新版GMP培养基适用性检查验证报告文档格式.docx
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可能性
P
可检测
D
风险优先级RPN=S×
P×
D
1
低
高
RPN≤7
可以接受，无需采取措施
2
中
16≥RPN≥8
一定程度上接受，但应按风险优先级
采取措施尽可能降低
3
RPN＞16或严重程度＝4
不能接受，尽快采取措施降低
4
关键
极高
极低
步骤/单元
危害
S
可能原因/
程序失败
现行控制
R
N
需采取措施
培训
验证部分项目出现偏差或漂移
方案培训不到位，方案的执行者不熟悉方案内容
严格执行经批准的验证报告进行培训，并考核合格
18
确认按照批准的方案培训，培训者均熟练掌握所培训内容。
检验过程操作不当
未达到设定标准，验证失败。
未遵循培养基适用性检查检查操作规程，未严格遵循方案规定方法。
制定培养基适用性检查检查操作规程，并对规程及设立的验证方法培训，按规程及方案要求进行操作。
确认培养基适用性检查检查操作规程已制定并批准，确认人员已培训；
确认操作规程适用性。
4.验证前准备
4.1验证人员培训：
验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实施前）对本次验证相关人员进行培训。
培训人员记录见附件1。
4.2将所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
4.3仪器与器具：
恒温培养箱、生化培养箱、高压蒸汽灭菌器、净化工作台、无菌培养皿、无菌移液管。
5.验证内容
5.1测试环境条件要求
所有检查在环境洁净度C级下的局部A级洁净度的单向流空气区域内隔离系统内进行，其全过程严格遵守无菌操作，能防止微生物污染。
5.2计数培养基
5.2.1验证用菌种及培养基：
5.2.1.1来源：
食品药品检验所
5.2.1.2菌落计数用菌种
菌种名称
内控编号
大肠埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC（B）44102]
E-
金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC（B）26003]
S-
枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）[CMCC（B）63501]
B-
白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC（F）98001]
C-
黑曲霉（Aspergillusniger）[CMCC（F）98003]
A-
注：
编号由菌种首字母-传代代数-配制日期组成。
5.2.2培养基及其制备方法：
取市售的脱水培养基，分别按照规定方法进行配制后灌装于洁净的三角烧瓶中，然后加塞灭菌，在实验前加温熔化备用。
培养基名称
培养基批号
配制日期
有效期至
营养琼脂培养基
玫瑰红钠琼脂培养基
营养琼脂对照培养基
玫瑰红钠琼脂对照培养基
5.2.3菌液制备
5.2.3.1接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24小时，取此培养液1ml，加0.9％无菌氯化钠溶液至10ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-6～10-7，使菌数约为50～100cfu/ml，做活菌计数备用。
5.2.3.2接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48小时，取此培养液1ml，加0.9％无菌氯化钠溶液至10ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-6～10-7，使菌数约为50～100cfu/ml，做活菌计数备用。
5.2.3.3接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天的用3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤丝的无菌毛细吸管）至无菌试管中，取1ml加含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液至10ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4～10-6,制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液备用。
5.2.4验证方法：
5.2.4.1试验组：
取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各1ml，分别注入无菌平皿中，立刻倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养48小时，计数、观察菌落情况；
取白色念珠菌、黑曲霉各1ml，分别注入无菌平皿中，立刻倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数、观察菌落情况。
测定结果见附件2。
5.2.4.2对照组：
取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各1ml，分别注入无菌平皿中，立刻倾注营养琼脂对照培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养48小时，计数、观察菌落情况；
取白色念珠菌、黑曲霉各1ml，分别注入无菌平皿中，立刻倾注玫瑰红钠琼脂对照培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数、观察菌落情况。
5.2.4.3菌回收率计算：
;
Jt*试验组的菌回收率（%）=
（试验组平均菌落数/对照组平均菌落数）×
100%`h12
5.2.5判定标准：
菌回收率均应不低于70%，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致。
5.2.6结论：
5.3控制菌培养基适用性检查：
5.3.1验证用菌种：
5.3.1.1来源：
5.3.1.2验证用菌种
5.3.1.3培养基及其制备方法：
取市售的脱水培养基，分别按照规定的方法进行配制后灌装于洁净的三角烧瓶中，然后加塞灭菌。
在实验前加温熔化备用。
胆盐乳糖培养基
MUG培养基
乳糖胆盐发酵培养基
胆盐乳糖对照培养基
MUG对照培养基
乳糖胆盐发酵对照培养基
5.3.2菌液制备：
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液至10ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4～10-6，使细菌数约为500～1000cfu/ml。
5.3.3验证方法：
5.3.3.1促生长能力培养基：
取大肠埃希菌各0.1ml，分别涂布于胆盐乳糖培养基、MUG培养基和乳糖胆盐发酵培养基及其对照培养基上，在30～35℃培养18小时，观察菌落情况。
测定结果见附件3。
5.3.3.2抑制能力培养基：
取金黄色葡萄球菌各0.2ml，分别涂布于胆盐乳糖培养基和乳糖胆盐发酵培养基及其对照培养基上，在30～35℃培养18小时，观察菌落情况。
5.3.3.3指示能力培养基：
取大肠埃希菌各0.2ml，分别涂布于乳糖胆盐发酵培养基及其对照培养基上，在30～35℃培养18小时，观察菌落情况。
5.3.4判定标准：
5.3.4.1促生长能力培养基：
试验培养基与对照培养基生长的菌落大小、形态特征应一致。
5.3.4.2抑制能力培养基：
试验菌均不得生长。
5.3.4.3指示能力培养基：
试验培养基与对照培养基生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应一致。
5.3.5结论：
6.变更和偏差处理：
7.验证结果评定及结论：
试验表明：
7.1计数培养基营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基的菌回收率均不低于70%、菌落形态大小与对照培养基上的菌落均一致；
7.2控制菌检验用培养基的胆盐乳糖培养基、MUG培养基的促生长能力、抑制能力均符合规定；
乳糖胆盐发酵培养基的促生长能力、指示能力均符合规定。
8.再验证周期：
结合本次验证结论，针对本次验证，对下次验证周期规定如下：
8.1发生重大变更或严重偏差，应及时采取措施并进行验证；
8.2验证状态出现较大偏移或出现不良趋势时，应组织分析，采取措施，需要时进行验证；
8.3国家相关微生物限度检查标准修改后需要对本方法重新进行再验证；
8.4原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检验方法应重新验证。
9.会审及批准
会审：
经验证小组会审，再验证结果真实、可靠。
批准：
培养基适用性检查验证结果有效，从年月日起可以使用上述培养基进行检验。
附件1
培训人员记录表
部门
培训人员签名
签到日期
培训师签名
日期
附件2
营养琼脂计数培养基
结果
试验菌
营养琼脂
营养琼脂对照
回收率
菌落观察情况
菌落数
大肠埃希菌
平均
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
结果
玫瑰红钠琼脂
玫瑰红钠琼脂对照
白色念珠菌
黑曲霉
验证结果评定
操作人
日期
复核人
附件3
控制菌检查用培养基
项目
结果
促生长能力
抑制能力
指示能力
——
附件4
偏差处理与变更记录
验证项目名称
验证项目编号
偏差说明：
可能的原因：
偏差分类：
□重大□小
理由：
采取措施：
（如需要另附文件）
结果：
建议（如需要另附文件）
□接受偏差
□不接受偏差
批准人：
日期：
附件5
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