细胞培养技术教研室修改版Word文档下载推荐.docx
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12H2O，KH2PO4，结晶紫，甲醛，无水酒精等
二、实验内容
（一）配清洁液
成分
量
重铬酸钾溶于水中有时不能完全溶解，预先用2000ml热水助其溶解，再加入足量自来水，最后缓慢加浓硫酸。
浓硫酸
自来水
20000ml
切记：
浓硫酸要缓慢加入，且边加边搅拌！
（二）其他培养用液的配制及分工（学生分为三大组）
1、RPMI-1640培养液
成分
RPMI-1640
2袋
搅拌溶解后过滤除菌，塞好大翻，并注明名称配制日期和组别。
每实验室20瓶。
每小组1瓶。
NaHCO3
7.4g
2000ml大酒精瓶1个；
无菌100ml盐水瓶20个。
2、无菌分装5.6％NaHCO3
无菌5.6％NaHCO3
50ml
按照3ml/瓶分装，每室16瓶，每小组1瓶。
无菌操作。
无菌青霉素瓶20个；
无菌5ml吸管1支。
3、无菌分装1％胰酶（技术室提供）
按照1ml/瓶分装，每室15瓶。
无菌1％胰酶
20ml
按照1ml/瓶分装，每室16瓶，每小组1瓶。
无菌青霉素瓶15个；
无菌1ml吸管1支。
4、Hanks＇液（母液由技术室提供）
A液
100
按照1：
1：
18比例进行配比混匀，总量为2000ml，过滤除菌，然后按照每瓶500ml分装，并注明名称配制日期，每室4瓶。
B液
1800
无菌10ml吸管2支，1000ml量筒1只，1000ml大酒精瓶1个，无菌500ml盐水瓶4个。
5、双抗
青霉素（80万U）
配制双抗终浓度为：
16000单位/ml；
链霉素10000μg/ml。
按5ml/瓶分装，瓶口贴好胶布作好标记，胶布上注明配制日期和组别。
每室20瓶。
链霉素（1g）
无菌Hanks＇液
100ml
无菌5ml吸管1支，无菌青霉素瓶20个。
6、血清的灭活和分装
无菌小牛血清
150ml
总量为150ml，56℃的水浴锅中进行热灭活，灭活时间30min，后按照每瓶5ml分装，并在瓶口处贴好胶布作好标记，胶布上写好日期和组别。
每实验室30瓶。
每小组2瓶。
无菌5ml吸管1支，无菌青霉素瓶30个。
7、1×
PBS配制
NaCl
8.0g
总量为1000ml，每瓶按70ml分装，用硫酸纸包好瓶口，待高压灭菌后第二天派人再换大翻保存。
每实验室15瓶。
KCl
0.2g
Na2HPO4·
12H2O
2.9g
KH2PO4
去离子水
至1000ml
标好1000ml刻度的酒精瓶或1000ml容量瓶1个，无菌100ml盐水瓶15个。
8、染色液
结晶紫
0.5g
溶解、混匀，滤纸过滤
甲醛
10ml
0.8g
无水乙醇
加至100ml
250ml量筒1只，500ml盐水瓶1个。
9、分装VTP（由技术室提供）
无菌VTP
70ml
无菌操作按4ml/瓶分装，并注明日期和组别。
无菌5ml吸管1支，无菌青霉素瓶15个。
☆未特别说明上述试剂均放置2～8℃冰箱保存备用。
☆每次实验除菌过滤的顺序：
三个班的RPMI-1640先滤，然后再滤Hank＇s液。
☆每组完成后统一收好，下次再分配到各小组。
备注：
常规实验室用品注意更换，包括酒精缸和酒精灯，棉球，一次性台布等。
实验二鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养
一、实验目的
掌握鸡胚原代成纤维细胞的制备及培养的基本步骤；
掌握活细胞的显微镜下观察；
熟悉病毒在细胞内增殖的基本判断方法。
二、实验原理
离体动物组织通过温和的手段（机械和酶消化）形成单个细胞后，在适宜的外界环境中，包括温度、酸碱度和气相环境，并给予充足合适的营养条件，能生存、生长形成单层细胞，这种原代培养的细胞具有原来体内所具备的基本特性，比如肌肉细胞的收缩功能；
上皮细胞的分泌功能等。
通常把这种从体内取出组织细胞开始培养到第一次进行传代之前的这一段时期称为原（初）代培养。
原代细胞最接近体内细胞的特性，因而对外界环境的变化也最敏感，因此比较适合病毒的增殖，药物的作用机制等的研究。
三、实验材料（按2人/组的量发放）
9～11日龄鸡胚1只，碘酒和酒精棉球若干，无菌器械一套，无菌无毒平皿2只；
5或10ml吸管4支，1或5ml吸管1支，长青霉素瓶2只（带塞）；
Hanks’液1瓶，RPMI-16401瓶，双抗1瓶（5ml）；
胰蛋白酶1瓶（1ml），血清1瓶（5ml），5.6％NaHCO31瓶
四、操作步骤
1、碘酒和酒精棉球分别拭擦鸡胚气室外卵壳；
2、取出两只无菌平皿，并标记①和②，待用。
3、在RPMI-1640和Hank’s液中分别无菌操作以1％的量加入双抗，吸出10～15mlHank’s液至无菌平皿中备用；
4、大镊子轻敲卵壳顶部然后小心去掉气室外卵壳；
5、消毒镊子后小心撕破卵膜，两人互相配合取出鸡胚置于盛有Hank’s液的平皿①中，小心去头、内脏、爪和粘液及血球，洗涤后置于盛有Hank’s液的平皿②中，再充分洗涤；
6、取出洗净的组织块置于大青霉素瓶中，在火焰附近用无菌眼科剪刀将其剪成约0.5～1mm3的小块（约250次），此时体积约0.5ml；
用Hanks’液洗涤两次。
7、加入1ml1％胰蛋白酶，用适量Hanks’液调整使其工作浓度为0.25％，5.6％NaHCO3调节pH至约7.3～8.0（肉眼观为肉红色，1ml吸管约3滴）盖上瓶塞，写好标记；
8、将上述细胞瓶置于37℃水浴中，开始计时，约15～30min，其间缓慢摇匀以充分消化。
消化停止的标志是：
轻轻晃动后细胞悬起，呈云雾状，很快聚集成团，表明细胞活力好。
9、消化结束后，取出，稍沉淀，缓慢吸出上清，用Hank’s液小心洗涤2～3次，可以尽量减少胰蛋白酶的残留量，然后加入RPMI-1640液约5ml，用小头吸管充分吹打，使细胞充分分散。
吸上清；
重复操作3～4次，收集细胞上清。
10、
（1）经四层无菌纱布或200目不锈钢钢网过滤后收集滤液，细胞计数，并调节细胞密度大约1×
106/ml；
（2）上述细胞悬液自然沉降，待未消化彻底的组织块沉入瓶底后，收集上清，并加入足量的小牛血清（终浓度为10％）。
11、将上述制备好的细胞悬液平均分配到两个细胞瓶中，5ml/瓶，塞好螺口塞，注意生长面朝下，在非生长面上做好标记，包括细胞名称，接种培养时间，组别及姓名等。
12、细胞统一置于本室指定的37℃，5％CO2孵箱中培养。
13、24h后观察细胞生长情况，如果细胞长成单层，细胞界限清晰，大多数细胞为梭形并贴壁，布满细胞瓶的生长面，说明细胞生长状态良好。
实验三滤泡性口炎病毒（VSV）的增殖（纯培养）
掌握病毒在细胞内增殖的基本判断方法。
原代细胞最接近体内细胞的特性，因而对外界环境的变化也最敏感，因此比较适合病毒的增殖，药物的作用机制等研究。
病毒在细胞内增殖的检测指标有细胞变化、红细胞吸附、细胞代谢改变、干扰现象、免疫荧光法检测等。
由病毒引起的细胞病变称细胞病变效应（cytopathiceffect，CPE），常见的细胞形态学变化为细胞变圆、聚集、融合、裂解或脱落等。
200TCID50的VSV病毒0.1ml，5ml和1ml吸管各一支，维持液（含3％小牛血清的RPMI-1640液）。
1、上述原代成纤维细胞培养24h后，一旦细胞完全贴壁生长良好后，则轻弃培养上清，换上细胞维持液（含3％小牛血清的RPMI-1640），接种200TCID50的VSV0.1ml，在细胞瓶上标记换液时间，接种病毒量。
正常对照也按照上述方法换上维持液。
2、再继续培养，每间隔12～24h观察，直至全部细胞出现明显的病变，显微镜观察细胞脱落，圆缩，则可停止培养。
3、收集全班的病毒培养物于100ml无菌盐水瓶中，写好标记，置于－20℃冰箱充分冷冻后再置于4℃冰箱或室温下解冻，该过程称为冻融。
反复冻融三次后，细胞膜破坏，释放出胞内病毒。
低速离心，弃细胞碎片沉渣，收集上清即为病毒悬液。
留样测定病毒的TCID50。
五、实验结果
1、鸡胚原代成纤维细胞的显微镜下观察。
2、VSV攻击鸡胚原代成纤维细胞后，细胞病变效应（CPE）的观察。
3、病毒收获的方法。
实验四Hep-2细胞的传代培养
掌握细胞传代培养的方法及其应用。
体外培养的细胞由于细胞游出数量增加，单层培养细胞相互汇合，整个瓶底逐渐被细胞覆盖。
这时需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞继续生长。
细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代；
进行一次分离再培养称之为传一代。
细胞培养传代根据不同细胞采取不同的方法。
贴壁生长的细胞用消化法传代；
部分贴壁生长的细胞用直接吹打即可传代；
悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。
三、实验材料
传代细胞：
人喉癌细胞（Hep-2）（每两人一瓶）；
所需溶液：
PBS、VTP、RPMI-1640液、血清；
其他：
5ml吸管、10ml吸管、细胞瓶。
1、将已长成单层的细胞生长面朝上轻轻倒掉培养液，用PBS轻轻洗涤两次，注意吸管尖头不要伸到细胞瓶中。
2、用上述吸管吸取1mlVTP加入细胞瓶中，铺满整个细胞生长面即可；
室温或手握住消化，约3～5min。
显微镜下观察细胞胞质回缩、细胞间隙增大后，即可停止消化。
尽可能弃尽消化液，继续利用残余的消化液消化，直至细胞大部分易在外力作用下从细胞瓶表面脱落下来为止。
3、加入少量RPMI-1640液于细胞瓶中，用小头吸管吹打瓶壁细胞以及脱落细胞使细胞充分均匀，吹打时动作要轻柔不要用力过猛，尽可能不要出现泡沫。
4、计数：
用吸管吹打细胞悬液，取少许细胞悬液与等量0.04％台盼兰混匀，在计数板上盖玻片的一侧加该细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。
计算细胞浓度。
5、用RPMI-1640制备成1×
106/ml浓度的细胞悬液，并按10％的量加入小牛血清。
6、将上述细胞悬液分装5ml到新细胞瓶中，塞好塞子，标记后送培养箱培养，24h后观察。
显微镜下观察Hep-2细胞生长良好，已长满单层，细胞呈不规则多边形，透光性良好。
实验五VSVTCID50滴定
掌握病毒TCID50滴定的基本原理和计算方法以及应用。
多数病毒感染体外培养的细胞后，常引起细胞形态学改变，如细胞团缩、裂解和细胞肿大等，这种改变称为病毒致病变效应（cytopathiceffect，CPE），可以直接通过显微镜观察，亦可通过染色得以识别和判断。
CPE的程度可间接反映病毒的毒力，因此利用这种特征可以用来测定病毒的毒力。
即能在半数细胞培养板孔或试管内引起细胞发生病变所需的病毒量定义为病毒的50％组织细胞感染指数（50％tissuecultureinfectiousdose，TCID50）。
测定时，首先在微量细胞板上培养敏感细胞，待细胞贴壁形成单层，弃上清。
将待测病毒用维持液做10倍稀释后加入细胞单层，逐日观察，直至病毒产生的CPE不再进展为止。
具体时间根据病毒的增殖特点而定，如肠道病毒增殖迅速，一般48h即可；
VSV增殖也较快，因此，48h～72h也可以观察、染色、计算。
细胞：
Hep-2细胞株（实验四传代所得），自备/组。
病毒：
水泡性口炎病毒（vesicularstomatitisvirus，VSV），自备/组。
试剂：
维持液，PBS，VTP等自备/组。
材料：
细胞板（1块/组），tip头（2盒/排），微量移液器，5ml或10ml吸管（2支/组），青霉素瓶带塞（10个/排），酒精缸，镊子（2个/排）
1、制备细胞：
方法同实验四。
一瓶细胞消化后加入营养液制成所需细胞悬液，浓度约为1×
106/ml。
用微量移液器将细胞悬液加入40孔板微孔中，每孔100μl，37℃，5%CO2孵育箱培养24h，形成单层后，做病毒滴定用。
2、50%组织细胞感染量（TCID50）测定
（1）稀释病毒液：
取无菌青霉素瓶9支，各管分别加3%小牛血清的维持液2.7ml，然后向第一管加VSV病毒液0.3ml，反复吹吸混合三次，从第一管内吸液0.3ml加入第二管内，反复混合三次，从第二管内吸液0.3ml加入第三管内，反复混合三次，依此类推将待测的病毒液做连续10倍稀释，使病毒稀释为10-1，10-2，10-3…10-9。
（2）病毒接种：
将长好单层细胞的培养板各孔细胞液全部倾弃，用微量移液器把各稀释度的VSV病毒从低浓度开始依次加入各微孔中，每稀释度平行加2孔，每孔100μl。
细胞对照孔不加病毒液，只加维持液。
置37℃，5%CO2孵育箱中孵育。
（3）结果观察：
于孵育后18、24、36、48、72h在倒置显微镜下观察CPE，病毒可引起细胞圆缩、堆聚及脱落现象。
“-”表示细胞正常；
“+”25%细胞产生病变、圆缩、破碎脱落；
“2+”50%细胞产生病变；
“3+”75%细胞产生病变；
“4+”100%细胞产生病变。
（实验时，观察24h~48h即可染色计算）
3、计算TCID50参见下表
表VSV在Hep-2细胞上的TCID50结果记录
病毒稀释度
病变孔数/接种孔数
累积数（孔）
病变细胞孔
有病变↑
无病变↓
比例
百分比（%）
10-3
8/8
10
10/10
10-4
2/8
2
6
25
10-5
0/8
14
0/14
10-6
22
0/22
10-7
30
0/30
10-8
38
0/38
按表中，10-3稀释的病变高于50%；
10-4稀释的病变低于50%；
50%病变分布于10-3与10-4之间，计算公式如下：
高于50%病变率-（50%）100-50
距离比例=-×
lg稀释倍数=-×
lg10
高于50%的病变率-低于50%的病变率100-25
=-0.67
lgTCID50=高于50%病变的低稀释度对数+距离比=-3+（-0.67）=-3.67
即1个TCID50=10-3.67，查0.67的反对数为4.68，即病毒做4.68×
103倍稀释时取0.1ml接种细胞，即可使50%细胞产生病变。
附录：
如何计算200个TCID50？
4.38×
103÷
200=23.4，将病毒作23.4倍稀释时即得200个TCID50。
五、计算
请计算提供的病毒的TCID50。
六、写实验报告并计算给定的病毒的TCID50。
实验六干扰素活性（效价）的测定
（注：
此实验所需的细胞为实验四时传代培养所得）
掌握微量细胞病变抑制法测定干扰素效价的基本步骤以及结果分析。
熟悉常用生物制品生物学活性测定的实际意义。
了解影响结果的常见因素。
二、基本原理
病毒或其他干扰素诱生剂作用于巨噬细胞、T细胞或成纤维细胞后，由细胞基因自身编码产生的具有抗病毒、抗肿瘤和调节免疫功能的一类小分子糖肽，统称为干扰素。
干扰素发挥重要的酶的特性而抑制病毒DNA和蛋白质的合成，从而抑制病毒在细胞内的增殖。
因此具有间接的广谱抗病毒作用。
为了进一步确定人工方法制备的干扰素的生物学活性，需进行体外抗病毒试验测定，即干扰素效价的测定。
干扰素效价一般定义为：
凡1ml干扰素标本的最高稀释度仍能保护半数细胞（50％）免受“攻击病毒”损害者，该稀释度的倒数即为干扰素的效价，即单位/毫升。
三、测定方法
测定干扰素效价的方法有多种，最常用的是“细胞病变抑制法”（MethodofCytopathiceffectinhibitionassay，简称CPE法）。
此法的主要优点是操作简便，易于掌握，结果可靠，故已成为目前各实验室的常规。
亦可用“放射化学测定法”、“染料摄入测定法”。
本次实验也主要采用前法。
下面就此法的发展做一简要阐述。
1、全量细胞病变抑制测定法
优点：
操作简单、易于掌握、结果可靠
缺点：
大量测定时，耗费细胞量太大，清洗工作量大，判断结果不能完全排出主观因素。
2、常规微量细胞病变抑制测定法
此法是在“全量法”基础上加以改良的一种方法，它的最大优点是：
需用细胞量少，适于大量干扰素标本检测。
其主要缺点是：
判断结果不能完全排除主观因素。
具体操作形式有：
先使细胞培养24～48h形成单层后，再加入不同稀释度的干扰素孵育24h，弃去，再加入100TCID50的攻击病毒，继续孵育直至病毒对照出现完全病变为止。
主要特点是干扰素稀释标本和细胞同时加，优点是细胞对攻击病毒较敏感，且省时。
两种方法滴定的干扰素效价无明显差别。
3、微量快速检测法（一步快速法）
本法的特点是干扰素（不同稀释倍数）、细胞（一定浓度）和病毒（一定量）三者同时加入。
因为干扰素诱导细胞形成“抗病毒状态”要先于病毒的复制与成熟，即VSV的复制周期为7h，而干扰素作用于靶细胞后约1h即形成抗病毒状态。
但一步快速法的敏感性随病毒攻击剂量的提高而迅速下降。
因此常规微量法比微量快速法稳定。
四、材料准备
待测标本：
为了除去非干扰素抑制物，待测标本应作
（1）离心处理；
（2）pH处理（此步学生不需做）。
可分装为20～40μl/份/2人。
测定细胞：
应根据“种属特异性”选择测定细胞。
本实验室选用生长良好的一日龄或两日龄人羊膜单层细胞传代培养物（WISH）或人喉癌上皮细胞（Hep-2），本次实验选取后者。
攻击病毒：
选用具有“同步致病作用”的VSV（VesicularStomatitisVirus）作为“攻击病毒”。
使用前，应先在原代鸡胚成纤维细胞培养物（约400万细胞/毫升）中传代增殖及滴定病毒的空斑形成单位（PFU）或在人羊膜单层细胞上滴定其TCID50。
病毒的攻击量一般可选100~300个TCID50（一般不得小于10个TCID50，不得大于500个TCID50）。
胰蛋白酶混合消化液：
VTP，其胰蛋白酶和Versene（EDTA）的最终浓度分别为0.05和0.02。
用VTP比单用胰蛋白酶作消化液对细胞的损伤要小些。
营养培养基：
配方是
（1）RPMI-1640液；
（2）10%灭活小牛血清；
（3）双抗。
最后用NaHCO3调pH至7.2～7.4。
微量细胞培养板：
无菌40孔进口板1块/组。
CO2培养装置：
采用CO2孵箱（CO2为5%，空气为95%）。
其他器材：
5ml吸管2只/组，1ml吸管1只/组，tip头1盒/桌。
五、操作步骤
1、稀释待检干扰素（在微量滴定板上直接进行）
（1）配制10％小牛血清的营养液5ml，除第一列外，在第一、二排的第2～10孔各加100μl营养液；
（2）将待检干扰素进行400倍稀释后，分别取100μL于第一孔和第二孔，将第二孔充分吹吸3次混匀，吸出100μl于第三孔，重复上述操作，直到第8孔，吹吸后弃去100μl。
因此依据倍倍稀释原则对干扰素进行系列稀释，各孔的稀释倍数如下表所列。
第九孔为细胞对照孔，不加干扰素保护也不加病毒攻击；
第十孔为病毒对照，不加干扰素保护加病毒攻击。
第二排按照同样方法进行，即每个稀释度重复两孔。
每孔含量为100μl。
管号
1
3
4
5
7
8
9（细胞对照孔）
10（病毒对照）
营养液
（μL）
干扰素
上一孔的100
上一孔的100，
弃去100
干扰素稀释倍数
16
32
64
128
细胞
每孔均为100μl
2、微量单层细胞培养
（1）按常规方法将预先培养好的细胞单层用VTP消化下来；
（2）用营养培养基将细胞制成40万个细胞/毫升的悬液；
（3）用加样器向微量细胞培养板每孔中加入100μL细胞悬液（加时不断摇匀瓶中的细胞）；
（4）置CO2孵箱中培养1d。
3、病毒攻击
观察到细胞单层良好时，将各孔内含干扰的培养液倒掉，于每孔中加入100TCID50的攻击病毒VSV100μl，该病毒用3％维持液稀释，细胞对照组加入等量的维持液。
本组加入24h引起75～100%细胞病变的VSV100μl。
置37℃孵育24～40h。
4、观察结果
（1）可直接倒置显微镜观察。
在规定的时间内首先观察“细胞对照组”和“病毒对照组”，若病毒对照组各孔中的细胞出现75~100％的明显病变和死亡，而细胞对照组中的细胞仍完全生长良好，则表明对照系统完全合格，即可作全面观察。
否则弃去重做。
每孔中出现的细胞病变（CPE）程度，用＋表示。
一般病毒对照孔，出现3＋或4＋，干扰素保护孔CPE不再进展，则可终止反应，并染色。
（2）结晶紫染色：
将上述反应板取出，弃去孔内液体于消毒液中，每孔加入1滴染色液，3～5min后，弃去，洗净孔内残余液体，控干即可记录结果。
细胞着色的深浅可以直观反应CPE出现的程度，一般＋＋＋＋时板孔内几乎无可见的细胞贴壁层，无CPE时则板孔内细胞贴壁层完整。
六、结果判断与计算分析
1、效价单位：
效价以单位/毫升表示
一般判定法：
凡1ml干扰素标本的最高稀释度仍能保护半数细胞（50％）免受“攻击病毒”损害者，该稀释度的倒数即为干扰素的单位/毫升。
如某干扰素稀释到1:
8000时仍能保护半数细胞（50％）免受“攻击病毒”的损害，即出现＋＋的稀释度，则该干扰素的效价即为8000单位/毫升。
特殊计算法（通常按照Reed-Muench法计算）
第一步计算保护百分比，见下表
A项
B项
C项
D项
E项
F项
G项
干扰素稀释度
病变细胞
正
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