钾与1克碘溶于50毫升水中。

2．重铬酸钾一硫酸试剂：

重铬酸钾0.37克，溶于15毫升水中，然后缓慢加入2毫升浓硫酸，边滴加，边搅动，放冷后备用。

实验五 

合成药物的检测

巴比妥类药物的检测

熟悉巴比妥类药物的理化性质，掌握由检材中提取的分离原理和常规的分析方法，通过实验熟悉薄层色谱在毒物分析工作中的使用技术。

巴比妥类药物中毒以胃内容物、肠内容物、胃液以及血、尿或肝、脑等脏器为检材。

二、检材的分离提取

巴比妥类安眠药属于弱酸性有机化合物，在酸性条件下形成巴比妥类衍生物能溶于大部分有机溶剂。

在碱性条件下形成巴比妥盐类物质溶于水而不溶于有机溶剂。

根据这一化学性质，在对检材的分离提取过程中，应首先酸化检材使形成盐的巴比妥类药物转化成巴比妥酸类衍生物，再用有机溶剂进行提取。

2．分离提取

取尿液50毫升，加10％硫酸酸化至PH5－6后，置分液漏斗内，用氯仿溶剂50毫升，30毫升，20毫升分别提取三次，合并提液，用10克无水硫酸钠脱水，加少量活性炭脱色（如溶液清亮也可不脱色），提取液置蒸发皿中，在水浴上将溶剂挥干，剩残渣供检测使用。

3．尸体内脏的快速提取法：

取尸体脏器及干性胃内容物50--100克，捣碎后加入10％硫酸酸化，加入无水硫酸钠将检材研磨至粉渣状，置三角烧瓶中用氯仿或乙醚分三次浸提，合并提取液，再加无水硫酸钠脱水，加活性炭脱色，将提取液置蒸发皿中，在水浴上将溶剂挥干，剩残渣供检测使用。

三、颜色反应

1．硝酸钴－氨液反应：

原理：

巴比妥类安眠药的分子结构中有环脲酰－C＝NH基团，在碱性条件下，可与钴盐发生显色反应，生产紫红色络合物。

操作方法：

将检材提得的残渣加入少量乙醚溶解后滴加在滤纸上，再加1％硝酸钴无水酒精液数滴，置于浓氨水瓶口熏以氨气，如呈现紫红色表示有巴比妥酸的存在。

若滤纸于1－2分钟内呈黄色，边缘有时呈青绿色，则为阴性。

本反应必须在无水条件下进行，所用一切容器要干燥，应同时作阴性及阳性对照。

2．硫酸铜一吡啶反应

O 

O

巴比妥分子中含有一C—NH—C—NH基团，可与铜盐作用，发生类似缩二脲的反应，生成有色络合物，含氧巴比妥呈红色，含硫巴比妥呈绿色。

将检材提取残渣加入少量吡啶氯仿液溶解，再加硫酸铜吡啶液2滴，如含巴比妥类安眠药即显红紫色，硫喷妥呈显绿色。

注意：

此反应也可于滤纸上进行，显色剂硫酸铜吡啶勿用过量，否则试剂本身颜色会掩盖反应结果。

灵敏度100一200微克。

，

四、薄层色谱法 

1．薄层板

硅胶G板或硅胶CMC板 

2．展开

（1）苯：

丙酮（8：

2）展开剂

（2）苯：

二氧六环：

二乙胺（7：

2：

1）展开剂

（3）氯仿：

丙酮（9：

（1）硫酸汞－二苯卡巴腙试剂

（2）硝酸银－二苯卡巴腙显色剂 

操作方法：

当层析后取出薄层板晾干，喷硫酸汞液或硝酸银丙酮液，此时巴比妥类药物显白色斑点。

再喷以0.2％二苯卡巴腙氯仿液薄层背景即呈蓝紫色并慢慢褪去，杂质是不规则的蓝色斑点，而巴比妥类药物则呈现紫色斑点。

4．测量计算判断结果

五、紫外分光光度法的定量检测

（一）原理：

一定浓度范围内（每毫升含药物2—30微克）的巴比妥类药物在PHl4和PHl0溶液中于紫外波长260nm处相互吸收差值成正比。

根据检液在260nm处的吸收差值，同已知药物的标准曲线对照，得知检液浓度，从而计算出药物含量。

（二）操作方法

1．标准曲线

（1）标准溶液的配制及紫外吸收测定

取每毫升含1毫克速可眠等巴比妥类药物的甲醇液1.5毫升于50毫升烧杯中，置60℃水浴或自然挥去溶剂。

用少许0．45N氢氧化钠溶液溶解，倒入25毫升容量瓶中，加0．45N氢氧化钠至刻度，得每毫升含60微克巴比妥药物PHl4的标准液。

取六个10毫升刻度试管，依次加入每毫升含60微克巴比妥药物PHl4标准液1.0、2.0、3.0、4